JBRA Assist. Reprod 2006;10(1):7-10
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2006.10.1.02
Fototropismo Espermático, um Parâmetro Válido na Avaliação Seminal?
Sperm Phototropism, a Valid Parameter in Seminal Evaluation?
1Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz, Porto Alegre/RS
2Gestar Centro de Reprodução Humana, Novo Hamburgo/RS
RESUMO
Novos parâmetros de análise e testes laboratoriais são freqüentemente relatados na literatura procurando aumentar o valor clínico da análise seminal. Neste trabalho fizemos uma análise retrospectiva com o objetivo de investigar a possível relação entre o fototropismo positivo apresentado pelos espermatozóides de algumas amostras seminais e os parâmetros seminais usuais. Nossos resultados demonstram que não há qualquer diferença significativa entre amostras seminais com comportamento de fototropismo positivo ou negativo em relação aos valores de concentração, motilidade rápida e direcional, morfologia e sobrevida espermática. Estes dados sugerem que o fototropismo positivo dos espermatozóides não pode ser considerado um parâmetro válido de viabilidade, mas o fenômeno merece atenção em função dos relatos recentes sobre a existência de fotorreceptores no axomena do gameta masculino.
Palavras chave: fototropismo, espermatozóides, análise seminal
ABSTRACT
Semen analysis constitutes the basis for male fertility assessment. New parameters and assays to be included in routine semen analysis are frequently being reported aiming to increase the clinical value of the semen analysis. Here we performed a retrospective study, which aimed to investigate the relationship between semen samples presenting sperm with positive phototropism and standard semen parameters. Our results show that there is no significant difference between semen samples presenting positive or negative phototropism regarding their concentration, motility, longevity and sperm morphology values. This data suggest that positive phototropism may not be a useful sperm viability parameter, but the phenomenon deserves further investigation in light of the recent reports of photoreceptors in sperm axoneme.
Key words: sperm, phototropism, semen analysis
INTRODUÇÃO
A análise seminal continua sendo a base para a avaliação da fertilidade masculina. Este recurso geralmente avalia diversas características fisicoquímicas do plasma seminal e dos espermatozóides seguindo diretrizes ditadas pela Organização Mundial da Saúde (WHO, 1999). Em relação aos espermatozóides, os parâmetros rotineiramente analisados são a concentração, a motilidade e a morfologia, características reconhecidamente passíveis de considerável variação entre diferentes amostras de um mesmo paciente.
A avaliação de sobrevida espermática não é uma avaliação de rotina sendo realizada com a amostra seminal para tratamentos de reproduçaõ assistida para ter-se uma idéia da viabilidade espermática por exemplo pós-inseminação intra uterina ou fertilização in vitro.
O fototropismo positivo dos espermatozóides após algum tempo depositados na câmara de Makler é uma observação relativamente freqüente entre as amostras seminais. Entretanto, em nossa revisão da literatura não encontramos qualquer trabalho científico sobre este fenômeno em relação aos espermatozóides humanos ou de qualquer outra espécie. Por outro lado, o fenômeno da quimiotaxia em espermatozóides humanos foi demonstrado in vitro estando este comportamento relacionado a fatores foliculares capazes de atrair os espermatozódes capacitados (Ralt et al., 1994; Cohen-Dayag et al., 1995).
Em nossa rotina de avaliação seminal, o fototropismo positivo ou não dos espermatozóides passou a ser um parâmetro das análises seminais desde o ano de 2003. O objetivo deste estudo foi a princípio analisar retrospectivamente, a possível correlação do fenômeno do fototropismo positivo ou negativo dos espermatozóides com parâmetros de viabilidade espermática como a motilidade rápida e direcional (motilidade a+b) e a sobrevida 24 horas após capacitação. Para tornar o estudo mais completo, analisamos também a possível relação da presença ou não do fototropismo com os demais parâmetros da análise seminal, concentração, volume, e morfologia espermática.
MATERIAL & MÉTODOS
Amostras seminais
Foram tabulados e analisados os resultados do espermocitograma e da capacitação com dados de sobrevida de 46 pacientes encaminhados à Reprodução Assistida no Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz.
As amostras seminais foram obtidas por masturbação em recipiente estéril, deixadas liquefazer à temperatura ambiente e submetidas à análise seminal utilizando os parâmetros ditados pela Organização Mundial da Saúde (OMS, WHO, 1999), sendo utilizada uma câmara de Makler para as leituras de concentração e motilidade. Após estas análises, a câmara de Makler foi deixada na platina do microscópio com a luz acesa, à temperatura ambiente de aproximadamente 23ºC para avaliação do fototropismo positivo ou não dos espermatozóides. A amostra seminal foi classificada como apresentando fototropismo positivo, quando após dez minutos de permanência na platina do microscópio, 90 a 100 % dos espermatozóides se moviam em direção ao centro da câmara de Makler e não mais aleatoriamente em qualquer direção. A avaliação da morfologia espermática baseou-se nos critérios OMS (WHO, 1999). Uma lâmina de esfregaço seminal foi preparada com uma gota da amostra seminal e após secagem procedeu-se a coloração da lâmina por técnica hematológica de May-Grünwald e Giemsa. Para análise dos dados foram utilizados valores referentes ao percentual de espermatozóides normais nas amostras.
Para capacitação espermática foi utilizado o método do “Swim up” Após liquefação, 1ml de ejaculado foi depositado no fundo de um tubo de centrífuga contendo 2ml de meio de cultura (P1, Irvina Scientific, Santa Monica, USA) pré-aquecido a 37ºC. Passados 60 minutos, a porção sobrenadante turva foi recolhida e depositada em um tubo de centrífuga para centrifugação por 10 minutos a 500g. O sobrenadante foi desprezado e o pellet diluído em outros 2ml do mesmo meio de cultura para lavagem e nova centrifugação. Repetiu-se mais uma vez a lavagem e centrifugação até a diluição final do pellet em 0.5ml do meio de cultura, quando deu-se a avaliação da concentração e motilidade espermática pós-capacitação. O restante do fluido foi deixado a temperatura ambiente por 24 horas para nova avaliação da concentração de espermatozóides móveis. A sobrevida espermática foi medida como a percentagem de espermatozóides móveis em relação ao valor da concentração pós-capacitação.
Para análise estatística foram utilizados os dados relacionados ao volume, concentração, motilidade, morfologia e sobrevida 24 horas após capacitação das amostras classificadas como apresentando fototropismo positivo ou negativo. As médias foram analisadas pelo teste T de duas vias não pareado.
RESULTADOS
Do total de 46 amostras analisadas, 11 apresentaram fototropismo positivo dos espermatozóides, representando aproximadamente 24% das amostras.
Dentre os parâmetros analisados, a concentração espermática total e de espermatozóides rápidos e direcionais (a+b) foram as características que apresentaram maior diferença entre as amostras com fototropismo positivo e negativo. Entretanto, estas diferenças não foram estatisticamente significativas. A Tabela 1 mostra que nenhum dos parâmetros seminais analisados, volume, concentração, motilidade rápida e direcional (a+b), morfologia e sobrevida espermática apresentou diferença estatisticamente significativa entre amostras que apresentaram fototropismo positivo e aquelas com fototropismo negativo dos espermatozóides.
Tabela 1. Médias dos parâmetros seminais de amostras com fototropismo positivo e negativo.
DISCUSSÃO
Nossos resultados mostram que não houve qualquer diferença significativa entre os valores médios de volume, concentração, motilidade, morfologia e sobrevida 24 horas pós-capacitação entre as amostras que apresentaram fototropismo positivo e aquelas com fototropismo negativo.
Os parâmetros rotineiramente analisados em uma amostra seminal são a concentração, a motilidade e a morfologia. Já em 1956 Mac Leod reconheceu que não apenas o número de espermatozóides era importante, mas também a motilidade e a morfologia quando da avaliação do potencial de fertilização de uma amostra seminal (Mac Leod, 1956). Com o passar dos anos ficou claro que não existe uma relação direta entre infertilidade e número de espermatozóides, motilidade e morfologia espermática (Jequier, 2005). Neste sentido, podemos observar uma busca contínua de novos parâmetros para aumentar a precisão das avaliações e preparos seminais no sentido de incrementar o seu potencial de fertilização. Como exemplos recentes podemos citar a avaliação da leucocitospermia seminal (Aziz et al., 2004), a análise do conteúdo de RNA dos espermatozóides (Ostermeier et al., 2005) e a separação eletroforética de espermatozóides viáveis evitando possíveis danos ao DNA causados pelas técnicas rotineiras de preparo e isolamento (Ainsworth et al., 2005).
Sabe-se que a avaliação da motilidade progressiva (a+b) é um parâmetro essencial de classificação espermática, visto que estes espermatozóides estão envolvidos no processo de fertilização normal. Entretanto, uma recente revisão da literatura sobre parâmetros seminais demonstrou que o valor da morfologia espermática é o melhor parâmetro preditivo de subfertilidade (van der Merwe et al., 2005). O movimento direcional central dos espermatozóides, ou fototropismo positivo é um comportamento relatado com certa freqüência pelo embriologista experiente, mas a nosso entender, nunca descrito ou relacionado a qualquer outro parâmetro seminal. Nossos resultados demonstram que este comportamento não está associado, como pensávamos, a outras características espermáticas principalmente a motilidade rápida e direcional e a sobrevida após capacitação.
O fenômeno do fototropismo positivo implicaria na existência de fotorreceptores nos espermatozóides. Achados recentes demonstraram a existência de proteínas fotoreceptoras no axonema do flagelo do espermatozoide. Seu papel no gameta masculino ainda não foi estudado, mas sua presença sugere a possibilidade de sensibilidade à luz por parte dos espermatozóides. (Khanna et al., 2005). Por outro lado, a quimiotaxia espermática evidenciada a partir de estudos in vitro está possivelmente relacionada à capacidade de fertilização do oócito tendo sido demonstrado que o oócito maduro e suas células do cumulus representam a origem das substâncias atrativas aos espermatozóides (Sun et al., 2005).
Por fim, a atração em direção central da câmara de Makler pode estar relacionada à temperatura. A temperatura padrão para análise seminal após deposição da amostra é a temperatura ambiente entre 18 e 24ºC (WHO, 1999). Após algum tempo de exposição à luz, o centro da câmara de Makler deve ficar com uma temperatura mais elevada que suas bordas e esta elevação na temperatura poderia levar a um maior movimento dos espermatozóides e seu direcionamento central. Esta hipótese não foi investigada no presente estudo, não podendo entretanto ser descartada como responsável pelo movimento direcional central dos espermatozóides após um período de exposição à luz do microscópio.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer o auxílio estatístico prestado pela Mestre Ana Paula Jacobus do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.