JBRA Assist. Reprod 2006;10(2):25-28
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2006.10.2.06
RESUMO
A tecnologia de reprodução assistida tornou-se um padrão de tratamento para vários tipos de infertilidade. Conseqüentemente o número de crianças nascidas após um tratamento de reprodução assistida aumentou drasticamente nos últimos anos no mundo todo. Como resultado disso, pesquisadores passaram a voltar sua atenção para os potenciais riscos à saúde e ao desenvolvimento do embrião quando são utilizadas as técnicas de ART. Em adição aos riscos já bem estabelecidos de gestação múltipla, vários estudos recentes mostraram uma ligação entre o uso das técnicas de reprodução assistida com raras desordens de impressão genômica incluindo as síndromes de Beckwith- Wiedemann, Prader-Willi e Angelman. Nesse estudo revisamos alguns mecanismos moleculares de impressão genômica, considerando como o tratamento poderia influenciar na impressão genômica de gametas e embriões.
Palavras Chave: imprinting genômico, doenças genéticas, reprodução assistida
ABSTRACT
The technology of assisted reproduction is a well established treatment for infertility. Consequently the number of children born after a treatment of assisted reproduction increased drastically in the last years in the whole world. As a result of that, researchers started to evaluate the potentials risks to the health and the development of the embryo when the techniques of ART are already used. In addition to the known risks of multiple gestation, several recent studies have shown a connection among the use of the reproduction techniques attended with rare disorders of genomic impression including the syndromes of Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi and Angelman. In this study we revised some molecular mechanisms of genomic impression, considering as the treatment could influence the genomic impression of gametes and embryos.
Key Words: genomic imprinting / genetic diseases / assisted reporduction
INTRODUÇÃO
Até meados dos anos 1980 acreditava-se que cada cópia de cada cromossomo ou gene autossômico era funcionalmente equivalente, independente do genitor do qual ele era derivado. Entretanto, através de experimentos realizados com camundongos e de exemplos de doenças genéticas humanas sabemos que a contribuição funcional desses cromossomos e genes não é equivalente. A atividade funcional de alguns genes ou de regiões cromossômicas é desigual e depende se foram herdados do pai ou da mãe. A este fenômeno damos o nome de impressão genômica e a atividade ou o silenciamento de um gene ou região cromossômica acontece durante a gametogênese.
Quando o padrão de impressão genômica é interrompido, os fenótipos observados em humanos e camundongos são geralmente associados com anormalidades no desenvolvimento, crescimento e comportamento do feto, demonstrando a importância de um ambiente intrauterino adequando para o desenvolvimento normal do embrião.
IMPRESSÃO GENÔMICA E SUAS DIFERENÇAS PARENTAIS
O mecanismo de impressão genômica não é exclusivo da classe dos mamíferos, sendo observado também em fungos, nematódios, insetos e protozoários, que apresentam elegantes processos de marcação genética, que resultam na expressão diferenciada de genes. A impressão genômica é definida como a expressão diferencial de um gene ou de uma região cromossômica de acordo com sua origem parental de herança. É um fenômeno epigenético sendo independente da seqüência de DNA, contudo dependente de fatores que regulam a atividade do DNA. Esses fatores incluem grupos metil ligados ao DNA, que são determinados durante a gametogênese e servem para distinguir os alelos parentais em células somáticas pós-fertilização. Ambos os alelos paternos e maternos estão presentes nas células somáticas, mas quando um alelo é funcionalmente ativo, o outro é silenciado. A impressão genômica é reversível através de sucessivas gerações. A herança das impressões paterna e materna é apagada durante a gametogênese e novas impressões genômicas são estabelecidas de acordo com o sexo do genitor.
A primeira evidência de impressão genômica foi observada através de um experimento clássico em camundongos utilizando a técnica de transferência pronuclear. Foram criados camundongos com células que possuem o material nuclear somente paterno ou somente materno, o que levava a um desenvolvimento embrionário deficiente. Camundongos só com genomas paternos apresentavam desenvolvimento normal de membranas e placentas, mas pouco desenvolvimento das estruturas embrionárias. Já camundongos com genoma materno apresentavam desenvolvimento embrionário muito melhor, mas membranas extra-embrionárias enquanto as placentas eram pobres. Logo, não adianta somente as células serem diplóides mas a presença tanto do genoma paterno quanto do genoma materno são necessários para desenvolvimento normal do embrião. Além disso, o genoma materno parece contribuir para o desenvolvimento embrionário enquanto o genoma paterno contribui para o desenvolvimento das estruturas extra-embrionárias. Outra evidência sobre a contribuição diferencial dos genomas paterno e materno no desenvolvimento embrionário provém da observação de fenótipos de teratomas ovarianos e molas hidatiformes humanas, fenômenos partenogenéticos e androgenéticos naturais, respectivamente. Teratomas ovarianos são compostos por uma massa desorganizada de tecidos embrionários diferenciados, mas não contêm tecido placentário. Já as molas hidatiformes completas são caracterizadas por um extensivo crescimento do trofoblasto com ausência de embrião.
Esses estudos demonstram a existência de genes cuja expressão depende da sua herança, se materna ou paterna. Esta diferenciação de expressão devido à origem é denominada impressão genômica ou genes impressos. Os primeiros genes impressos identificados em camundongos foram o gene do fator de crescimento 2 similar à insulina (Igf2) e o gene H19, presentes no cromossomo 7, e o gene para o receptor de Igf2, presente no cromossomo 17. Atualmente mais de 80 genes foram descobertos em humanos e camundongos que estão relacionados à impressão genômica, sendo metade deles provenientes exclusivamente de alelos maternos e a outra metade de alelos paternos (Arnaud e Feil, 2005).
Normalmente, genes impressos estão envolvidos na regulação da proliferação celular e crescimento da placenta e do embrião. Outros grupos de genes impressos possuem um papel importante em processos neurológicos e comportamentais. Assim, a falta ou defeito na regulação desses genes leva ao desenvolvimento aberrante, bem como causando diversas doenças envolvendo crescimento embrionário e síndromes comportamentais humanas.
A maioria dos genes impressos está organizada em agrupamentos gênicos apresentando um tamanho de vários megabases denominados de domínios de genes impressos. Esses domínios são conservados em humanos e camundongos e a maioria deles possui tanto alelos maternos quanto paternos, que são regulados por elementos de controle cis-acting. Recentemente foi descoberto por varredura de genomas que alguns genes impressos não fazem parte de um grupo de genes mas estão localizados isoladamente sendo chamados de “singletons”, sendo controlados diretamente por elementos cis-acting em seus seqüências gênicas.
Vários estudos estabelecem que em diversas espécies de mamíferos a cultura de embriões em estágio precoce pode ter conseqüências fenotípicas tardias no desenvolvimento e deve em parte ser resultado de uma perturbação na manutenção da impressão genômica das células somáticas devido a manipulação de culturas de gametas e de embriões in vitro (Khosla et al., 2001).
O CICLO DE VIDA DA IMPRESSÃO GENÔMICA
Seguindo suas aquisições de impressão genômica de células germinativas masculinas e femininas, as metilações alélicas nas regiões de controle de impressão genômica são mantidas no zigoto, e propagadas durante todo o desenvolvimento das células somáticas (Arnaud e Feil, 2005). Todavia, as impressões genômicas necessitam ser refeitas entre gerações subsequentes, para garantir que novas impressões possam ser devidamente restabelecidas de acordo com o sexo (ovário ou testículo) na nova linhagem celular em formação. Para isso, existe uma limitação de tempo e espaço. O início da impressão genômica está confinado ao desenvolvimento das linhagens de células germinativas, primeiramente pelo apagamento da impressão existente nas regiões de controle de impressão genômica, seguida da aquisição de novas marcações de impressão de acordo com o sexo da linhagem de células germinativas.
O apagamento da impressão genômica ocorre nas células germinativas primordiais, em um estágio precoce durante a diferenciação das células germinativas femininas e masculinas. Em camundongos e humanos, as células primordiais germinativas provenientes do epiblasto proximal originam os gametas. Em torno do 13 dia após a fecundação, células germinativas femininas entram em meiose, enquanto as masculinas sofrem uma interrupção da mitose. Durante esse processo, as células germinativas de ambos os sexos sofrem uma reprogramação epigenética intensa, quando as impressões genômicas são apagadas, prevenindo a passagem de marcações aberrantes na impressão genômica para futuras gerações (Lee et al., 2002). Contudo, diferentes regiões de impressão genômica são demetiladas diferentemente.
A aquisição de novas impressões genômicas ocorre nos estágios tardios do desenvolvimento das células germinativas. Interessantemente, a maioria das regiões de controle de impressão genômica possuem uma metilação derivada dos oócitos, e somente três domínios são conhecidos apresentando metilações derivadas de gametas masculinos. O tempo de aquisição da impressão genômica é diferente entre as células germinativas masculinas e femininas em camundongos. Em células germinativas masculinas, análises da região H19DMR (no domínio Igf2/H19) revelaram que a aquisição da metilação no DNA começa com a interrupção da meiose nas proespermatogônias e finalizada no estágio pós-natal na fase de paquíteno da meiose. Por injeção espermática foi confirmado que após a meiose, em células germinativas haplóides, a impressão genômica paterna está funcionalmente ativa. Diferentemente, em células germinativas femininas as metilações são adquiridas de forma assincrônica em diferentes loci, mas são todas finalizadas no estágio de metáfase II da meiose. Pouco é conhecido sobre o estabelecimento da impressão genômica em humanos. A região de controle de impressão genômica que regula o locus Igf2-H19 não está metilada nas células germinativas masculinas no estágio fetal. A aquisição da metilação parece ter início somente nas espermatogônias adultas, antes da divisão meiótica, e essa metilação é mantida durante o subsequente desenvolvimento da célula espermática. Já os estudos de metilação em células germinativas femininas são controversos.
Apesar do pouco conhecimento sobre o tempo exato da perda e aquisição das impressões genômicas em humanos, sabe-se que após o estabelecimento das novas metilações, estas são mantidas durante o desenvolvimento embrionário, após o nascimento e na fase adulta em todas as células somáticas. Notavelmente, a metilação diferencial em regiões de controle da impressão genômica é mantida durante o desenvolvimento pré-implantacional, apesar das inúmeras modificações genômicas que ocorrem nesse estágio do desenvolvimento. Estudos em camundongos demonstraram que após a fertilização do oócito, o genoma paterno sofre uma demetilação ativa levando à remoção de quase todas as metilações no DNA, enquanto o genoma materno sofre uma demetilação passiva durante as primeiras divisões celulares do embrião (Arnaud & Feil, 2005). Após a implantação acontece uma onda de metilação “de novo” que leva ao estabelecimento de novas metilações em várias regiões cromossômicas.
IMPRESSÃO GENÔMICA E DOENÇAS HUMANAS
Em algumas doenças humanas a manifestação fenotípica depende da origem da herança alélica materna ou paterna. Acredita-se que essas patologias complexas estejam ligadas à impressão genômica apresentando diversas causas como anomalias cromossômicas, translocações, deleções, dissomias uniparentais, defeitos epigenéticos e mutações de ponto em regiões de regulação nos domínios de controle de genes impressos. Doenças de impressão genômica podem ser divididas em três categorias: desordens de crescimento e desenvolvimento, desordens neurológicas e desordens metabólicas e hormonais. Como exemplos temos as síndromes de Beckwith-Wiedemann, Prader-Willi, Angelman, Rett e Silver- Russel, pseudo-hipoparatiroidismo, osteodistrofia hereditária de Albrigth e diabetes mellitus neonatal transiente.
SÍNDROME DE BECKWITH-WIEDEMANN
A síndrome de Beckwith-Wiedemann é uma doença congênita descrita primeiramente em 1964 pelo Dr. H.R. Wiedemann e em 1969 pelo Dr. J. Bruce Beckwith. Normalmente é uma doença esporádica, mas em diversos casos é herdada. A incidência dessa patologia na população é de aproximadamente 1:13,700 nascimentos (Mannens et al., 1996). Pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann apresentam macroglossia, paredes abdominais defeituosas (onfalocele, hérnia umbilical), crescimento exagerado com visceromegalia (fígado, rim e pâncreas) e hemihiperplasia. Crianças com síndrome de Beckwith-Wiedemann possuem de 7 a 21% de risco em desenvolver desordens embrionárias, principalmente tumor de Wilms (Mannens et al., 1996), entretanto uma variedade de tumores malignos e benignos podem ser observados como hepatoblastoma, carcinoma adrenocortical, rabdomiosarcoma e neuroblastoma.
A síndrome de Beckwith-Wiedemann é uma doença que apresenta complexas alterações genéticas e epigenéticas que ocorrem na região cromossômica 11p15.5. A região cromossômica 11p15.5 é dividida em dois grupos de genes impressos: genes de domínio telomêrico (Igf2 e H19) e genes de domínio centromérico (CDKN1C, KVLQT1 e LIT1) (21-32 refs). Os genes Igf2 e H19 são regulados em tecidos normais através da expressão.
Genes IGF2 e H19 são coordenadamente regulados em tecidos normais através de um modelo de expressão competitiva. No alelo H19 materno expresso, a região diferencial de metilação (H19DMR), situada 2Kb acima do início do gene, não está metilida sendo capaz de se ligar a proteína CTCF, um fator de ligação à CCCTC. Isso cobre o promotor materno IGF2 dos acentuadores na porção 3` do gene H19, impedindo a expressão do gene IGF2. No alelo paterno a região H19DMR está metilada bloqueando a ligação da proteína CTCF e prevenindo a expressão do alelo paterno H19. O promotor de IGF2 agora tem acesso aos acentuadores na posição 3` e o alelo paterno será então expresso via acentuadores e outros elementos de ligação. Isso sugere que H19DMR pode funcionar como um centro de controle de impressão genômica que regula o domínio telomêrico da região 11p15.5. A deleção completa desse centro de controle, originada de uma herança paterna, resulta na perda da impressão, com ativação da expressão do gene H19 paterno e redução da expressão do alelo paterno IGF2. Quando ocorre a deleção desse mesmo centro de controle, todavia de origem materna, o alelo IGF2 materno é ativado e o gene H19 materno fica com sua expressão reduzida. Já no domínio centromérico da região 11p15.5 (KvDMT1), as ilhas CpGs metiladas na porção 5`do gene LIT1, deve funcionar como um centro de controle de impressão genômica. A perda da metilação nessa região está associada com uma expressão bialélica do gene LIT1 em alguns casos de síndrome de Beckwith-Wiedemann.
SÍNDROMES DE PRADER-WILLI E ANGELMAN
A Síndrome de Prader-Willi (SPW) tem um fenótipo clínico caracterizado por hipotonia neonatal e retardo de desenvolvimento, seguido por desenvolvimento pós-natal de polifagia com subseqüente obesidade, baixa estatura, hipogonadismo hipogonadotrófico, e retardo mental leve a moderado. A Síndrome de Angelman (AS) está associada com sintomas e sinais extra-piramidais, movimentos abruptos, marcha irregular com a parte superior do braço inflexível, hiperatividade, acessos, retardo mental severo com ausência de fala verbal e paroxismos de risos inapropriados. A Síndrome de Prader-Willi e a Síndrome de Angelmann ocorrem em uma freqüência de cerca de 1/10.000 a 1/20.000 nascidos, respectivamente, sendo mais frequentemente causadas por microdeleções na região cromossômica 15q11-q13 que está sujeita a impressão genômica (Artigas-Pallares et al., 2005).
A Síndrome de Prader-Willi e a Síndrome de Angelmann são associadas com deficiências do cromossomo 15 paterno e materno, respectivamente. As deficiências são causadas por microdeleções (~75 % de casos de SPW ou SA), por dissomia uniparental (25 % de SPW e 2 % de SA) ou por mutações na impressão genômica. Por causa da impressão genômica, há expressão monoalélica diferencial de genes nos cromossomos homólogos 15 paterno e materno, e assim as microdeleções resultam em completa deficiência de expressão de genes críticos. Os genes para SPW não foram identificados ainda, que provavelmente origina de deficiências múltiplas (síndrome de genes contíguos). Por outro lado, aproximadamente 20% dos pacientes com a SA não mostram microdeleções cromossômicas, dissomia uniparental ou mutação na impressão genômica. Recentemente, mostrou-se que estes pacientes apresentam mutação no gene que codifica para uma ligase proteína-ubiquitina (UBE3A) que está envolvida na via de degradação de proteínas dependente de ubiquitinização e sofre impressão genômica cérebro-específica.
O sequenciamento genômico da região do gene SNRPN, depois do tratamento com bissulfito de sódio, revelou que >96 % de todos dinucleotídeos CpG são metilados no cromossomo materno.
SÍNDROME DE RETT
A síndrome de Rett é uma doença de desenvolvimento neuronal ligada ao X dominante que afeta quase que exclusivamente meninas. Apesar de mutações na proteína capaz de se ligar às ilhas CpGs metiladas (MeCP2) estarem associadas com a síndrome de Rett, padrões de expressões gênicas não estão significativamente alterados em células deficientes em MeCP2. Um estudo recente (Galvão e Thomas, 2005) identificou modificações em histonas mediadas por MeCP2 e a formação de estrutura de loop de alto nível especificamente associadas com silenciamento de cromatina nos loci Dlx5-Dlx6 em células normais, e sua ausência em células de pacientes com síndrome de Rett. Essa expressão alterada de Dlx5 por perda de silenciamento da cromatina sugere um mecanismo molecular que acontece na síndrome de Rett e propõe um novo papel para MeCP2 na organização da cromatina e na impressão genômica (Galvão e Thomas, 2005)
TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ASSISTIDA E A PERTURBAÇÃO DA IMPRESSÃO GENÔMICA
O período embrionário pré-implantação é particularmente crítico para a manutenção da impressão genômica. Foi observado em gêmeos monozigóticos a ocorrência de síndrome de Beckwith- Wiedmann em somente um dos gêmeos. Dentre dez pacientes gêmeos monozigóticos com essa discordância genética observou-se a perda de metilação na região de controle de impressão genômica KCNQ1 (11p15.5). De fato, gêmeos monozigóticos possuem um risco maior de apresentar síndrome de Beckwith- Wiedmann (Weksberg et al., 2002), sugerindo que exista um período precoce crítico durante o desenvolvimento do embrião durante o qual uma perturbação da impressão genômica está associada com um aumento da incidência de doenças em gêmeos monozigóticos. A incapacidade de manter a impressão genômica durante os estágios precoces do desenvolvimento pode levar ao mosaicismo genético, recentemente demonstrado pela presença de mosaicismo de impressão genômica na região de controle de impressão genômica denominada SNRPN em pacientes com síndrome de Prader-Willi.
Vários estudos demonstraram que em diversas espécies de mamíferos a cultura de embriões em estágio precoce pode ter conseqüências fenotípicas tardias no desenvolvimento e deve, em parte, ser resultado de uma perturbação na manutenção da impressão genômica das células somáticas. Foi observado que a manipulação e culturas de gametas e de embriões in vitro e a constituição dos meios de cultura utilizados em camundongos afetaram a manutenção da impressão genômica, o que também poderia acontecer em humanos pelas técnicas de reprodução assistida. Khosla et al. (2001) observaram que fetos de camundongos derivados de blastocistos cultivados em meio de cultura contendo soro fetal bovino apresentavam alteração na expressão de genes impressos H19, Igf2 e Grb10, que possuíam metilação excessiva em suas regiões de controle de impressão genômica. Estudos recentes sugerem uma possível ligação das técnicas de reprodução assistida com um aumento do risco de nascimento de crianças defeituosas. De 42463 crianças nascidas de usando técnicas de reprodução assistida, observa-se um aumento de 2,6 vezes o nascimento de crianças com baixíssimo ou baixo peso comparadas com crianças provenientes de concepção normal (Schieve et al., 2002). Hansen e colaboradores em 2002 também observaram uma taxa de nascimento de crianças defeituosas provenientes de ART de 9% através de FIV, 8,6% por ICSI, enquanto em fecundações normais esse índice é de 4,2%. Cox et al. (2002) relataram o nascimento de 3 crianças com síndrome de Angelmann provenientes de ICSI, sendo que todas apresentavam perda de metilação no alelo materno. Na população normal a incidência de síndrome de Angelmann é de 1:15000 e somente 5% dos casos ocorre por perda de metilação. Já De Baun e colaboradores (2003), observaram 7 casos de pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann sendo 5 provenientes de ICSI e 2 por FIV. Maher e colaboradores, em 2003, observaram que 6 crianças em 149 (4%) provenientes de ICSI apresentavam síndrome de Beckwith-Wiedemann. Apesar de alguns estudos terem demonstrado um aumento no risco de nascimentos de crianças com defeitos de perturbação da impressão genômica, estudos mais aprofundados devem ser realizados a fim de estabelecer uma ligação direta entre técnicas de reprodução assistida e perturbação da impressão genômica com conseqüente geração de prole defeituosa.
CONCLUSÃO
Durante os últimos anos houve um aumento grande na procura por técnicas de reprodução assistida bem um crescimento do interesse do entendimento da relação das técnicas de reprodução assistida e a regulação epigenética em células humanas pelos cientistas. Apesar de vários estudos demonstrarem uma maior incidência de pacientes com doenças relacionadas à impressão genômica provenientes de técnicas de reprodução assistida, deve-se observar que a taxa de nascimentos de crianças doentes provenientes de FIV ou ICSI ainda é extremamente baixa, bem próximo do normal da população. Nascimentos de crianças com baixíssimo ou baixo peso ao nascimento ainda constituem o maior fator de risco em reprodução assistida, juntamente com uma grande incidência de gestações múltiplas. O melhor entendimento e um maior conhecimento sobre os processos de apagamento, aquisição e manutenção da impressão genômica são essenciais para estabelecer o risco real de perturbação da impressão genômica e a taxa correta da incidência de geração de crianças com doenças de impressão genômica provenientes de cada tipo específico de técnica de reprodução assistida.