JBRA Assist. Reprod 2006;10(3):11-18
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2006.10.3.03
Caracterização dos Sistemas-tampão Bicarbonato e HEPES nos meios para Cultivo de Gametas e Pré-embriões Comercialmente Disponíveis: Análise do pH sob Diferentes Concentrações de Gás Carbônico (CO2) e Variação Inter-incubadoras.
Characterization of Bicarbonate and HEPES Buffer Systems in Commercially Available Culture Media for Gametes and Pre-embryos: pH Analysis under Varying Carbon Dioxide (CO2 Concentrations and Inter-incubator Variation.
RESUMO
Objetivo: Caracterizar os sistemas-tampão bicarbonato e HEPES de diversos meios comerciais para cultivo de gametas e pré-embriões, quando expostos a diferentes concentrações de gás carbônico (CO2) e em incubadoras distintas.
Material e Método: Três experimentos foram realizados para simular as fases da cultura in vitro de gametas e pré-embriões. Para cada experimento, utilizaram-se concentrações de CO2 de 5,0%, 5,5% e 6,0%, e duas incubadoras distintas. Os meios estudados foram Asp®, Gamete®, IVF® (Vitrolife, Suécia), Sperm buffer®, Follicle flushing®, Oocyte wash®, Fertilization®, Cleavage® (Cook, EUA) e modified HTF® (Irvine Scientific, EUA). As determinações do pH foram realizadas com pHmetro calibrado e aferido. No experimento 1, avaliou-se o pH dos meios após incubação por 12 horas num sistema aberto de cultivo. No experimento 2, mensurou-se o intervalo de tempo pelo qual o pH dos meios mantinha-se dentro dos níveis fisiológicos após exposição ao ar ambiente. No experimento 3, avaliou-se o tempo necessário de exposição à atmosfera de CO2 para que o pH dos meios CO2 -dependentes retornasse para valores fisiológicos, uma vez expostos ao ar ambiente por um período de 5 minutos.
Resultados: No experimento 1, verificou-se relação inversa entre o aumento dos níveis de CO2 da incubadora e o pH dos meios com tampão bicarbonato. Os meios com tampão HEPES, com exceção do Sperm buffer®, Gamete® e Asp®, não devem ser expostos à atmosfera de CO2, pois acidificam para níveis não-fisiológicos. No experimento 2, observou-se elevação do pH tempo-dependente para todos os meios com tampão bicarbonato, não-atenuada pela exposição prévia a concentrações de CO2 mais elevadas, que atingiram níveis não-fisiológicos após 2,5 minutos de exposição ao ar ambiente. Os meios com HEPES, com exceção do Gamete® e Asp®, podem ser expostos ao ar ambiente por tempo prolongado, sem que haja alteração significativa do pH. No experimento 3, verificou-se que o tempo para re-estabilização do pH em níveis fisiológicos, nos meios com tampão bicarbonato e HEPES CO2-dependentes, variou entre 45-90 e 5-15 minutos, respectivamente. Não se observou diferença inter-incubadoras nos valores do pH dos meios estudados, nas três condições experimentais.
Conclusão: A caracterização dos meios de cultivo deve fazer parte do controle de qualidade do laboratório de fertilização in vitro. Tal sistemática facilita o entendimento do comportamento destes sistemas quando expostos às condições individuais de trabalho de cada serviço, e permite ajustes que irão otimizar as condições de cultivo dos gametas e pré-embriões.
Palavras-chaves: meios de cultivo, sistemas tampão, pH, incubadora de CO2, controle de qualidade
ABSTRACT
Objective: To characterize the bicarbonate and HEPES buffer systems of commercially available culture media when exposed to different carbon dioxide (CO2 ) concentrations and incubators.
Material and method: Three experiments have been performed to simulate in vitro culture of gametes and pre-embryos. For each experiment, CO2 concentrations of 5.0%, 5.5%, and 6.0% have been tested using two different incubators. The following media were analyzed: 1) Asp®, Gamete®, IVF®: Vitrolife, Sweden; 2) Sperm buffer®, Follicle flushing®, Oocyte wash®, Fertilization®and Cleavage®: Cook, USA; 3) modified HTF®: Irvine Scientific, USA. Measurements of pH were performed using a calibrated and certified pHmeter. Experiment 1 analyzed pH values after overnight CO2 incubation in an open culture system model. Experiment 2 assessed the time interval in which CO2-dependent media maintained pH within physiological range after ambient air exposure. Experiment 3 studied the CO2 incubation period required for CO2-dependent media to stabilize at physiological pH levels after 5-minute ambient air exposure.
Results: Experiment 1 demonstrated an inverse relationship between increased incubator CO2 concentrations and pH levels. Exposure to CO2 must be avoided to prevent acidification in HEPES-buffered media, with exception of Sperm buffer®, Gamete®and Asp®. Experiment 2 showed a time-dependent increase in the pH levels of all CO2-dependent media after ambient air exposure, which was not attenuated by incubation at increased CO2 levels. All but Gamete®and Asp®HEPES-buffered media can be air exposed for long time periods without pH destabilization. Experiment 3 showed that bicarbonate and CO2-dependent HEPES-buffered media required a 45-90 and 5-15-minute CO2 incubation period for pH re-equilibration after ambient air exposure. Inter-incubator variation for pH was not observed for all tested media.
Conclusion: Characterization of commercially available culture media should be included in the in vitro fertilization laboratory quality control program. These procedures may help the embryologist to understand media behavior from distinct manufacturers at a work condition of a particular laboratory. Therefore, fine adjustments and/or protocol modifications can be made to optimize gamete and pre-embryos culture conditions.
Key-words: culture media, buffer systems, pH, CO incubator, quality control
INTRODUÇÃO
O principal sistema tampão nos seres humanos é o bicarbonato/ácido carbônico (HCO3-/ H2CO3), que é utilizado para manter o pH fisiológico entre 7,3 e 7,4, evitando assim variações do pH que podem levar à morte celular ou danos subletais irreversíveis. Por sua semelhança com o sistema tampão fisiológico no sangue, o tampão bicarbonato é o escolhido para compor os meios de cultivo de gametas e pré-embriões in vitro. Sob condições laboratoriais, é a concentração de gás carbônico (CO2) da incubadora que irá determinar o pH dos meios de cultivo, conforme a equação de Henderson-Hasselbach (Figura I). No sangue, este sistema tampão consiste de 24mM de bicarbonato que está em equilíbrio com o gás carbônico, este encontrado nos pulmões sob pressão parcial de cerca de 40mmHg. Esta pressão parcial corresponde a 5%. O CO2 nas fases líquida e gasosa está em equilíbrio (Figura I). Este equilíbrio é atingido gradualmente e, por este motivo, é necessário que os meios de cultivo permaneçam incubados sob atmosfera de CO2 por tempos prolongados antes do uso. Quanto mais CO2 for fornecido à atmosfera na qual está o meio de cultivo, mais ácido carbônico será produzido, aumentando desta forma a acidez. O inverso ocorre quando a concentração do CO2 diminui ou chega próximo ao zero, como no ar ambiente (0,03% de CO2), pois diminuindo a concentração do ácido carbônico no meio de cultivo, ocorre elevação do pH.
Figura I. Equação de Henderson-Hasselbach. Sistema tampão bicarbonato-ácido carbônico.
Além do tampão bicarbonato, outros tampões não-fisiológicos podem ser encontrados em alguns meios de cultivo, como o tampão HEPES (N-hydroxyethypiperazine-N-ethanesulfonate), que não depende do CO2, e mantém o pH constante quando um meio com tampão bicarbonato é exposto ao ar ambiente. No entanto, a concentração de HEPES e de bicarbonato não é a mesma em todos os meios prontos para uso disponíveis no mercado (Quadro I). Sendo assim, a força do sistema tampão pode variar entre meios de diferentes fabricantes, os quais podem apresentar características distintas quando expostos à atmosfera de CO2 e ao ar ambiente.
QUADRO I. Características e indicações de uso dos meios de cultivo de gametas e pré-embriões analisados no presente estudo.
Embora a maioria dos laboratórios utilize como rotina concentrações de CO2 entre 5,0% e 6,0%, é importante determinar, nas condições de trabalho de cada laboratório, qual o pH dos meios de cultivo utilizados frente à concentração de CO2 escolhida. Isto se deve ao fato de que diversas variáveis, como a altitude onde o laboratório está instalado em relação ao nível do mar, diferenças entre os diversos meios de cultivo disponíveis comercialmente, além de diferenças entre os equipamentos (incubadoras) onde as culturas são realizadas, podem interferir no pH final.
OBJETIVO
Caracterizar os sistemas tampão bicarbonato e HEPES de diversos meios de cultivo prontos para uso, existentes no mercado brasileiro, quando expostos a diferentes concentrações de CO2 e em incubadoras distintas.
MATERIAL E MÉTODOS
Realizou-se um estudo experimental simulando as fases da cultivo in vitro de gametas e pré-embriões, utilizando meios de cultivo comerciais, expostos a diferentes concentrações de CO2. Três experimentos foram realizados em duplicata utilizando incubadoras distintas equipadas com jaqueta de água, sendo uma delas equipada com sensor de umidade, oito portas internas e dispositivo para recuperação rápida dos níveis de CO2 após abertura e fechamento das portas (ThermoForma modelo 3110 série II), e outra sem sensor de umidade, com 3 portas internas e sem dispositivo de recuperação rápida dos níveis de CO2 (Forma Scientific modelo 3546). Para cada experimento, utilizou-se 3 diferentes concentrações de CO2: 5,0%, 5,5% e 6,0%. Os experimentos foram realizados num laboratório situado a 854 metros acima do nível do mar.
Meios de cultivo avaliados
Os seguintes meios de cultivo, adquiridos de diferentes fornecedores, foram estudados: 1) Asp®, Gamete®, IVF®: Vitrolife, Suécia; 2) Sperm buffer®, Follicle flushing®, Oocyte wash®, Fertilization® e Cleavage®: Cook, Australia; 3), modified HTF®: Irvine Scientific, EUA (Quadro I). Os meios de cultivo foram aliquotados em tubos de 14mL (Falcon 352001) e tampados frouxamente, seguindo o modelo de cultivo no sistema aberto.
Leitura do pH
As aferições do pH foram realizadas utilizando pHmetro calibrado e aferido (Digimed, Brasil). A calibração do pH- metro era realizada antes de cada dia de trabalho com tampões de pH conhecidos, 7,00 e 10,01. Cada leitura era realizada imediatamente após a imersão da membrana do eletrodo no tubo contendo o meio a ser estudado, juntamente com o termocompensador, seguindo as orientações técnicas do fabricante.
Experimento 1
Neste experimento, avaliou-se o pH dos diversos meios de cultivo após incubação por 12 horas num sistema aberto, sob concentrações de CO2 de 5,0%, 5,5% e 6,0%. Para tanto, 2mL de cada meio de cultivo a ser estudado foram acondicionados em 2 tubos de 14 mL, sendo cada tubo colocado numa das duas incubadoras utilizadas, mantidas sob concentração fixa de CO2 por um período de 12 horas. As leituras do pH foram realizadas imediatamente após a remoção de cada tubo da incubadora, e repetidas seguindo-se a mesma sistemática até que as três concentrações de CO2 fossem testadas. O objetivo deste experimento foi simular o preparo dos meios de cultivo, que geralmente é realizado no dia anterior a sua utilização, e determinar o valor do pH destes no dia do uso, quando expostos a diferentes concentrações de CO2. Além disto, objetivouse verificar se existe variação de pH entre incubadoras distintas.
Experimento 2
Neste experimento, mensurou-se o intervalo de tempo pelo qual o pH dos meios com tampão bicarbonato ou bicarbonato/HEPES, após 12 horas de incubação sob atmosfera de CO2, mantinha-se dentro dos níveis fisiológicos (~7,45), uma vez expostos ao ar ambiente. Para tanto, os tubos contendo os meios de cultivo a serem avaliados foram inicialmente incubados por 12 horas sob concentração fixa de CO2, nas duas incubadoras testadas. A seguir, cada tubo com o meio a ser avaliado foi removido da incubadora, e procederam-se leituras consecutivas do pH em intervalos de 2,5 minutos, até o tempo máximo de 15 minutos. As avaliações foram repetidas até que as três concentrações de CO2 fossem testadas. O objetivo deste experimento foi avaliar o tempo máximo que os meios com tampão bicarbonato podem ser mantidos fora da incubadora, sem prejuízo para o sistema de cultivo de gametas e pré-embriões.
Experimento 3
Neste experimento, avaliou-se o tempo de recuperação, ou seja, o intervalo de tempo de exposição à atmosfera de CO2 necessário para que o pH dos meios com tampão bicarbonato ou bicarbonato/HEPES CO2-dependentes retornasse para valores fisiológicos, uma vez expostos ao ar ambiente por um período de 5 minutos (Figura II). Para tanto, após incubação nas diferentes concentrações de CO2 por um período de 12 horas, os meios estudados foram expostos ao ar ambiente por 5 minutos, sendo realizada a mensuração do pH e a divisão do meio em alíquotas. Os tubos contendo as alíquotas eram recolocados nas incubadoras, mantidos sob condições ideais de cultivo, sendo então novamente retirados após 2,5, 5,0, 15, 30, 45 e 90 minutos de incubação, para nova leitura do pH. O objetivo deste experimento foi simular uma rotina de trabalho laboratorial com gametas ou pré-embriões fora da incubadora (estabelecendo-se o tempo médio de 5 minutos, suficientes para a realização da maioria das etapas do processo laboratorial da fertilização in vitro), ou seja, mantendo-se o tubo/placa com meio de cultivo exposto ao ar ambiente e, em seguida, retornando-o para a incubadora. Verificou-se o tempo que seria necessário para o pH estabilizar em níveis fisiológicos, permitindo que o tubo/placa com o meio de cultivo pudesse ser novamente retirado da incubadora.
Figura II. Desenho do estudo para análise do tempo necessário de re-incubação em atmosfera de CO2 para recuperação dos níveis fisiológicos de pH dos meios de cultivo avaliados (Experimento 3).
Análise estatística
Os dados apresentados referem-se ao registro de pH de uma unidade amostral avaliada ao longo do tempo. Cada condição experimental, dada pela combinação de um meio de cultivo e de uma concentração de CO2, foi aplicada a uma única unidade experimental que foi avaliada ao longo do período de estudo. Os dados foram apresentados apenas descritivamente, pois a aplicação de testes estatísticos requer um conjunto de medidas para que haja variabilidade.
RESULTADOS
Experimento 1
Os valores do pH dos meios de cultivo incubados por 12 horas, sob diferentes concentrações de CO2, e nas duas incubadoras utilizadas, estão descritos na Tabela I. A diferença nos valores do pH dos meios com tampão bicarbonato e com tampão HEPES entre as duas incubadoras, quando expostos às mesmas concentrações de CO2, variou de 0,0-0,13. Houve ligeiro decréscimo do pH dos meios de cultivo estudados em resposta ao aumento das concentrações de CO2 em ambas as incubadoras (Tabela I). Observou-se que os meios de cultivo HTF modificado®, Follicle flushing® e Oocyte wash®, ambos contendo HEPES, não devem ser expostos à atmosfera com CO2 entre 5% e 6%, pois acidificam para níveis não-fisiológicos (Tabela I). Em contrapartida, os meios Sperm buffer®, Gamete® e Asp®, que também contêm HEPES, mantêm-se sob níveis fisiológicos de pH quando expostos à atmosfera com CO2 entre 5% e 6% (Tabela I).
Tabela I. Mensuração dos níveis do pH nos diversos meios de cultivo estudados após gaseificação por 12 horas, sob concentrações de CO2 de 5,0%, 5,5% e 6,0%, nas duas incubadoras testadas.
Experimento II
Após remoção da incubadora, observou-se elevação tempodependente do pH dos meios com tampão bicarbonato, nãoatenuada pela exposição prévia a concentrações de CO2 mais elevadas (gráficos I a III). Para todos os meios com tampão bicarbonato estudados, observou-se que o pH atingiu níveis ao redor de 7,5 após exposição ao ar ambiente por apenas 2,5 minutos, havendo elevação subseqüente (gráficos I a III). Os meios de cultivo com tampão bicarbonato/HEPES apresentaram resultados variáveis em relação à força do sistema-tampão: (a) o meio Sperm buffer® apresentou excelente capacidade tampão, mantendo-se com pH em níveis fisiológicos tanto sob atmosfera de CO2 entre 5,0-6,0%, quanto sob ar ambiente, não se observando variação inter-incubadoras (gráfico IV); (b) embora os meios Follicle flushing®, Oocyte wash® e HTF modificado® não devam ser expostos à atmosfera de CO2, pois acidificam (experimento 1, Tabela I), estes podem ser expostos ao ar ambiente por tempo prolongado, sem que haja alteração significativa do pH (gráfico 5); (c) os meios Asp® e Gamete®, apesar de possuírem tampão HEPES, mostraram-se CO2-dependentes, sofrendo um aumento nos valores de leitura do pH em relação ao tempo de exposição ao ar ambiente. Observou-se que após cerca de 5 minutos de exposição ao ar ambiente, o pH destes meios atingiu níveis ao redor de 7,5, elevando-se subsequentemente (Gráfico VI). Estes resultados foram observados nas 3 concentrações de CO2 estudadas e não se observou diferença considerável inter-incubadoras.
Gráfico I. Curva de pH dos meios com tampão bicarbonato Cleavage®, IVF® e Fertilization® expostos ao ar ambiente, após incubação por 12 horas sob atmosfera de 5,0% de CO2
Gráfico II. Curva de pH dos meios com tampão bicarbonato Cleavage®, IVF® e Fertilization® expostos ao ar ambiente, após incubação por 12 horas sob atmosfera de 5,5% de CO2
Gráfico III. Curva de pH dos meios com tampão bicarbonato Cleavage®, IVF® e Fertilization® expostos ao ar ambiente, após incubação por 12 horas sob atmosfera de 6,0% de CO2
GRÁFICO IV. Curva de pH do meio Sperm buffer®, exposto ao ar ambiente, após incubação por 12 horas sob atmosfera de CO2 de 5,0%, 5,5% e 6,0%
GRÁFICO V. Curva de pH dos meios tamponados com HEPES: Oocyte wash®, Follicle flushing e HTF modificado®, quando expostos ao ar ambiente, sem exposição prévia à atmosfera de CO2
Gráfico VI. Curva de pH dos meios tamponados com HEPES: Asp® e Gamete®, quando expostos ao ar ambiente, após incubação por 12 horas sob atmosfera de CO2 de 5,5%
Experimento III
O tempo mínimo para a re-estabilização do pH dos meios de cultivo com tampão bicarbonato ou com tampão HEPES/bicarbonato CO2-dependentes (Asp® e Gamete®), após exposição ao ar ambiente por 5 minutos, variou conforme o fabricante e o tipo de tampão contido (Gráfico VII), sendo de aproximadamente 5 e 15 minutos para os meios Gamete® e Asp®, respectivamente, que possuem tampão bicarbonato/ HEPES, e de cerca de 45-90 minutos para os meios tamponados com bicarbonato (Fertilization®, Cleavage® e IVF®). Não se observou variação inter-incubadoras para o tempo de recuperação. Não se observou aceleração no tempo de recuperação com o aumento da concentração CO2 na faixa entre 5,0% e 6,0% utilizada no presente estudo.
Gráfico VII. Tempo necessário para re-estabilização do pH dos meios de cultivo para níveis fisiológicos, após exposição ao ar ambiente por 5 minutos e re-incubação sob atmosfera de CO2
DISCUSSÃO
O desenvolvimento dos meios de cultivo para a fertilização in vitro (FIV) em humanos assemelha-se a outros aspectos das técnicas de reprodução assistida, como a estimulação ovariana controlada, os procedimentos de micromanipulação dos gametas e a avaliação genética dos pré-embriões. Os meios de cultivo inicialmente utilizados para a FIV eram aqueles destinados à incubação de células somáticas (Ham F-10, Earle) ou aqueles destinados às células somáticas, mas adaptados para a FIV e cultura embrionária animal (Tyrode´s T6, WM1). O primeiro meio desenvolvido especificamente para a FIV humana foi o Fluido Tubário Humano (HTF - human tubal fluid) (Quinn, Kerin, Warnes, 1985), baseado na composição química do fluido da tuba uterina, incluindo ainda fatores efetivos para a cultura de embriões de ratos (ex. piruvato e lactato) (Lippes, Enders, Pragay et al. 1972; Borland, Biggers, Lechene et al, 1980). O HTF tornou-se muito popular e largamente utilizado para o cultivo de pré-embriões humanos em todo o mundo. Nos últimos anos, melhoramentos na formulação original do HTF foram realizados, que incluíram principalmente a adição de aminoácidos e a remoção/diminuição da glicose e do fosfato, além de correções nos níveis de bicarbonato (Quinn, 1995; Gardner, Lane, Calderon et al., 1996). Apesar destas mudanças, o HTF é categorizado como um meio do tipo simples.
Com o passar do tempo, novos meios surgiram, incorporando novos elementos aos meios do tipo simples, como sais inorgânicos, substratos energéticos, vitaminas, aminoácidos, além de outros co-fatores, tornando-se bem mais complexos. Estes novos meios, ditos complexos, contêm os elementos necessários para suportar a fertilização e o desenvolvimento embrionário inicial in vitro, de forma mais efetiva do que os meios simples (Bavister, 1995). Paralelamente ao desenvolvimento dos meios complexos, observou-se, a nível mundial, uma mudança conceitual, pois até então muitos laboratórios preparavam os próprios meios (meios simples) a partir dos sais, ao passo que com a introdução dos meios complexos, tal prática diminuiu sobremaneira por diversos fatores relacionados principalmente à necessidade de um controle de qualidade cada vez mais rigoroso, além da necessidade da manutenção da mesma qualidade dos meios lote-a-lote.
Deste modo, diversos fabricantes passaram a comercializar meios para cultivo de gametas e pré-embriões humanos, prontos para uso, e testados seguindo normas de biossegurança internacionais. Até o momento, não existem evidências científicas suficientes que permitam dizer que um meio é superior ao outro para os procedimentos rotineiros de FIV. A escolha por um determinado meio tem se baseado em fatores como controle de qualidade, tipo de teste biológico para avaliar o nível de endotoxinas e a eficiência da cultura embrionária, a experiência pessoal, custo, e a existência de um fornecedor que garanta um fornecimento constante, respeitando os prazos de validade dos diversos meios.
Embora os fabricantes dos meios de cultivo prontos para uso forneçam certificados de análise para cada lote produzido, que inclui informações sobre o pH do meio em determinada concentração de CO2, nível de endotoxinas e taxa de formação de pré-embriões de 2 células ou blastocistos, é importante que cada laboratório caracterize os meios utilizados nas suas condições de trabalho. Isto é importante, pois as formulações químicas dos meios variam conforme o fabricante, e existem fatores locais, como a altitude do laboratório, por exemplo, que pode influenciar no pH final dos mesmos. Além disto, existem laboratórios que trabalham com incubadoras de CO2 com múltiplas portas, que minimizam as alterações na atmosfera de CO2 interna, ao passo que outros utilizam incubadoras com porta única, cuja alteração da concentração do CO2 é significativamente maior (Abramczuk & Lopata, 1986). Outros trabalham com várias incubadoras, dividindo entre elas as fases da cultura embrionária, ao passo que alguns utilizam poucas incubadoras, o que aumenta o número de abertura de portas e, conseqüentemente, aumenta a chance de alteração na cultura embrionária.
No sistema de cultivo embrionário in vitro, é a concentração de CO2 da incubadora que irá determinar o pH dos meios de cultivo, conforme a equação de Henderson-Hasselbach. A maioria dos laboratórios utiliza concentrações de CO2 ao redor de 5,0% para o cultivo embrionário. Tal sistemática se baseia no fato de que o pH do sangue situa-se ao redor de 7,4, e neste fluido o sistema tampão é o bicarbonato presente na concentração de 24mM. O bicarbonato está em equilíbrio com o gás carbônico, este presente nos pulmões sob pressão parcial de cerca de 40mmHg, que corresponde a 5%.
Entretanto, a concentração exata de bicarbonato existente nos meios comerciais geralmente não é informada, além do fato de existirem outros tampões fracos que podem alterar o pH final sob determinada atmosfera de CO2. Para exemplificar, basta que a concentração de bicarbonato de sódio do meio seja 1mM maior, ou seja, 25mM ao invés de 24mM, para que a concentração necessária de CO2 para se obter um pH de 7,4 mude de 5,0% para 5,8%, sem considerar outros fatores como a altitude onde se localiza o laboratório. Não se sabe ao certo de que forma o pH do meio de cultivo afeta o pH intracelular (pHi). Porém, tem-se observado que a manutenção do pH do meio de cultivo ao redor de 7,4 otimiza o desenvolvimento embrionário. A manutenção da estabilidade do pH do meio também é um fator que interfere no desenvolvimento embrionário. Khabani et al. (2003) concluíram que o pH do meio tem um impacto significante sobre as taxas de implantação e gravidez, sendo que a faixa de pH ótima ficou entre 7,3-7,4, com taxas de 32% e 48%, respectivamente, versus 25% e 30% para o valor de pH de 7,2. Por outro lado, Adaniya (2005) demonstrou que o aumento da concentração de CO2 da incubadora resultou em um decréscimo significante do pH do meio, porém sem repercussão para o desenvolvimento embrionário e taxas de gravidez. Quinn & Cooke (2004) ajustaram a concentração de bicarbonato de sódio do meio HTF por eles idealizados, para permitir a manutenção de pH similar em atmosferas contendo 5% ou 6% de CO2, e obtiveram taxas similares de fertilização e desenvolvimento embrionário.
Embora a equação de Henderson-Hasselbach seja extremamente útil do ponto de vista conceitual, sua acurácia para o cálculo direto do pH dos meios é limitada, pois vários ácidos fracos e os sais correspondentes, em constante associação e dissociação, fazem parte da formulação dos meios de cultivo, e causam um efeito iônico que altera o equilíbrio do pH e a força tampão do bicarbonato. Além disto, a adição de proteínas, como a albumina, além de atuar como quelante, age como tampão sendo importante para minimizar as flutuações do pH dos meios quando expostos ao ar ambiente, principalmente nas culturas realizadas num sistema aberto. A adição de aminoácidos e proteínas pode melhorar a capacidade tampão dos meios e minimizar as variações do pH intracelular dos pré-embriões (Edwards, Williams & Gardner, 1998). O efeito de outras proteínas, como a αe β-globulinas, e macromoléculas, como o álcool polivinílico, o hialuronato e as glicosaminoglicanas, sobre o pH dos meios de cultivo ainda não está bem elucidado.
Abramczuk & Lopata (1986) observaram que a freqüência da abertura das portas da incubadora de CO2 tem relação direta com a velocidade de clivagem de pré-embriões, e atribuíram tal fato à desestabilização dos níveis de CO2 no ar da incubadora, com conseqüente repercussão no pH do meio, além da alteração da temperatura. É observação freqüente no laboratório de fertilização in vitro que os níveis de CO2 levam certo tempo para recuperar após a abertura e o fechamento da porta da incubadora, e que a velocidade de recuperação varia entre modelos diferentes de incubadoras (Scholtes & Zeilmaker, 1996). No presente estudo, realizamos os experimentos em duplicata, utilizando duas incubadoras de modelos diferentes, sendo uma delas mais antiga, cuja velocidade de recuperação dos níveis de CO2 é mais lenta, e outro modelo moderno, equipado com dispositivo para recuperação rápida dos níveis de CO2. Entretanto, para os meios de cultivo estudados nas condições experimentais testadas, não observamos diferenças entre elas quanto aos valores de pH obtidos após incubação, ou diferenças na velocidade de recuperação do pH após remoção dos meios da incubadora (experimento 3). A faixa de pH dos meios com tampão bicarbonato estudados, expostos à atmosfera de CO2 entre 5,0% e 6,0%, foi de 7,38-7,49 para a incubadora equipada com dispositivo de recuperação rápida de CO2 e múltiplas portas internas, e de 7,32-7,43 para a incubadora não equipada com estes recursos. Além disso, verificamos que o tempo para re-estabilização do pH, nos meios com tampão bicarbonato avaliados, após terem sido expostos ao ar ambiente, situou-se ao redor de 45 minutos para que atingissem pH ao redor de 7,5, e de 90 minutos para pH ao redor de 7,4, em ambas as incubadoras.
Os meios de cultivo contendo HEPES possibilitam a manipulação dos gametas fora da atmosfera de CO2, pois mantém o pH dos meios com tampão bicarbonato estável quando expostos ao ar ambiente. Existe consenso na literatura sobre a utilização dos meios contendo tampão HEPES para a manipulação dos gametas logo após a aspiração oocitária e para o preparo dos espermatozóides (Quinn et al., 1985; Ozawa et al., 2006), Entretanto, existe controvérsia com relação a potencial toxicidade do HEPES para os pré-embriões. Alguns estudos demonstram que o HEPES altera a atividade dos canais iônicos presentes na membrana plasmática dos pré-embriões, sendo embriotóxico (Morgia et al., 2006), enquanto outros afirmam que não há prejuízo para o desenvolvimento embrionário (Behr et al., 1990). Estes últimos, avaliando embriões de camundongos, demonstraram ser possível estender toda a cultura embrionária com meios de cultivo que utilizam tampão HEPES, sem que houvesse estímulo à partenogênese. Embora a maioria dos fabricantes não descreva a concentração de HEPES utilizada em cada meio, é interessante notar as diferenças entre os meios contendo HEPES de diferentes fabricantes em relação à capacidade tamponante, que podem refletir concentrações distintas de HEPES entre eles, possivelmente com o intuito de minimizar os potenciais efeitos deletérios do mesmo. No presente estudo, quando avaliamos o meio HTF com HEPES observamos que o mesmo apresenta pH estável sob ar ambiente por tempo prolongado. O mesmo ocorre com os meios Sperm buffer® e Oocyte wash® e Follicle flushing®. Entretanto, ao avaliar os meios Gamete® e Asp®, observamos que os mesmos são CO2-dependentes, pois há elevação progressiva do pH quando expostos ao ar ambiente, embora de forma mais lenta do que os meios que não contém HEPES. Assim sendo, especulamos que a concentração de HEPES nestes últimos deva ser inferior a 4mM, que é a concentração descrita pelo fabricante para o HTF modificado (Quadro I). Tais diferenças aqui apontadas devem ser de conhecimento daqueles que trabalham no laboratório de fertilização in vitro.
Para o uso correto dos meios de cultivo comercialmente disponíveis, os laboratórios deveriam incluir como rotina nos procedimentos de controle de qualidade um exercício laboratorial denominado “caracterização dos meios de cultivo”, previamente à introdução de um meio novo na rotina laboratorial. A caracterização dos meios visa responder três questões básicas: (1) qual o pH do meio que utilizo, na incubadora que utilizo, após incubação por um determinado período de tempo e sob determinada concentração de CO2? (2) qual o tempo máximo que posso manter uma placa de cultura contendo meio com tampão bicarbonato fora da incubadora, sem que haja alteração significativa do pH do mesmo? (3) após trabalhar com uma placa de cultivo contendo meio com tampão bicarbonato fora da incubadora, por quanto tempo a mesma deve ser mantida na incubadora para a estabilização do pH em níveis fisiológicos, permitindo nova retirada? As respostas destas questões permitem estabelecer estratégias de trabalho no laboratório e otimizar a cultura embrionária, o que significa em alguns casos trabalhar com várias placas do mesmo meio para que o mesmo não permaneça por tempos prolongados fora da incubadora, ou então que permaneça por tempo inadequado gaseificando.
No presente estudo, apresentamos o método e os resultados de três experimentos que visaram caracterizar vários meios de cultivo, prontos para uso, e comercialmente disponíveis no Brasil. O intuito do presente estudo não foi o de analisar todos os meios existentes no mercado, mas principalmente os meios de cultivo com registro junto ao Ministério da Saúde, e cujos fabricantes possuam distribuidores no Brasil que fornecem lotes sucessivos de forma sistemática. A ferramenta utilizada para a caracterização dos meios foi a mensuração do pH dos mesmos, que pode ser facilmente realizada utilizando equipamento de bancada ou portátil, de baixo custo. No primeiro experimento, verificamos que após exposição por 12 horas à atmosfera de CO2, houve relação inversa entre o aumento dos níveis de CO2 no ar da incubadora e os valores do pH, que situaram-se na faixa de 7,40-7,49, 7,38-7,45 e 7,32-7,44 para as concentrações de CO2 de 5,0%, 5,5% e 6,0%, respectivamente. Além disto, observamos que os meios com tampão HEPES apresentaram características distintas quando expostos à atmosfera de CO2, havendo meios que não podem ser expostos à atmosfera de CO2, pois acidificam para níveis não-fisiológicos, enquanto outros (Gamete®, Asp®) são CO2-dependentes, devendo ser expostos ao CO2 antes do uso. Portanto, a conduta laboratorial adotada por muitos de colocar os meios na incubadora na véspera do caso de fertilização deve levar em consideração as diferenças existentes entre os diversos meios com tampão HEPES.
No segundo experimento, verificamos que os meios com tampão bicarbonato, num sistema aberto, não devem ficar expostos ao ar ambiente por mais de 2,5 minutos, pois ao final deste período já atingem pH ao redor de 7,5, que se eleva subsequentemente. Ainda, observamos que os meios com tampão HEPES variam quanto à capacidade tampão uma vez expostos ao ar ambiente, sendo que os meios deste tipo fabricados pela Irvine Scientific e Cook mantêm pH estável, em níveis fisiológicos, mesmo quando expostos ao ar ambiente por tempo prolongado. Em contrapartida, os meios com tampão HEPES fabricados pela Vitrolife são dependentes do CO2, havendo elevação do pH para níveis não-fisiológicos após cerca de 5 minutos de exposição ao ar ambiente. Assim sendo, ao se utilizar estes últimos, deve-se respeitar estas características e adequar a estratégia de trabalho, como por exemplo, aumentar o número de placas e segmentar os procedimentos de forma a utilizar cada placa por no máximo 5 minutos. Por fim, no terceiro experimento, observamos que os meios com tampão bicarbonato e bicarbonato/HEPES CO2-dependentes devem ser reincubados sob atmosfera de CO2 por 45-90 minutos e 5-15 minutos, respectivamente, para estabilizarem em níveis fisiológicos de pH após exposição ao ar ambiente. Assim sendo, as placas/tubos contendo estes meios de cultivo devem ser gaseificadas apropriadamente, pela exposição por tempos adequados à atmosfera de CO2, antes de serem removidas novamente da incubadora, evitando-se assim oscilações do pH e alcalinização excessiva.
Os resultados dos experimentos realizados no presente estudo devem ser interpretados com cautela, pois simulam fases da manipulação de gametas e cultivo de pré-embriões segundo o modelo aberto de cultivo. Neste sistema, as oscilações do pH dos meios CO2-dependentes são mais acentuadas quando os mesmos são expostos ao ar ambiente. Da mesma forma, as oscilações de osmolaridade também são mais marcantes, devido à rápida evaporação principalmente quando se trabalha com pequenos volumes. A cultura em sistema fechado, que utiliza óleo (mineral ou de parafina) sobre a superfície do meio, confere uma barreira física que minimiza a taxa de evaporação, e consequentemente, as alterações de osmolaridade. Além disto, diminui a velocidade das trocas gasosas, reduzindo desta forma a perda de CO2, e a conseqüente elevação do pH quando os meios são expostos ao ar ambiente. Embora o sistema fechado permita o cultivo dos pré-embriões em condições ótimas, tal sistema é inadequado do ponto de vista prático durante as fases de manipulação dos gametas, como no processamento do sêmen, na identificação dos oócitos pós-captação e durante o tratamento enzimático para a remoção das células do cumulus nos casos de FIV envolvendo a injeção intracitoplasmática do espermatozóide (ICSI) (Milker, Goldberg & Collins, 1994).
Concluindo, a caracterização dos sistemas-tampão dos meios de cultivo prontos para uso comerciais, quando expostos às condições individuais de trabalho de cada serviço, facilita o entendimento do comportamento destes sistemas, e permite ajustes que irão otimizar as condições de cultivo dos gametas e pré-embriões. Tal sistemática deve fazer parte do controle de qualidade de um laboratório de fertilização in vitro.