JBRA Assist. Reprod 2006;10(3):31-36
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2006.10.3.06
Neste artigo, nosso objetivo é descrever os dados disponíveis na literatura acerca da caracterização e análise da modulação da expressão gênica no embrião humano pré-implantação. Serão enfatizados os trabalhos descrevendo genes envolvidos em processos marcantes do desenvolvimento embrionário inicial, como as primeiras divisões mitóticas, a compactação do embrião, a diferenciação celular e formação do blastocisto, bem como os genes conhecidamente importantes para a manutenção celular, como fatores de transcrição, genes de resposta ao estresse e genes envolvidos no metabolismo energético. Serão também citados alguns genes cuja função ainda não é muito clara, mas demonstraram ser importantes para o desenvolvimento embrionário e, finalmente, serão considerados os efeitos nocivos do desenvolvimento embrionário in vitro sobre o controle da expressão gênica.
Palavras-chave: expressão, genes, regulação, embrião, pré-implantação
INTRODUÇÃO
Os genes têm papel fundamental na coordenação homeostática, metabólica e fisiológica dos organismos durante toda a vida. Até mesmo nas fases mais iniciais do desenvolvimento embrionário, a ativação ou repressão de determinados genes é crucial para o perfeito funcionamento celular. No que se refere à fase pré-implantação, o controle preciso da atividade gênica é particularmente importante, uma vez que durante este período o embrião deixa de ser dependente de RNAs provenientes do óvulo e passa a utilizar seu próprio genoma. Além disso, durante o desenvolvimento pré-implantação ocorrem os primeiros passos na diferenciação celular, que guiarão o desenvolvimento de variados tecidos e tipos celulares presentes no organismo.
Mas como é que um óvulo fertilizado se desenvolve em centenas de tipos celulares diferentes? Como se dá o processo de especialização celular iniciado ainda nos primeiros estágios do desenvolvimento embrionário? Que genes estão envolvidos neste processo de especialização celular e na formação de embriões de boa qualidade?
Questões como essas envolvem diversas áreas de pesquisa e têm sido alvo de enorme volume de trabalhos científicos. Além de permitir o entendimento de um passo crítico no desenvolvimento embrionário, a busca por estas respostas também está relacionada a um tema de primeira ordem nas discussões científicas e médicas dos últimos anos: as células-tronco embrionárias.
Para entender como uma célula se especializa em exercer determinada função é necessário entender qual foi a programação genética desencadeada nesta célula durante sua formação, ou seja, que genes foram expressos, em que momento e em que intensidade. Se, no futuro, conseguirmos entender a atividade gênica durante os passos iniciais do desenvolvimento embrionário, será possível entender como se formam as células-tronco embrionárias, e a partir daí, entender como se dá sua diferenciação em outros tipos celulares. Além das vantagens evidentes que este conhecimento trará à medicina de forma geral, enormes avanços também poderão ser desencadeados na medicina reprodutiva, aumentando a qualidade dos embriões produzidos, e consequentemente melhorando as taxas de sucesso nos ciclos de reprodução assistida. Tudo isso poderá ser possível através da manipulação genética das células.
Nos últimos anos, grande parte da informação contida em nosso DNA tem sido decifrada, sobretudo graças ao Projeto Genoma Humano. Dados sobre quantos e quais são os nossos genes, e principalmente, como e quando eles são utilizados pelas células podem ajudar a compreender uma série de distúrbios que atualmente permanecem obscuros e que são ainda hoje um importante problema de saúde no mundo. A etapa mais difícil deste processo é justamente a análise da função e do controle da atividade de cada gene, que geralmente demanda diversos experimentos práticos e que pode levar anos de pesquisa até ser elucidada. Além disso, este processo torna-se ainda mais complicado quando se considera que o produto da maioria de nossos genes apresenta mais de uma função e pode atuar em conjunto com diversos outros, formando assim uma intrincada rede de interações que dificulta seu perfeito entendimento.
No que diz respeito às técnicas utilizadas no estudo da expressão gênica embrionária, recentes avanços têm permitido análises cada vez mais refinadas do material genético extraído de pequena quantidade de células. Metodologias como a construção de bibliotecas de cDNA representativas de diferentes fases do desenvolvimento embrionário pré-implantação, análise por microarray, PCR em tempo real, entre outras, aliadas a modernas ferramentas de bioinformática, têm proporcionado a disponibilização de uma enorme quantidade de dados na literatura científica. Robson (2004) descreve algumas das técnicas mais modernas utilizadas no estudo do transcriptoma embrionário (conjunto de transcritos - RNAs - presentes no embrião).
FUNCIONAMENTO DOS GENES: UMA VISÃO GERAL
Em primeiro lugar, é fundamental compreendermos o que se entende por expressão gênica, ou seja, de que maneira as células controlam e utilizam as informações presentes no DNA. O estudo da expressão gênica envolve a análise de regiões do DNA - genes - que são ativadas, em geral para a produção de proteínas, em tecidos e em momentos específicos, bem como os mecanismos que regulam esta ativação. Neste tópico serão descritas, sucintamente, as principais etapas envolvidas no fluxo da informação gênica e a maneira como ele pode ser modulado.
De maneira geral, a informação genética presente no DNA deve ser processada - ou decodificada - até que as proteínas, produtos finais de grande parte de nossos genes, sejam produzidas. Os dois principais processos envolvidos nesta decodificação da informação genética são a transcrição, durante o qual diferentes RNAs são produzidos a partir do DNA, e a tradução, onde as informações presentes nos RNAs mensageiros são utilizadas para guiar a síntese de (Alberts et al., 2004).
Em qualquer momento ao longo desta via, as células podem alterar o fluxo das informações, definindo que genes serão transcritos em determinado momento, modificando ou mesmo interrompendo a transcrição, produzindo diferentes RNAs a partir do mesmo gene, controlando a meia-vida destes RNAs no citoplasma, a intensidade com que serão traduzidos ou determinando alterações nas proteínas recém-sintetizadas. Desta forma, é possível controlar quais genes serão expressos em determinado momento e consequentemente quais proteínas serão produzidas, e por quanto tempo elas estarão disponíveis dentro das células. Essa enorme capacidade de modulação na expressão gênica permite que células que contenham exatamente o mesmo DNA se tornem extremamente diferentes, através da utilização de conjuntos de genes diferentes, em períodos diferentes.
Diversas são as estruturas envolvidas neste controle da expressão gênica, e podem estar relacionadas à estrutura da cromatina (regiões do DNA mais empacotadas são mais dificilmente transcritas) ou a seqüências presentes no próprio DNA, como os promotores de transcrição, operadores, repressores e enhancers, ou outras moléculas, sobretudo proteínas, que atuam como fatores de transcrição, iniciadores, diferentes RNA polimerases, ribossomos, e muitas outras (Alberts et al., 2004).
Estimativas realizadas a partir do Projeto Genoma Humano mostram que nosso DNA encerra algumas dezenas de milhares de genes (http://www.ornl.gov/sci/techresources/
Human_Genome/faq/genenumber.shtml). É a combinação variada destes genes durante diferentes fases do desenvolvimento que permite a formação de nossos mais de 200 tipos celulares diferentes. O início deste processo de diferenciação e especialização celular ocorre ainda na fase embrionária préimplantação. Algumas informações a respeito da expressão gênica e sobrevivência embrionária durante esta fase foram reunidas em Levy (2001).
Primeiro ciclo celular - A mãe como provedora
Após a fertilização e até o fim da primeira divisão mitótica, toda a biossíntese de proteínas do embrião independe da transcrição gênica, pois todos os RNAs, ribossomas e demais fatores necessários ao processo de tradução neste período são provenientes do oócito, e desta forma têm origem exclusivamente materna. A ativação do genoma embrionário, chamado de “transição maternal-zigótica” (MZT), varia entre diferentes espécies, e só ocorre, em humanos, no estágio de 4 a 8 células.Até este momento, a atividade gênica nos pró-núcleos permanece bastante reduzida, sobretudo no feminino. Foi mostrado que a transcrição gênica no pró-núcleo masculino é cerca de 5 vezes maior do que no pró-núcleo feminino. Esta diferença se deve, provavelmente, a diferenças na estrutura da cromatina, uma vez que durante este período ocorre no pró-núcleo paterno a troca de protaminas por histonas (proteínas envolvidas no enovelamento do DNA), o que não ocorre no pró-núcleo materno. Isso permite um afrouxamento temporário do DNA paterno, o que facilita o acesso das proteínas responsáveis pela transcrição. Foi demonstrado também que a ativação de genes do cromossomo Y ocorre nas fases iniciais do desenvolvimento pré-implantação e sugere-se que a atividade gênica no pró-núcleo masculino seja fundamental para a formação do nucléolo após a fusão dos pró-núcleos (Tesarik, 2005). Alguns autores argumentam ainda sobre o papel de RNAs do espermatozóide no desenvolvimento embrionário inicial. Além disso, o cálcio proveniente do espermatozóide é um dos fatores responsáveis pela ativação do genoma embrionário. Uma boa revisão sobre a influência paterna no desenvolvimento do embrião no período pré-implantação pode ser encontrada em Tesarik (2005).Em termos de alterações no padrão de expressão gênica, a MZT marca alguns pontos fundamentais. O primeiro deles é a destruição de RNAs oócito-específicos, que em geral se inicia ainda durante a maturação folicular. A destruição destes transcritos e das respectivas proteínas restringe seu período de atuação. Um exemplo é a proteína MSY2 (e o correspondente mRNA), que figura dentre as mais abundantes no oócito, mas já não é detectada em embriões de 2 células.Um segundo ponto fundamental da MZT diz respeito à substituição dos transcritos envolvidos em processos básicos de manutenção celular, como a actina. Os mRNAs de actina de origem materna são degradados em mais de 90% até o estágio embrionário de 2 células, entretanto, como esta é uma proteína fundamental para a sobrevivência celular, a degradação dos RNAs maternos é concomitante à produção de novos RNAs provenientes do genoma embrionário.O terceiro ponto é a extensa reprogramação do padrão de expressão gênica, através da ativação de genes que não são expressos no oócito. Todo este processo é coordenado, sobretudo, por remodelamento da cromatina, embora os fatores de transcrição maternos também sejam fundamentais.Foi demonstrado que inibidores da RNA polimerase II - responsável pela transcrição de RNAs mensageiros - interrompem as divisões mitóticas no embrião, mesmo na presença de transcritos e proteínas maternas. Esta observação demonstra que o correto prosseguimento da clivagem é dependente de transcrição no genoma embrionário. Por outro lado, alguns trabalhos já demonstraram que durante as primeiras divisões mitóticas, mesmo que alguns genes estejam sendo transcritos, somente os RNAs maternos são traduzidos. Em Schultz (2002) há uma extensa revisão sobre a expressão gênica anterior à ativação do genoma embrionário, sobretudo em embriões de apenas 1 célula.Também foi analisada a influência das proteínas leptina e STAT3 de oócitos de camundongos e humanos sobre o desenvolvimento embrionário inicial e a distribuição destas proteínas nas fases de mórula e blastocisto. A leptina tem papel fundamental no metabolismo e deposição de lipídeos, e STAT3 é membro de uma família de transdutores de sinais e ativadores de transcrição. Foi mostrado que estas proteínas se encontram polarizadas no oócito, e apresentam uma distribuição desigual nos blastômeros durante a fase de mórula, num padrão que se mantém nas etapas seguintes. Os autores sugerem que a distribuição destas proteínas no óvulo influencia sua expressão e distribuição nos blastômeros, e desta forma estaria envolvida na formação dos eixos / polaridade do embrião.
Ativação do genoma embrionário: criando identidade própria
No que diz respeito à ativação inicial do genoma embrionário, um dos principais questionamentos diz respeito a quais são os primeiros genes transcritos. Zeng & Schultz (2005) realizaram a análise de RNAs produzidos em embriões de camundongos de 2 células, estágio em que nesta espécie ocorre a MZT. Estes autores demonstraram que genes envolvidos na transcrição e metabolismo de RNAs, biossíntese e montagem de ribossomos e síntese de proteínas representam grande maioria entre aqueles identificados. Estes resultados sugerem que a ativação inicial do genoma embrionário se relacione principalmente à substituição de moléculas de origem materna por outras que possam sustentar o fluxo de informações gênicas a partir de então. De uma forma mais simples, esta ativação gênica inicial prepararia os blastômeros para controlar a expressão dos próprios genes (Zeng & Schultz, 2005) nas etapas seguintes.De acordo com outra linha de pensamento, dois principais pontos de alteração no padrão de expressão gênica ocorrem durante o desenvolvimento embrionário pré-implantação em camundongos. A transição de óvulo fertilizado para embrião de 2 células seria o primeiro destes momentos, e corresponde à ativação do genoma embrionário (ZGA - zygotic genome activation). A passagem de 4 para 8 células seria o segundo momento, e marca a passagem para as fases de mórula / blastocisto. Esta mudança no padrão de expressão gênica no estágio entre 4 e 8 células seria uma preparação para as enormes alterações morfológicas dos estágios seguintes, e consequentemente, para a diferenciação celular inicial. Através da análise de mais de 20.000 seqüências foram identificados genes expressos em cada fase do desenvolvimento embrionário pré-implantação, desde o óvulo fecundado até o blastocisto. Estes resultados apontaram cerca de 3.500 genes cuja expressão é aumentada durante a ZGA. Alguns deles, como Gata6 (membro de uma importante família de fatores de transcrição) e Rab1 (envolvido em tráfego intracelular) mantêm sua expressão em níveis constantes nos períodos subseqüentes. Outros, como gdf3 (um fator de crescimento / diferenciação celular, freqüentemente alterado em teratocarcinomas) e L-myc (um proto-oncogene envolvido em proliferação / diferenciação celular), têm seu pico de expressão nas fases de 2 e 4 células, e depois declinam. Entretanto, a maioria dos genes analisados não tem função conhecida, tornando difícil uma discussão acerca do papel de sua ativação no desenvolvimento embrionário. De forma geral, genes relacionados com ribossomos, complexos ribonucleoprotéicos, transporte de íons, metabolismo de ATP, ligação a RNA e proteassomas demonstraram um aumento contínuo na expressão durante todo o período pré-implantação.Uma meta-análise da expressão gênica em embriões de camundongos através do estudo de bibliotecas de cDNA, desde o óvulo fertilizado até a fase de blastocisto. permitiu a identificação de mais de 11.000 genes expressos durante o desenvolvimento pré-implantação, dos quais mais de 1.500 não são expressos em qualquer outro tipo celular. Os autores não se prendem à descrição dos genes analisados, mas apresentam em uma tabela os dados referentes à abundância de transcritos provenientes de vários destes genes em cada etapa do desenvolvimento embrionário. Desta forma, através deste trabalho é possível avaliar a variação da expressão destes genes ao longo do desenvolvimento pré-implantação.
Genes envolvidos no controle do ciclo celular
As MAP quinases (MAPK - mitogen-activated protein kinases) representam uma família de proteínas que regulam o ciclo celular através da fosforilação / ativação de outras proteínas. Uma vez que cascatas de sinalização mitogênicas são deflagradas, as MAPK são translocadas do citoplasma para o núcleo e passam a regular a ligação de fatores de transcrição ao DNA. A superfamília gênica MAPK compreende pelo menos três subgrupos envolvidos em cascatas de sinalização celular: as quinases c-Jun (ou quinases ativadas por estresse), as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERK - extracellularly-regulated kinases) e os grupos p38 e p45 de MAP quinases.Natale et al. (2004) demonstraram que membros da família MAPK p38 são expressos durante todo o desenvolvimento pré-implantação, e que a inibição de p38 causa o bloqueio do desenvolvimento embrionário, sobretudo devido à regulação da formação de filamentos de actina no estágio de 8 células. Sabe-se que p38 α e β regulam um grupo de proteínas designadas PRAP ou MK5, que por sua vez ativam a proteína HSP27 (do grupo das chamadas proteínas de choque térmico), que finalmente regula a formação de filamentos de actina. Desta forma, p38 seria um dos ativadores iniciais de uma importante cascata envolvida na compactação e no desenvolvimento do embrião pré-implantação.Diversos trabalhos analisaram a expressão de genes envolvidos no processo de apoptose - ou morte celular programada - por embriões no período pré-implantação, e sua correlação com o bloqueio no desenvolvimento de alguns destes embriões. A análise da expressão de um gene mitocondrial que codifica uma proteína chamada Smac/DIABLO, mostrou que durante a apoptose ela é liberada para o citoplasma e bloqueia a atividade de proteínas anti-apoptóticas. Isso permite a ativação de proteínas como as caspases, características do processo de apoptose. Tanto o mRNA de Smac/DIABLO quanto a própria proteína foram detectados em oócitos e embriões pré-implantação de camundongos. Entretanto, a liberação de Smac/DIABLO para o citoplasma foi observada em embriões que se tornaram naturalmente fragmentados e naqueles em que a apoptose foi induzida. Estes resultados sugerem que esta proteína está envolvida na fragmentação e bloqueio do desenvolvimento de embriões pré-implantação.A expressão de outros genes relacionados à manutenção do ciclo celular e à apoptose, como BRCA1 E 2, ATM, TP53, RB1, MAD2, BUB1, APC e β-actina, foi analisada em embriões pré-implantação. Em geral, estes genes são responsáveis por manter a integridade do DNA e o correto prosseguimento do ciclo celular e, quando mutados, são responsáveis por grande parte dos cânceres humanos. Alguns autores defendem a idéia de que a proporção de genes antie pró-apoptóticos expressos é responsável pela regulação do desenvolvimento embrionário. De forma geral, mRNAs correspondentes a estes genes foram observados em oócitos não fertilizados e intensamente degradados após a fertilização. Após o estágio de 4 a 8 células estes transcritos voltaram a ser produzidos, em concordância com a ativação do genoma mitocondrial, e a maioria deles teve seu pico de expressão apenas no estágio de blastocisto. Sugere-se que a rápida proliferação celular durante a fase de clivagem propicie a ocorrência de lesões no DNA, e a expressão destes genes nesta fase garantiria a manutenção de sua integridade. Jurisicova & Acton (2004) apresentam uma extensa revisão sobre o papel de genes relacionados a apoptose no desenvolvimento de embriões humanos pré-implantação.
Efeitos do cultivo in vitro sobre a impressão genômica
Da mesma forma que a ativação de determinados genes é fundamental para o perfeito desenvolvimento celular, a inativação de determinadas regiões do DNA também é uma importante forma de controle da expressão dos genes presentes nestas regiões. Neste sentido, alterações epigenéticas, ou seja, causadas por fatores não-genéticos, podem afetar o correto funcionamento do DNA, sobretudo no que diz respeito ao imprinting genômico (ou impressão genômica), um fenômeno genético que determina se um gene específico será expresso ou não de acordo com sua origem parental. Desta forma, a regulação de vários genes presentes no genoma passa pela inativação de seu alelo materno ou paterno através deste processo. O processo de impressão genômica é regulado através do padrão de metilação do DNA, associado à organização das histonas. Durante a fertilização, o DNA do espermatozóide é demetilado e suas protaminas (proteínas responsáveis pela condensação de seu DNA) são substituídas por histonas. Posteriormente, durante o desenvolvimento embrionário préimplantação, ocorre uma completa reorganização no padrão de metilação e na organização das histonas no genoma embrionário, originando o padrão de impressão (imprinting) necessário ao perfeito desenvolvimento do indivíduo.Resultados semelhantes obtidos em camundongos, bovinos e humanos demonstraram que alterações epigenéticas no padrão de impressão genômica dos embriões resulta em crescimento fetal aberrante, além de outros efeitos de longo prazo no desenvolvimento e comportamento dos indivíduos. Muitas evidências mostram que o cultivo de embriões in vitro é um dos fatores que altera o padrão de impressão genômica e desta forma pode causar alterações fenotípicas a curto e longo prazo. Muitos trabalhos têm demonstrado que embriões cultivados em meios suplementados com soro apresentam expressão anormal de genes “impressos” (imprinted). Uma extensa revisão a respeito dos efeitos epigenéticos do cultivo de embriões in vitro pode ser encontrada Morgan et al. (2005).
Regulação molecular da formação de blastocistos
Foi analisada a expressão de GnRH e receptores de GnRH em embriões humanos pré-implantação. A presença de GnRH já foi demonstrada em diferentes espécies, e acredita-se que também em embriões humanos ele apresente um importante papel no desenvolvimento e na implantação. O que ficou demonstrado é que tanto os mRNAs quanto as proteínas correspondentes a estes genes são detectados em todos os blastômeros até a fase de mórula, e também nas células do trofoectoderma e na massa celular interna. Entretanto, pode-se argumentar que estes dados podem não ser representativos de condições normais, uma vez que os embriões analisados neste estudo derivavam de poliespermia, apresentando 3 pró-núcleos. Alguns autores defendem a hipótese de que exista um blastômero destinado a originar o trofoectoderma, e para tanto este blastômero possuiria grandes quantidades das proteínas leptina e STAT3 maternais e altos níveis de beta-HCG e beta-LH embrionários.Diversos trabalhos descrevem o papel de um gene chamado Ped - preimplantation development - que codifica a proteína QA-2, um MHC de classe I envolvido na regulação do desenvolvimento embrionário inicial e sobrevivência do embrião. Este gene possui dois alelos, chamados Ped-fast e Ped-slow. O alelo Ped-fast é dominante e leva à produção de QA-. Embora não se saiba exatamente ainda qual é a função desta proteína, foi observado que embriões de camundongos homozigotos para este alelo se desenvolvem a uma velocidade consideravelmente maior e apresentam melhores taxas de sobrevivência durante a gestação, em comparação a embriões homozigotos Ped-slow, que não produzem QA-2.A expressão do gene hipoxantina fosforibosil-transferase (HPRT) foi investigada em embriões humanos em diferentes fases do desenvolvimento pré-implantação e os dados obtidos foram correlacionados com o sexo dos embriões. O gene HPRT, ligado ao cromossomo X, é responsável pela manutenção de funções celulares básicas (house-keeping), e alterações neste gene estão relacionadas à síndrome de Lesch-Nyhan. Foi observado que, em embriões de quatro células os níveis de mRNA de HPRT decaem cerca de cinco vezes em relação àqueles observados nos oócitos não-fertilizados, sugerindo um intenso mecanismo de destruição pós-fertilização. Até o segundo dia após a fertilização não foram observadas diferenças entre embriões masculinos e femininos, entretanto, no terceiro dia os níveis de HPRT eram consideravelmente maiores nos embriões femininos do que nos masculinos. Esta diferença nos níveis encontrados entre embriões de diferentes sexos é relacionada ao fato de ambos os cromossomos X ainda estarem ativos nos embriões femininos nesta fase. De acordo com os autores, estes resultados sugerem que a inativação do cromossomo X nas células femininas ocorra por volta do estágio de 8 células do desenvolvimento embrionário (Latham, 2005).A expressão dos receptores TGFβ (transforming growth factor) tipos I e II, e as proteínas Smad 2 e 3 foi analisada em diferentes fases do desenvolvimento embrionário préimplantação. Foi demonstrado que altos níveis de TGFβ no fluido folicular estão relacionados ao aumento do número de células em embriões de camundongos, numa interação mediada por receptores de TGFβ presentes na membrana do oócito e do embrião pré-implantação. Os receptores de TGFβ atuam em sua porção intracelular fosforilando as proteínas da família Smad, envolvidas em sinalização intracelular. Foi observado que embriões de 4 e 8 células possuem as proteínas Smad 2 e 3, mas não os receptores de TGFβ. Entretanto, no estágio de blastocisto tanto as proteínas Smad quanto os receptores de TGFβ tipos I e II são expressos. Por outro lado, demonstrou-se que fêmeas de camundongos expressam os receptores tipo I e II de TGFβ no oviduto e no útero, e também os embriões, desde o estágio de 1 célula até o de blastocisto. Foi demonstrado também que o próprio TGFβ é expresso em embriões de camundongos a partir do estágio de 2 células, aumentando gradualmente até o estágio de 8 células e decaindo após o estágio de mórula.O gene Oct-4 (também conhecido como OCT-4, OCT-3, OCT- 3/4, POU5FI, OTF3 OU NF-A3) codifica um fator de transcrição associado à manutenção da totipotência pelas células do. Em humanos, a proteína OCT-4 é codificada pelo gene OTF3, e é expressa em todos os estágios do embrião pré-implantação. Em blastocistos, a expressão de OCT-4 foi demonstrada no trofoectoderma, e em maiores níveis, na massa celular interna. A partir da análise de mais de uma centena de oócitos e embriões pré-implantação em diferentes fases do desenvolvimento, foi observado que em oócitos e embriões em fase de clivagem a expressão de OCT-4 é variável, e a localização da proteína é essencialmente citoplasmática. Entretanto, após a compactação, a expressão se estabiliza e a proteína passa a ser detectada no núcleo, indicativo de atividade biológica. Além disso, alguns autores sugerem que exista uma variação na localização das isoformas de OCT-4 em diferentes pontos da célula, sugerindo que elas apresentem diferentes funções.Uma importante classe de genes expressos em todos os tipos celulares dos mais variados organismos são as heat shock proteins (HSPs) ou proteínas de choque térmico, responsáveis por garantir que outras proteínas adquiram sua exata conformação. Embora não haja muitos dados acerca da expressão de HSPs em embriões pré-implantação, expressão espontânea de hsp70 foi observada em camundongos no momento da ativação do genoma embrionário, e novamente nos estágios de mórula e blastocisto inicial.Outra questão fundamental para o desenvolvimento embrionário pré-implantação e que está diretamente relacionada a alterações na expressão de determinados genes, diz respeito ao metabolismo energético. Sabe-se que até o estágio de duas células, embriões de mamíferos são capazes de utilizar apenas o piruvato como fonte de energia. Após este estágio, passam a ser capazes de utilizar também o lactato, e somente após o estágio de 8 células os embriões humanos se tornam capazes de metabolizar a glicose. Esta restrição nas vias de produção de energia nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário se deve à não expressão de genes envolvidos no metabolismo da glicose nas primeiras fases do desenvolvimento. Johnson et al. (1997) analisaram a expressão de genes para hexoquinase (HX) e glicose-fosfato isomerase (GPI) em embriões de camundongos nos estágios de mórula e blastocisto. A HX catalisa o primeiro passo enzimático da glicólise, utilizando ATP para converter a glicose em glicose-6-fosfato, e transcritos referentes a este gene já foram detectados em todos os estágios do desenvolvimento de embriões de camundongos pré-implantação. A enzima GPI realiza o segundo passo da glicólise, e converte a glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato. Portanto, a expressão destes genes é fundamental para a conversão de células dependentes de piruvato em células capazes de utilizar a glicose como fonte de energia. Foi descrito um aumento na população de mRNAs para hexoquinase no estágio de blastocisto, enquanto os níveis de glicose-fosfato isomerase se mostraram equivalentes entre os dois estágios. Outros trabalhos já demonstraram que os níveis destas enzimas atingem seu pico de expressão durante a fase de blastocisto.
Polarização e cavitação
Processos como polarização, formação de junções celulares e transporte de íons e água são fundamentais para a formação do blastocisto, e diversas famílias gênicas parecem estar envolvidas nesta etapa do desenvolvimento embrionário (Watson et al., 2004). Alterações morfológicas ocorridas na compactação, durante a qual os blastômeros se tornam extremamente justapostos, foram correlacionadas à expressão de genes envolvidos na formação de junções celulares como as caderinas, proteínas de membrana responsáveis pela formação de junções aderentes. A porção intracelular destas proteínas interage com as cateninas α e β, que por sua vez interagem com o citosqueleto, permitindo desta forma uma forte ligação entre células vizinhas. Foi demonstrado que a E-caderina, e as cateninas α e β, assim como a actina, parte fundamental do citosqueleto, são estocadas em oócitos de camundongos, e por isso estão presentes no embrião recém-formado. Entretanto, a formação de junções celulares mediadas por E-caderina ocorre apenas a partir do início da compactação. Um possível mecanismo para explicar este controle na formação das junções aderentes se refere à atuação de inibidores da interação E-caderina / β-catenina, como o fator IQGAP, que pode também se ligar a Cdc42. Natalie et al. (2004) analisaram a expressão destes genes em embriões de camundongos no período pré-implantação, e observaram que tanto os mRNAs quanto as proteínas estão presentes durante todas as fases, entretanto, uma alteração importante na distribuição de IQGAP é observada durante a compactação. Sugere-se que durante as primeiras fases da clivagem IQGAP pode estar ligado à β-catenina, impedindo a formação das junções aderentes. Quando se inicia a compactação Cdc42 se torna ativo, inativando IQGAP e permitindo a adesão celular via E-caderinas (Natale et al., 2004. Watson et al., 2004). Alguns autores realizaram um extenso trabalho de identificação de genes codificantes de moléculas de adesão expressos nas diferentes fases do desenvolvimento embrionário pré-implantação, e entre outros dados, identificaram RNAs expressos apenas na fase de blastocisto.No que diz respeito à formação da blastocele, uma hipótese defendida por muitos autores diz respeito ao papel do fluxo de íons e de água durante a cavitação. Acredita-se que logo após a compactação as células mais externas do embrião incrementam as junções entre elas, sobretudo as do tipo ocludente, e modificam também seu sistema de transporte de íons, a fim de dar início à formação do blastocisto. Sugere-se que neste momento a bomba de sódio e potássio exerça um papel fundamental (Watson et al., 2004).A bomba de Na+/K+ está presente na membrana plasmática de todas as células, e é responsável pelo transporte ativo de íons Na+ e K+ através da membrana, originando um gradiente iônico e eletroquímico entre os meios intra e extracelular. Duas subunidades protéicas, uma α e uma β, formam a unidade funcional mínima para o funcionamento da bomba de sódio e potássio. Existem pelo menos quatro isoformas da subunidade α e três da subunidade β, e a maioria dos trabalhos associa a expressão dos genes que codificam estas subunidades com a atividade da bomba de sódio e potássio.Foi demonstrado que em embriões de camundongos a expressão da Na+ e K+ ATPase está confinada ao domínio basolateral do trofoectoderma. A partir destes dados, investigou-se a hipótese de que esta polarização da enzima criaria um gradiente iônico através do trofoectoderma, gerando uma força osmótica que causaria um fluxo de água para a região mais interna do embrião. A combinação deste fluxo osmótico com a formação das junções ocludentes formadas entre as células periféricas levaria à formação e expansão da cavidade do blastocisto (cavitação). Dados obtidos por outros autores corroboram esta hipótese, afirmando que um aumento na atividade da bomba de sódio e potássio durante a formação do blastocisto ocorre em todas a espécies de mamíferos analisadas. Em embriões humanos este aumento pode chegar a 60% na fase inicial de desenvolvimento do blastocisto.Entretanto, outros trabalhos demonstraram que o gradiente osmótico existente através do trofoectoderma de embriões de coelhos não seria suficiente para sustentar a difusão do volume de água necessário à cavitação. Por este motivo, alguns autores defendem também um importante papel para as aquaporinas (poros que permitem a passagem de água pela membrana) neste processo, as quais facilitariam o fluxo de água através das células. Foi mostrado que cerca de sete diferentes RNAs mensageiros para aquaporinas estão presentes durante o desenvolvimento pré-implantação em embriões de camundongos. Apesar dessa discussão, é bastante razoável supor que os processos descritos anteriormente atuem em conjunto, a fim de propiciar a correta formação da cavidade embrionária.Além da análise geral de genes expressos durante a formação de blastocistos, muitos trabalhos buscam ainda identificar particularidades na expressão gênica de cada tipo celular presente nesta fase do desenvolvimento: as células-tronco embrionárias (ESC - embryonic stem cells), as células-tronco do trofoblasto (TSC - trophoblast stem cells) e as células do endoderma extraembrionário (XEN - extraembryonic endoderm).Ralston & Rossant (2005) revêem os principais pontos da regulação gênica envolvida na formação destes tipos celulares. De acordo com estes autores, que utilizam dados descritos para embriões humanos e de camundongos, apesar de já apresentarem um pequeno grau de diferenciação, uma vez que expressam conjuntos de genes diferentes, estes tipos celulares são intercambiáveis, através de manipulação genética. Além da cavitação, descrita anteriormente, os autores argumentam também que um segundo ponto importante na origem dos blastocistos é a diferenciação da massa celular interna em epiblasto e endoderma primitivo.Demonstrou-se que o gene do fator de transcrição Oct4 (Oct3/4 ou Pou5fl) é expresso por todos os blastômeros até a fase de blastocisto, quando sua expressão se torna restrita à massa celular interna. Além disso, embriões de camundongos nocauteados para Oct4 originam apenas células do trofoectoderma, demonstrando que este gene é requerido para a formação da massa celular interna. Também foi demonstrado que Oct4 é expresso em células-tronco embrionárias, mas não em célulastronco do trofoblasto e células do endoderma extraembrionário. Por outro lado, genes como Cdx2 são expressos apenas em células-tronco do trofoblasto. Um modelo defendido por alguns autores sugere que a atividade mutuamente antagonista de Oct4 e Cdx2 define o destino das células-tronco embrionárias (massa celular interna) e do trofoblasto.A partir deste ponto, outros dois genes parecem regular a diferenciação da massa celular interna em endoderma primitivo e epiblasto. O gene Nanoc codifica um fator de transcrição que define a formação do epiblasto, enquanto o gene Gata6 codifica um fator de transcrição expresso no endoderma primitivo dos blastocistos. Sugere-se que Gata6 tenha um papel tardio no desenvolvimento do endoderma extra-embrionário, e embora haja ainda alguma controvérsia, parece não haver dúvidas de que Nanog e Gata6 são responsáveis pela determinação das linhagens celulares do epiblasto e do endoderma primitivo do blastocisto.Ralston & Rossant (2005) discutem ainda a possibilidade de interconversão entre estes tipos celulares, sobretudo através da manipulação da expressão destes genes, conforme já foi demonstrado em diversos trabalhos.
Genes e hatching
O hatching é uma etapa fundamental do desenvolvimento embrionário, e marca a preparação final do embrião para a implantação. Dada esta importância, avaliou-se o transcriptoma de blastocistos hatched e pré-hatched, com o objetivo de caracterizar o padrão de expressão gênica neste período. Os autores encontraram 85 genes cuja expressão é aumentada em blastocistos que já realizaram o hatching em relação àqueles que ainda não o fizeram. Estes genes possivelmente relacionados ao hatching incluem moléculas de adesão e migração celular, reguladores epigenéticos, reguladores de resposta a estresse e reguladores de resposta imune. São exemplos de alguns destes genes: caderina E, molécula de adesão celular neuronal (NCAM), lectina, Dnmt1, heme oxigenase, neutrofina, interleucina 4R e receptor-2 de interferon.
Considerações finais
Novos dados a respeito da expressão dos mais diversos genes durante o desenvolvimento de embriões pré-implantação são freqüentemente disponibilizados na literatura científica. Manter-se atualizado em relação a estes dados e analisá-los de forma crítica, buscando a correlação entre eles não é tarefa simples. Entretanto, é a partir do estudo da expressão gênica através dos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário que poderemos montar o quebra-cabeças genético que propicia a formação de células-tronco, e a longo prazo, de um novo indivíduo. A solução deste quebra-cabeças requer ainda grande empenho de estudo e pesquisa através da engenharia genética, e o uso e desenvolvimento de técnicas como microarray poderão ser de grande valia.
Mas certamente quando estas respostas forem conhecidas, novos e fascinantes horizontes se abrirão para a medicina através da manipulação genética celular, que permitirá entre outras coisas, produzir células-tronco para um vasto leque de usos terapêuticos. E mais do que tratar da manipulação genética, consideradas as implicações éticas desta abordagem em embriões humanos, o conhecimento de seus padrões de expressão gênica tornará possível que se avalie seu desenvolvimento molecular, permitindo-nos saber se determinadas células são geneticamente sadias e de boa qualidade.
Finalmente, tendo em vista o grande volume de informações contido neste estudo, os autores se colocam à disposição para enviar àqueles que se interessarem uma tabela com um resumo das informações aqui descritas, bem como a lista completa com as 97 referências bibliográficas consultadas.
4. Levy, R. Genetic regulation of preimplantation embryo survival. Int Rev Cytol. 210:1-37. 2001.