JBRA Assist. Reprod 2006;10(4):30-33
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2006.10.4.06
1Biogenecs - Centro Avançado em Biologia Molecular e Genética Forense
2Invitrogenese - Biologia do Desenvolvimento e Reprodução Assistida
3Centro de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina do ABC
4Clinimater - Reprodução Humana
5Criogenesis - Biotecnologia e Terapia Celular
RESUMO
Durante os últimos trinta anos diversos métodos de criopreservação de gametas, embriões e tecidos germinativos foram desenvolvidos cujo principal objetivo é preservar a fertilidade.A metodologia aplicada a criopreservação de oócitos ainda é considerada experimental. Contudo, os resultados positivos nos dão esperança de que dentro em breve esta metodologia será empregada rotineiramente nos serviços de Reprodução Humana.A proposta deste artigo é discutir do ponto de vista biológico, as novas abordagens da criopreservação de oócitos em relação aos métodos existentes e ressaltar a importância do profissional cada vez mais capacitado e o emprego da criobiologia como ciência.
Key Words: slow cooling, cryopreservation, oocytes, vitrification
INTRODUÇÃO
Durante os últimos trinta anos diversos métodos de criopreservação de oócitos, embriões, sêmen e tecidos germinativos foram desenvolvidos cujo principal objetivo é preservar a fertilidade (Elliott e Whelan, 1977; Leibo, 1986; Mazur, 1990; Shaw e Jones, 2003; Vajta e Kuwayama, 2006), mas pelo fato de nem sempre apresentarem resultados satisfatórios os investimentos no campo da criobiologia em reprodução humana, foram deixados em segundo plano (Vajta e Kuwayama, 2006).
Os processos de criopreservação podem ser facilmente implantados na rotina clínica após um curto treinamento sem a necessidade da compreensão biológica dos fenômenos envolvidos (Vatja e Kuwayama, 2006). Contudo, com o progressivo desenvolvimento tecnológico no campo da biotecnologia reprodutiva, sofisticação dos meios de cultivo de embriões e produtos comercialmente disponíveis, este quadro esta mudando.
Vatja e Kuwayama (2006) em recente revisão da literatura vislumbram o surgimento de uma nova era nas tecnologias envolvendo criopreservação de oócitos e embriões de mamíferos. Além disso, acreditamos também que os processos de criopreservação poderão ser utilizados de forma cada vez mais otimizada, não só para armazenar gametas e embriões excedentes, mas também para criopreservar tecidos germinativos, (fragmentos ovarianos e epitélio germinativo masculino) células tronco de origem embrionária e de cordão umbilical, estas células poderão ser utilizadas em programas terapêuticos no futuro não muito distante.
A proposta deste artigo é discutir as novas abordagens da criopreservação de oócitos em relação aos métodos existentes e realçar a importância do profissional cada vez mais capacitado e o emprego da criobiologia como ciência, aplicada na rotina das clínicas de Reprodução Assistida.
CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS
Em 1986 foi reportada a primeira gravidez após criopreservação de oócito maduro (Chem, 1986). Desde então, a metodologia que, ainda é considerada experimental, vem oferecendo resultados cada vez mais promissores.
Do ponto de vista biofísico sabe-se que todos os oócitos e embriões (incluindo os espermatozóides) sofrem um considerável dano morfológico e funcional durante o processo de criopreservação. A extensão destas crioinjurias depende de fatores que incluem o tamanho e a forma das células, a permeabilidade das membranas, qualidade e sensibilidade do oócito e embrião a baixas temperaturas.
Todos estes fatores são extremamente variáveis e dependem do estágio de desenvolvimento embrionário e se estes foram originados in vitro ou in vivo e são tidos como espécie-específicos, (Vatja e Kuwayama, 2006).
Independentemente da fase de criopreservação (gametas, pró-núcleo, fases de clivagem - D2, D3 ou Blastocisto), as células que são submetidas a grandes variações de temperatura, têm seu potencial de vida diminuído em relação às células que não são submetidas aos processos de criopreservação.
A preservação de células germinativas ou embriões a temperaturas inferiores a -196 oC sofrem um grande estresse. Este estresse pode ser osmótico ocorrendo durante o processo de desidratação, efeitos da toxicidade das soluções crioprotetoras e os eventuais danos que estes causam nas membranas celulares, sem contar com a formação de cristais de gelo que também interferem na integridade das membranas celulares. Estes danos gerados nas membranas acarretam na perda de função do sistema de transporte intracelular, alterando a regulação do pH intracelular ou em casos mais severos as membranas das mitocôndrias podem ser afetadas acarretando em distúrbios no processo de fosforilação oxidativa, fenômeno essencial para a captação de energia das células na fase de desenvolvimento pré-implantacional (Lane et al., 2002).
Segundo Lane et al., 2002 a criopreservação pode também aumentar as taxas de peroxidação lipídica pelo aumento nos níveis de espécies reativas de oxigênio como radicais hidroxila e ânions superóxidos.
Atualmente a criopreservação de oócitos humanos representa uma opção atrativa para os tratamentos de infertilidade e pacientes jovens que irão ser submetidas a quimio ou radioterapia. Contudo, a criopreservação de oócitos ainda é uma metodologia experimental e os oócitos em metáfase II criopreservados, também são susceptíveis aos danos originados pelo resfriamento e reaquecimento.
Podemos observar diferentes formas de alterações nos oócitos como, por exemplo: danos ao fuso meiótico e instabilidade dos cromossomos de se ligarem ao fuso (Pickering et al., 1990; Hardy et al., 2002).
Além disso, os mecanismos da citoarquitetura envolvidos com a extrusão dos corpúsculos polares, migração dos pró-núcleos e a citoquinese ficam comprometidos com as metodologias atualmente empregadas (Gook, et al., 1993; Fabbri et al., 2001). Durante as etapas de resfriamento, seja por protocolos lentos ou ultra-rápidos podem ocorrer fraturas na zona pelúcida e reação cortical prematura (Trounson e Kirby, 1989).
Atualmente, a grande questão da criopreservação de oócitos humanos é a sua taxa de sobrevivência e as diferentes metodologias empregadas para criopreservar oócitos humanos (Fabbri et al., 2001). A literatura postula que as taxas de sobrevida dos oócitos em metáfase II estão acondicionadas a temperaturas ultrabaixas podendo ser afetados morfologicamente e biofisicamente. Entre os fatores morfológicos a controvérsia gira em torno de se criopreservar os oócitos na presença ou ausência das células do cúmulos. Às células do cúmulos é atribuída propriedade protetora aos agentes criopreservantes. Por outro lado, pouco se sabe sobre a ação benéfica de criopreservar os oócitos desnudados ou não (Mandelbaum et al., 1988; Gook et al., 1993; Fabbri et al., 2001).
Do ponto de vista biofísico, o principal fator que afeta a conservação dos oócitos é a formação de cristais de gelo que podem perfurar as membranas causando a lise celular (Fabbri et al., 2001; Shaw e Jones, 2003). Pelo fato do oócito ser a maior célula do corpo humano, é a que contém o maior volume de água, o que requer maior tempo de exposição aos agentes criopreservantes até que o balanço osmótico adequado seja atingido durante o processo de desidratação imposto ao oócito (Fabbri et al., 2001).
O PROCESSO FÍSICO-QUÍMICO DA CRIOPRESERVAÇÃO: CONGELAMENTO LENTO E CONGELAMENTO RÁPIDO (VITRIFICAÇÃO)
A maioria das soluções crioprotetoras utilizadas tanto para embriões como para oócitos são feitas em meios fisiológicos onde é adicionado um ou dois agentes crioprotetores permeáveis às membranas celulares, que são responsáveis pela troca das moléculas de água que estão ligadas a proteínas essenciais como: DNA, RNA, proteínas de membranas, entre outras, importantes para manter a viabilidade celular, um agente não permeável, geralmente um açúcar, que auxilia na desidratação celular antes e durante o resfriamento celular e proteína que aumentam a estabilidade das membranas, assim como o açúcar, e diminuem a toxicidade dos agentes crioprotetores (Shaw e Jones, 2003).
Os principais crioprotetores permeáveis de membranas utilizados entre outros são: Dimetil Sulfóxido (DMSO), Glicerol, etileno glicol, propileno glicol e acetamida (Rall et al., 1987; Shaw e Jones, 2003; Pedro et al., 2005). Os açúcares mais comumente associados às soluções crioprotetoras são: a sacarose, frutose e trealose e as proteínas são: a albumina sérica humana ou bovina (fração V) e Soro Sintético Substituto ou Soro Fetal Bovino / Humano para mamíferos em geral (Carroll et al., 1993). Outros elementos como álcool polivinil (PVA) e o Ficol também podem ser adicionados as soluções crioprotetoras (Shaw e Jones, 2003).
Os agentes crioprotetores permeáveis geralmente são tóxicos e podem causar um choque osmótico letal ao sistema. Não é fácil controlar este choque osmótico, uma vez que a semipermeabilidade seletiva da membrana que circunda a(s) célula(s) permite que a água, o crioprotetor e outros solutos entrem e saiam da célula em velocidades diferentes. Desta forma a maneira que o crioprotetor é carregado para o interior da célula é fundamental para a habilidade da célula tolerar o processo de desidratação e de modo genérico pode ser a explicação do porque utilizar protocolos de concentração gradual das soluções crioprotetoras ao invés de utilizar protocolos em uma etapa única de exposição a estes fatores (Shaw e Jones, 2003).
Quando oócitos ou embriões são retirados do meio de cultivo isotônico e colocados em soluções hipertônicas, contendo concentrações molares altas (1 ou 2 M) de crioprotetor, as células inicialmente encolhem rapidamente em resposta a alta osmolaridade extracelular e porque a velocidade de saída de água da célula é maior do que a permeação do crioprotetor para o interior da célula (Prudencio et al., 2005). Neste momento as células tendem a flutuar na gota onde se encontram e após 1 ou 2 minutos afundam novamente para o substrato da placa e podem-se observar alterações na forma, cor e granulação das células. Estas alterações morfológicas estão diretamente associadas com a viabilidade das células, aquelas células que não sofreram maiores modificações visuais, são as que têm maior potencial de sobrevivência. Classicamente o método de escolha da maioria dos centros de reprodução humana é o resfriamento lento ou equilibrado. Neste procedimento o crioprotetor é adicionado ao meio de cultivo ou a uma solução fisiológica e as células são resfriadas de acordo com seu tamanho e sua permeabilidade. Neste protocolo procura-se estabelecer o equilíbrio entre o tempo de resfriamento e as taxas de perda de água (desidratação) e as taxas de incorporação de água e formação de cristais de gelo. Para oócitos e embriões humanos acredita-se que a velocidade ótima de resfriamento esteja entre 0,3 a 2oC / minuto (Elliott e Whelan, 1977; Shaw e Jones, 2003; Gao e Critser, 2004).
Entre -4 e - 9 oC induz-se a formação do núcleo de gelo (“seeding”), que é a redução brusca de temperatura na periferia da solução que esta sendo resfriada (Foued et al., 1998) provocando a liberação de energia (em forma de calor) e consequentemente um aumento da temperatura na região central da solução, onde está a célula a ser criopreservada, permitindo desta forma, que a célula perca um pouco mais de água em detrimento a entrada de agentes crioprotetores ocasionado pelo aumento da osmolaridade da solução (Shaw e Jones, 2003). Após o “seeding” as células continuam sendo resfriadas até - 80 - 90 oC quando são transferidas para o nitrogênio líquido e estocadas a priore indefinidamente.
Alternativamente aos métodos de resfriamento lento ou equilibrado pode-se optar pelo processo não equilibrado de criopreservação denominados de congelamento rápido, ultra-rápido e vitrificação. Os protocolos de congelamento não equilibrados diferem do congelamento lento quanto ao processo de desidratação e permeação do crioprotetor que tem início antes do resfriamento das células e o processo de resfriamento celular que ocorre geralmente em um único passo, da temperatura ambiente a temperatura do nitrogênio líquido (-196 oC).
Tratando-se especificamente da metodologia de vitrificação que nada mais é do que um processo termodinâmico onde o aumento da viscosidade determina que os fluidos crioprotetores adquiram propriedades mecânicas de um sólido amorfo semelhante ao vidro, mantendo as propriedades físicas químicas do fluido, sem a formação de cristais de gelo e minimizando as lesões osmóticas, porém nesta técnica utiliza-se alta concentração de crioprotetores, que tem efeito tóxico (Rall e Fahy, 1985; Shaw e Jones, 2003).
A vitrificação pode ser obtida de duas formas: aumentando-se a velocidade da condução de temperatura no sistema e pelo aumento da concentração dos crioprotetores. Desta forma é possível alcançar um resfriamento muito rápido (na ordem de 15000 - 30000 oC / min - (Fahy et al., 1984; Martino et al., 1996; Arav e Zeron, 1997; Vajta et al., 1997).
Para que os danos biológicos sejam mínimos é necessária uma boa estratégia para passarmos rapidamente pela zona crítica de resfriamento (15 oC a - 5 oC) evitando as injurias por resfriamento (“chilling injuries”) (Liebermann et al., 2002).
Ao colocarmos as células direto no nitrogênio líquido (-196 oC,) este se encontra no ponto de ebulição. Quando as células são imersas no nitrogênio líquido ocorre um aumento da temperatura e ocorre um extensivo aumenta da ebulição produzindo vapor que envolve as células. Este vapor de nitrogênio líquido acaba tendo um papel isolante, diminuindo a transferência de temperatura que resulta na diminuição da taxa de resfriamento e aumentando o risco de formação de cristais de gelo (Liebermann et al., 2002).
Por outro lado, para atingirmos taxas de resfriamento maiores, é melhor que a transferência de temperatura ocorra através do líquido ao invés do vapor de N2, uma vez que a condutividade na forma liquida é maior que no vapor (Liebermann et al., 2002). Oócitos criopreservados em nitrogênio líquido apresentando temperaturas abaixo do ponto de ebulição (- 200 - 205 ºC) apresenta melhores resultados (Shaw e Jones, 2003; Vatja e Kuwayama, 2006).
A maioria dos protocolos diretos de criopreservação pode ser realizada sem grandes infra-estruturas ou equipamentos sofisticados, a baixo custo, onde é possível trabalhar tanto com o nitrogênio na forma de vapor ou na forma líquida. Contudo, pesquisas sugerem que trabalhar com a forma viscosa do nitrogênio (“nitrogen slush”) poderia ser ainda mais eficiente, uma vez que as taxas de resfriamento seriam ainda maiores do que nas formas descritas acima (Shaw e Jones, 2003).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O congelamento rápido e a vitrificação podem ser uma boa escolha para um serviço de referência em Reprodução Humana quando comparados aos métodos de criopreservação utilizando protocolos lentos, exclusivamente pelo fato da técnica ser de baixo custo financeiro e apresentarem resultados satisfatórios. Sabe-se que o no processo de vitrificação não ocorre à formação de cristais de gelo e as injurias causadas pelo resfriamento também são minimizadas (Liebermann et al., 2002).
A publicação do primeiro nascido vivo a partir de oócitos criopreservados ocorreu há 19 anos (Chen, 1986; Van Uem et al., 1987), desde então, a cada ano os resultados estão sendo cada vez mais promissores. O aumento de mulheres que deixam para engravidar após os 35 anos ou mesmo aos avanços terapêuticos na cura do câncer exigem, profissionais cada vez mais capacitados para desenvolver tecnologias cada vez mais adequadas para obtermos oócitos viáveis após o descongelamento.
Recentemente foi descrita a técnica do Cryotop, cujos resultados descritos atingem 91% de sobrevida após descongelamento, 50% de blastocistos formados e 10 nascidos vivos após 29 transferências de embriões (Kuwayama et al., 2005; Vatja e Kuwayama, 2006). Além desta técnica outras são empregadas com o intuito de minimizar o contato do nitrogênio com os oócitos e os eventuais danos gerados, bem como a forma de carregar a “embalagem” onde serão armazenados os oócitos (palhetas de vidro, palhetas abertas e estiradas, crioloop, criotip e até mesmo grades utilizadas em microscopia eletrônica) foi e continua sendo empregadas (Liebermann et al., 2002; Shaw e Jones, 2003; Kuwayama et al., 2005; Vatja e Kuwayama, 2006).
Porcu et al., 1999, analisaram 1769 oócitos criopreservados em metáfase II, tendo como resultado taxas de sobrevivência de 54,1% pós descongelamento. Kuleshova e Lopata (2002) apontam uma taxa de nascidos vivos por oócito criopreservado variando entre 1 a 10% e mais recentemente Oktay et al., (2006) reporta em estudo de meta-análise taxas de 1,9 e 2,0% para nascidos vivos por oócito criopreservado por congelamento lento e vitrificação, respectivamente.
Em toda a literatura científica, até o presente momento, são relatados menos de 100 nascidos vivos utilizando oócitos criopreservados através das técnicas de congelamento lento e vitrificação (Oktay et al., 2006; Vajta & Nagy, 2006).
No Brasil a experiência em criopreservação de oócitos ainda é muito limitada. Contudo, resultados positivos foram apresentados por grupos de excelência em Reprodução Humana Assistida brasileiros. Estes grupos reportaram nascimentos de bebes saudáveis a partir de oócitos criopreservados. Independentemente da casuística, foram apresentados taxas de sobrevivência oocitária pós descongelamento, de fertilização, clivagem e taxas de gravidez significativas, demonstrando todo o potencial de desenvolvimento biotecnológico no campo da Reprodução Humana (Azambuja et al., 2005; Azambuja et al., 2006; Petraco et al., 2006; Fioravanti et al., 2006).
É necessário que os Centros de Reprodução Humana brasileiros invistam na área de embriologia clinica aplicada. O Embriologista Clínico não pode e não deve ser apenas um simples técnico de laboratório com excelente habilidade manual seguindo protocolos previamente estipulados. O conhecimento profundo do fenômeno biológico e suas implicações são fundamentais para alcançarmos resultados cada vez melhores para que o Brasil passe a gerar conhecimento ao invés de comprar tecnologia.
Além disso, o desenvolvimento de novos métodos e atividades de inovação tecnológica no campo da criobiologia e reprodução humana assistida se tornam necessário para desenvolvermos e implementarmos novos produtos ou processos tecnologicamente novos ou aperfeiçoados. Esta inovação tecnológica é um processo dinâmico que depende de investimento em recursos humanos que seguramente proporcionarão resultados cada vez melhores.
Chen C. - Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet, 1:884-886, 1986.
Gao D, Critser JK. - Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J;41(4):187- 96, 2000.