JBRA Assist. Reprod 2007;11(2):22-26
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2007.11.2.05
Serviço onde foi realizado o trabalho: Grupo de Pesquisa Anatomia Funcional do Aparelho Urogenital PUC Minas/CNPq
RESUMO
O artigo oferece uma atualização do presente estágio da tecnologia, praticabilidade e limites da criopreservação de espermatozóides humanos. Desta forma, a criopreservação de sêmen representa uma prevenção, uma opção concomitante aos pacientes oncológicos que necessitam de uma oportunidade de manter suas habilidades reprodutivas.
Palavras-chave: espermatozóides, criopreservação, infertilidade masculina.
ABSTRACT
This paper provides a review of the present state of technology, practicability, andlimits ofcryopreservation ofhuman spermatozoa. Thus cryopreservation of semen represents a preventive, concomitant therapeutic option in oncological patients that offers the chance to maintain reproductive abilities.
Key-words: spermatozoa, cryopreservation, male infertility.
HISTÓRICO
As primeiras abordagens práticas de congelamento de sêmen remontam ao século XVIII, através de Spallanzani em 1776 (Nieschlang & Behre, 1997), com observações sobre a sobrevivência de espermatozóides em baixas temperaturas. Quatrafages, em 1853, já se preocupava com a preservação da viabilidade dos gametas de peixes, investigando métodos alternativos para tal procedimento. Mantegazza, em 1866, sugeriu que os espermatozóides poderiam ser congelados para utilização futura como bancos de sêmen (Sherman, 1986). Jahnel(1938) in Holtz (2000) mostrou a capacidade de armazenamento de espermatozóides à temperatura de - 79 °C. Shettles (1940) in Holtz (2000) indicou a existência de variações individuais perceptíveis após o descongelamento. Pesquisas de Parkes (1945) mostraram sucesso na criopreservação de grandes volumes de sêmen (Polge et al., 1949).
É geralmente aceito, contudo, que Christopher Polge, Audrey Smith e Alan Parkes (Polge et al., 1949) foram os primeiros cientistas a demonstrar a possibilidade de se utilizar, de modo reproduzível, tecnologia de criopreservação de sêmen, mostrando, inclusive, que o glicerol tem interessantes e peculiares propriedades como meio crioprotetor. Bunge & Sherman (1953) propuseram a técnica de gelo seco para o armazenamento de espermatozóides visando uso futuro. A técnica do vapor de nitrogênio líquido introduzida por Sherman no início dos anos 60 ainda continua a ser largamente empregada (Verheyen et al., 1993). Assim, o congelamento com velocidade lenta e controlada tornou-se o método de escolha para a criopreservação do sêmen permitindo efetiva e uniforme desidratação celular e evitando a formação de cristais intracelulares (Gilmore et al., 2000).
Sherman, em 1964, identificou padrões de toxicidade para o dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotetor. Ackerman em 1968, citado por Sherman (1986) mostrou as repercussões do choque térmico no congelamento e descongelamento. Matheson (1969) in Waites et al. (1997) consolidou a palheta de plástico como recipiente adequado para criopreservação e conseqüente armazenamento de sêmen.
PARÂMETROS SEMINAIS RELEVANTES
Coleta de sêmen
Com abstinência sexual de 2 a 5 dias, o sêmen pode ser coletado mediante automanipulação do pênis. É a técnica mais utilizada. Devido à possibilidade de contaminação, a coleta de sêmen deve ser realizada após lavagem e higienização das mãos. Tudo isso, deverá ser observado para a aquisição de material adequado para determinação dos parâmetros seminais e criopreservação do sêmen. A coleta deve ser feita em frascos de material atóxico ou vidro graduado, todos estéreis. A prática do coito interrompido pode contaminar a amostra, bem como ocorrer perda de fração do ejaculado (Rowe et al., 2000).
Volume de sêmen
O volume de sêmen é um dos parâmetros mais oscilantes no estudo da reprodução humana. A técnica de obtenção de espermatozóides, o estímulo ejaculatório são fatores determinantes do volume obtido. Coletas fracionadas consecutivas tendem a proporcionar redução do volume de sêmen.
Concentração espermática
A determinação do número de espermatozóides liberados é um dos principais parâmetros utilizados na avaliação de sua viabilidade e na capacidade de se interagir com um número expressivo de óvulos, sendo fator determinante na eficácia do processo reprodutivo. Por isto, a estimativa do número de espermatozóides/mL de sêmen é um passo importante no processo de criopreservação (Waites et al., 1997).Diversas metodologias de avaliação da concentração espermática foram relatadas ao longo dos anos pela literatura, ou seja, em câmara de Neubauer, espermatócrito ou por avaliação espectrofotométrica (Berkson, 1940; Freud & Carol, 1964; Ganon et al., 1966; Dacie & Lewis, 1984). O método ideal deveria fornecer maior acuracidade da concentração espermática, além de rápida aferição e diluições menores. Por último, a câmara de Makler foi introduzida na estimativa da concentração espermática.
Câmara de Makler
Formada por dois discos de vidro, horizontais e transparentes apoiados um ao outro através de quatro pontos de alta resistência com uma camada de quartzo que evita desgaste, se constitui em uma câmara especialmente desenvolvida para aferição da concentração espermática. Apresenta uma tampa com um quadrado de 1 mm2 subdividido em 100 quadrículas de 0,1 por 0,1 mm. A contagem de espermatozóides situados em 10 quadrículas da câmara equivale ao número de espermatozóides em unidade de milhões. Esta câmara apresenta profundidade de 10 μm, o que permite observação óptica em um único plano focal, devendo ser este o volume a ser colocado na lâmina para contagem (Makler, 1978; Makler, 1980).
Motilidade espermática
É aceitável que aferições objetivas da motilidade espermática estejam correlacionadas com a fertilidade (Amann, 1989). Porém, os espermatozóides férteis devem manter e expressar uma série de características, que incluem desde estrutura normal de seus componentes funcionais até estabilização de seu conteúdo de DNA, passando pela manutenção da viabilidade da membrana plasmática. A temperatura é um importante parâmetro na avaliação da motilidade, sendo capaz de alterar seu período. As baixas temperaturas podem prolongar a motilidade espermática, porém, reduzem a velocidade dos espermatozóides (Hammerstedt et al., 1990).
A CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN
Recipientes para congelamento
Usualmente, encontram-se disponíveis no mercado, dois tipos de recipientes mais utilizados na criopreservação de sêmen: palhetas e criotubo. A escolha do recipiente recai, principalmente, em razão do volume de sêmen a ser preservado e da disponibilidade de espaço para armazenamento. Assim, a literatura é vasta e variável quanto à indicação de um ou de outro, ou mesmo de ambos (Anger et al., 2003).
Crioprotetores
A escolha do meio de criopreservação para o sêmen deve ser dirigida para a melhoria da capacidade de manter a integração e função celular durante o processo de congelamento e descongelamento. A capacidade de fertilização do sêmen fresco é, em muitos casos, maior do que a do congelado. Tal condição pode ocorrer devido ao uso de meio de criopreservação inadequado o qual provoca causa danos celulares atribuíveis ao crioprotetor utilizado (Verheyen et al., 1993).De uma maneira geral, pode-se s agrupar os crioprotetores em dois grupos, os permeáveis (que apresentam proteção intracelular) e os impermeáveis (que propiciam proteção externa à célula). O primeiro grupo é composto pelo glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propanediol e etilenoglicol, entre os mais utilizados. Os crioprotetores impermeáveis de maior utilização são a gema de ovo de galinha, leite em pó, açúcares, água de côco e glicose (Conti et al., 1995; Gilmore et al., 1995; Hallak et al., 1999).O crioprotetor permeável deve proporcionar:
a) diminuição da taxa de difusão da água da célula,É importante a utilização de meios crioprotetores que, em função de sua osmolaridade, penetrem na membrana espermática durante o congelamento e saiam dessa membrana durante o descongelamento, causando baixo dano celular. Assim, a eficácia dos agentes crioprotetores pode ser medida comparando-se os parâmetros précongelamento com os obtidos no pós-descongelamento, como a motilidade. Além disso, o espermatozóide pode perder sua habilidade de atingir capacitação máxima ou mesmo perder alguns mecanismos complexos de ativação do ovócito durante o processo de fertilização (Gilmore et al., 1995; Devireddy et al., 2000).
b) diminuição da temperatura de nucleação homogênea,
c) diminuição da taxa de crescimento de cristais de gelo e,
d) abaixamento do ponto de congelamento.
Taxas e Processos de Resfriamento
A passagem de sêmen, adicionado de crioprotetores, da temperatura ambiente para a temperatura de congelamento (-196°C) deve ser lenta e programada (Watson et al., 1992). Resfriamento (10-50 oC/min) lento pode ser parcialmente responsável pelo aumento na população de espermatozóides capacitados e funcionalmente viáveis. Esta taxa pode ser obtida utilizando-se botijões contendo apenas vapor de nitrogênio líquido (“dry shipper”, Taylor-Wharton), o que também facilita a realização dos procedimentos de criopreservação no campo. Os botijões são hermeticamente fechados e mantêm temperatura interior constante, durante algumas semanas, em torno de -180 a -190 ºC. (Jonhson et al., 1985).Devireddy e colaboradores, em 2000 e Anger e colaboradores em 2003, citam duas formas possíveis de resfriamento de sêmen:
(i) imersão direta das ampolas no nitrogênio;Os principais estudos na área de criopreservação visam, principalmente, esclarecer os danos que a membrana do espermatozóide pode sofrer resultantes dos processos de resfriamento e descongelamento entre as temperaturas de -15 a -60ºC. Desta forma, o problema da criopreservação não é a habilidade do espermatozóide permanecer viável à -196ºC. Quando uma célula é resfriada tipicamente, o gelo forma-se no compartimento extracelular e a membrana age como uma barreira prevenindo o crescimento do cristal de gelo no interior da célula. Os sais são excluídos dos cristais de gelo em crescimento, levando à concentração de sais na água descongelada restante (Mazur, 1984). O aumento do gradiente osmótico através da membrana plasmática causa difusão do conteúdo celular para fora da célula ocorrendo desidratação de ambas as célula e membrana plasmática. Quando a cristalização do gelo continua no meio extracelular, as células ficam presas nos canais da solução descongelada entre os cristais de gelo. Se as taxas de congelamento são lentas o suficiente para permitir equilíbrio da água através da membrana, os canais descongelados (com células unidas) ainda existirão em temperaturas bem abaixo do ponto de congelamento da água (Parks & Graham, 1992).Taxas rápidas de resfriamento formam gelo intracelular e isto pode também induzir ao dano e morte celular. Grande cristais de gelo intracelular são deletérios às células, ao passo que microcristais necessariamente não o são. A formação de cristais de gelo é uma função da taxa de resfriamento e descongelamento, o controle estrito e equalizado destas taxas podem minimizar os danos celulares causados pelo gelo intracelular (Mazur, 1984; Amann & Picket, 1987). Durante o processo de criopreservação, podem ocorrer as seguintes alterações na célula espermática devido ao resfriamento:
(ii) suspensão das ampolas por 4 a 5 minutos no vapor de nitrogênio antes da imersão;
1. Alterações morfológicas (Parks & Graham, 1992):a. Rompimento da membrana plasmática
b. Danos mitocondriais
2. Alterações bioquímicas (Quinn, 1985):a. Perda da permeabilidade seletiva da membrana- retenção de íons sódio e cálcio intracelularesb. Decréscimo da atividade respiratória e da glicólise
- perda de íons magnésio e potássio
- liberação de enzimas
- liberação de fosfolipídios- redução dos níveis de ATPc. Degeneração do DNA
- perda da motilidade
3. A viabilidade das células após o congelamento é determinada pela:a. Taxa de resfriamento
b. Temperatura final atingida
c. Aditivos
d. Maturação espermática
As taxas de congelamento são cruciais para a manutenção da viabilidade celular. Se a taxa for ótima e a membrana celular for permeável à água, ela torna-se progressivamente desidratada e é funcional após o descongelamento. Quando as taxas de congelamento não são ótimas, a perda de viabilidade das células está relacionada a vários eventos, como a diminuição do conteúdo de água intracelular, com conseqüente aumento das concentrações de solutos intracelulares e precipitação desses solutos, levando as alterações de pH (Watson, 1995).
Os seguintes fatores são importantes para a aplicação de taxa de congelamento adequada:
• viscosidade da solução intracelular (Mazur, 1984),As principais causas de crio-injúria são:
• área da superfície celular (Fahy, 1986),
• taxa de difusão da água através da membrana celular (Farrant, 1980),
• distância entre a célula e o primeiro cristal de gelo a se formar (Farrant, 1980),
• viscosidade da solução extracelular e ,
• permeabilidade do crioprotetor utilizado (Conti et al., 1995).
a) choque frio, temperatura crítica entre 0 e -40°C,
b) pH (Darszon et al., 1999),
c) gelo intracelular (Farrant, 1980),
d) gelo extracelular (Farrant, 1980),
e) toxicidade do crioprotetor (Holtz, 2000),
f) efeito soluto (Gilmore et al., 1995),
g) efeito volume (Gilmore et al., 1995).
Tempo de estocagem
Não existe grande volume de informação acerca do tempo de armazenamento do sêmen congelado. Em vertebrados, a expectativa de sobrevida teórica indica algo em torno de 4.000 anos (Trummer et al., 1998). Em março de 2004, foi relatado o caso do nascimento de um bebê com sêmen congelado por 21 anos e encaminhado para a técnica de fertilização in vitro. Em 2005, foi observado que o sêmen de dois indivíduos foi congelado durante 21 e 28 anos e ambos encaminhados para inseminação intrauterina, resultando no nascimento de dois bebês (Horne et al, 2004; Feldschuh et al., 2005). Clarke e colaboradores em 2006 avaliaram seis amostras de sêmen após 28 anos de criopreservação em nitrogênio líquido. Os resultados mostraram que as amostras mostraram recuperação de motilidade no pós descongelamento e capacidade de ligação com a zona pelúcida do óvulo e que quatro amostras também mostraram níveis normais de reação de acrossomal. Valorizou-se neste estudo, a necessidade de criopreservação seminal anterior a procedimentos quimioterápico.Em 2001, pesquisadores australianos estudaram por mais de 22 anos, 930 homens que buscaram congelamento seminal em um único hospital acadêmico dos quais 90% tiveram o sêmen criopreservado. 74% dos indivíduos sobreviveram à doença. 90% dos indivíduos começaram a utilizar o material dentro de 10 anos de armazenamento e nenhum depois de 15 anos. A concentração seminal mostrou-se reduzida nos indivíduos com etiologia de câncer testicular (Kelleher et al., 2001).Em outro estudo, em 2005, foram avaliadas 238 amostras individuais de sêmen que tinham sido colecionadas entre 1976 e 1989 a intervalos regulares. O material era proveniente de 34 pacientes, dos quais 18 tinham câncer. Para tal avaliação, a cada 3 anos uma amostra foi descongelada para análise. Durante o curso do período de armazenamento limitado a um máximo de 21 anos, todos os parâmetros apresentaram-se deteriorados em comparação ao sêmen fresco. A motilidade foi o parâmetro mais sensível com uma diminuição de cerca de 80%. A densidade espermática não reduziu significativamente. Os parâmetros dos critérios investigados não diminuíram linearmente ou proporcionalmente com a duração de armazenamento, mas bastante mais diretamente depois do congelamento inicial. Estas mudanças ficaram crescentemente menores como o tempo de armazenamento alongado. Assim, após vinte e um anos, amostras seminais congeladas mostram-se seguras em nitrogênio líquido e com características reproduzíveis (Bolten et al., 2005).Recente estudo demonstrou que somente 27% de homens que armazenam sêmen antes de tratamento de câncer utilizaram as amostras dentro de dez anos. Outro dado relevante consiste no fato que muitos dos pacientes que solicitam criopreservação de sêmen são jovens (idade média de 24 anos). Conseqüentemente é provável que seja aguardado o início de formação de sua família (Blackhall et al., 2002).
Análise pós-descongelamento
Os espermatozóides são células sensíveis à alteração brusca de temperatura (Hammerstedt et al., 1990). Fortes indícios revelam tendência do uso, no futuro, da técnica de vitrificação, baseada em congelamento e descongelamentos ultra-rápidos, durante os quais não há tempo suficiente para a formação de cristais (Brotherton, 1990). A motilidade espermática pós-descongelamento nos fornece uma idéia geral da habilidade de fertilização. A utilização do banho-maria a 30-40°C para descongelamento tem sido vastamente empregada. Para Cosson et al. (1999) quando NaCl é adicionado ao plasma seminal, a motilidade é induzida.
CONCLUSÃO
Passados 60 anos, a habilidade de se congelar espermatozóides tem causado profundo impacto na ciência reprodutiva. A melhoria da qualidade dos crioprotetores, a forma de acondicionamento do sêmen e o maquinário utilizado, propiciam melhora significativa na viabilidade dos espermatozóides após o descongelamento. Novos modelos de biologia molecular, bioquímica analítica, fisico-quimica e biologia reprodutiva, são preditivos ao avanço da reprodução humana masculina.
Brotherton J. Cryopreservation of human sperm. Arch. Androl., 25: 181-195, 1990.
Dacie J. V., Lewis S. M. Practical haematology. London: Churchill Livingstone, 1984.
Fahy G. M. The relevance of cryoprotectant toxicity to cryobiology. Cryobiology, 23: 1-13, 1986.
Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implication. Amer J. Physiol., 27: 125-142, 1984.