JBRA Assist. Reprod 2007;11(3):25-30
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2007.11.3.05
1Departamento de Ciências Morfológicas, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
2Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz, Porto Alegre, RS
RESUMO
Métodos clássicos de criopreservação de material biológico permitem a formação de cristais de gelo no interior das células, os quais são, na maioria das vezes, deletérios para a sobrevivência celular. Vitrificação, na qual alta velocidade de resfriamento é combinada com elevadas concentrações de crioprotetores, não permite a formação de cristais de gelo durante o resfriamento ou aquecimento. Diversos aprimoramentos da metodologia vêm sendo testados para a vitrificação bem sucedida de embriões e oócitos humanos, mas as taxas de sobrevivência e desenvolvimento embrionário pós-aquecimento têm se mostrado bastante variáveis entre diferentes laboratórios devido, provavelmente, à falta de consistência na metodologia empregada. Por outro lado, relatos cada vez mais freqüentes de resultados bem sucedidos por parte de alguns grupos fornecem fortes evidências de que a vitrificação deverá ocupar um lugar de destaque na esfera da criobiologia humana.
Palavras chave: vitrificação, oocitos, embriões humanos
SUMMARY
Classic methods of cryopreservation of biological specimens allow the formation of ice crystals inside the cells, which most of the times are deleterious for cell survival. Vitrification, where the high rate of cooling is combined with high concentrations of cryoprotectants, does not allow the formation of ice crystals during cooling or warming. Several improvements on the methodology are being tested for the successful vitrification of human embryos and oocytes, but the survival rates and embryo development post-warming have been very variable among different laboratories due, most likely, to the lack of consistency in the methodology employed. On the other hand, successful reports each time more frequent from a few groups, give strong evidences that vitrification shall occupy a prominent place in human cryobiology.
Key words: vitrification, human embryos, oocytes
INTRODUÇÃO
Desde o sucesso do nascimento do primeiro embrião murino após criopreservação (Whittingham et al., 1972) passaram-se mais de 35 anos. Neste ínterim, as metodologias e aplicações das técnicas de criopreservação em biologia da reprodução sofreram grandes modificações e avanços significativos como uma prática acessória em técnicas de reprodução assitida.
O desenvolvimento da ciência da criobiologia iniciou-se com as observações de Molish sobre morte celular devido à formação de cristais de gelo, quando da exposição de tecidos vegetais a baixas temperaturas, no final no século 19 (Molisch 1897). Apesar de a primeira descrição de vitrificação datar desta mesma época, (Tammann, 1898) pesquisa detalhada sobre esta técnica de criopreservação envolvendo modelos animais, só veio a desenvolver-se a partir da metade dos anos 80 do ultimo século (Rall & Fahy, 1985; Rall, 1987; Trounson et al., 1988).
Na atualidade, os dois métodos de criopreservação mais difundidos em biologia da reprodução são o congelamento lento e a vitrificação. O congelamento lento tem a vantagem de utilizar baixas concentrações de crioprotetores, os quais estão associados com toxicidade e choque osmótico. A vitrificação é um método rápido, que não exige o emprego de aparelhos especiais, mas faz uso de altas concentrações de crioprotetores.
Vitrificação, que literalmente significa “transformação em vidro” pode ser definida como a conversão de um sistema do estado fluido ao estado sólido, unicamente pelo aumento de viscosidade, sem qualquer alteração de fase ou cristalização da água e, portanto, em completa ausência de gelo (Luyet & Hodapp, 1938). Tal fenômeno pode ser alcançado aumentando-se a concentração do agente crioprotetor de forma a evitar a formação de gelo durante a queda de temperatura, tanto no interior das células como na fase líquida remanescente (Pegg, 2005).
Visto que concentrações relativamente elevadas de crioprotetores são necessárias para vitrificação, uma característica importante do crioprotetor a ser utilizado é que ele, em altas concentrações, não provoque dano celular devido a sua toxicidade. Para um dado tipo celular, a concentração inicial máxima que pode ser utilizada sem perda da viabilidade, depende da temperatura, da velocidade com que o crioprotetor é adicionado e removido e do tempo total de exposição. A relação com a temperatura é bastante complexa, pois que a toxicidade química diminui conforme a temperatura baixa e a toxicidade é tanto dependente do tempo quanto da dose. Por outro lado, a toxicidade osmótica aumenta pela redução da temperatura (Pegg, 2005). Cria-se então um compromisso entre acrescentar o crioprotetor a baixas temperaturas, em geral entre 4oC e 0oC, e a velocidade de penetração do crioprotetor que é mais eficiente a temperaturas mais elevadas, o que acarreta em um tempo menor de exposição do que na baixa temperatura e, portanto, teoricamente diminui o dano celular final.
Um exemplo perfeito da enorme importância das condições de tempo e temperatura sob as quais os crioprotetores são acrescentados e removidos durante a vitrificação nos é dado pelo experimento de Elford & Walter (1972). Estes autores aumentaram a concentração do crioprotetor dimetil-sulfoxido (DMSO), ao qual tecido muscular liso foi inicialmente exposto, de 20% a 37oC, até a concentração de 60%, através de uma série de etapas de incremento da concentração, ao mesmo tempo que a temperatura era gradativamente diminuída até -79oC. Processo reverso foi utilizado durante o aquecimento. Desta maneira, não ocorreu a formação de gelo a -79o C e a função contrátil das fibras musculares ficou totalmente preservada.
Outro aspecto fundamental a ser levado em consideração em qualquer técnica de criopreservação é o efeito osmótico dos crioprotetores utilizados. Particularmente durante a vitrificação, o efeito osmótico do crioprotetor pode resultar em alterações acentuadas no volume celular, visto que sua velocidade de penetração é mais lenta que a água do meio extracelular. Tais alterações no volume das células não devem chegar ao seu limite máximo, o que resultaria em dano celular e lise. Portanto, um ponto importante antes de iniciar-se uma metodologia de vitrificação é a medição da velocidade de penetração dos solutos de vitrificação do sistema, ao mesmo tempo em que é medida a resposta do volume celular às alterações na osmolaridade que serão causadas por estes solutos.
A permeabilidade de células à água e a crioprotetores pode ser calculada por se construir uma curva de volume celular contra tempo, após alterações gradativas da concentração do crioprotetor. Este processo foi executado para estimar-se a permeabilidade de espermatozóides (Gilmore et al., 1997) e oócitos (Newton et al., 1999; Paynter et al., 2001) humanos à água e aos crioprotetores DMSO e propanodiol. Em posse destes dados, pode-se calcular a melhor velocidade para as alterações gradativas de concentração dos crioprotetores, principalmente durante a fase de remoção, mais critica para as células, do que durante a fase de adição. Nesta etapa podem ser adicionados solutos que não penetram nas células, mas funcionam como tampões osmóticos que limitam ou regulam a entrada de água, conforme a concentração do crioprotetor vai sendo diminuída.
Nem todos os crioprotetores têm a mesma eficiência em vitrificação nem a mesma toxicidade (Fahy et al., 2004a, b) sendo que estes parâmetros variam ainda conforme o tipo celular estudado (Wusteman et al., 2002). A toxicidade das altas concentrações de crioproteores utilizados em vitrificação pode ser consideravelmente diminuída pela adição de outros solutos que também promovem a formação do estado vítreo, por exemplo, alguns açúcares, como produtos derivados da hidrolise do amido, dextrans, polipeptideos, polivinilpirrolidona (PVP), sulfato de condroitina e polietilenoglicois (PEGs) (Sutton et al., 1992).
Três fatores afetam a probabilidade de ocorrer a vitrificação: a velocidade de resfriamento, a viscosidade do meio e o volume (Arav et al., 2002). Aumentando a viscosidade ou a velocidade de resfriamento, ou diminuindo o volume irão aumentar a probabilidade da vitrificação. Originalmente, vitrificação é alcançada pela simples imersão da amostra no nitrogênio líquido a -196o C fazendo com que a transferência de calor da amostra ao nitrogênio líquido leve a uma evaporação do nitrogênio líquido imediatamente ao redor da amostra formando uma camada de gás nitrogênio, a qual atua como um isolante. Esta situação teoricamente deve prejudicar a transferência de calor da amostra tornando quase que impossível atingir uma velocidade de resfriamento suficientemente rápida e uniforme para atingir a vitrificação. Um aparelho foi então desenvolvido (Vit-Master®, IMT, Israel; Arav, 2002), o qual aplica uma pressão negativa ao nitrogênio líquido baixando sua temperatura à -210o C. Com esta estratégia não há evaporação do nitrogênio líquido quando da imersão da amostra e a velocidade de resfriamento aumenta dramaticamente. A validade deste método em termos de viabilidade das amostras pós-aquecimento, ainda está em fase de investigação e aprimoramentos em diferentes laboratórios.
Por outro lado, a maioria das metodologias atuais de vitrificação em reprodução assistida humana utiliza ferramentas diminutas que acomodam o embrião ou oócito em volumes sub-microlitros. Diversas alternativas vêm sendo testadas procurando diminuir o volume da solução e aumentar a velocidade de resfriamento, como colocar a amostra diretamente sobre grades de microscopia eletrônica (Steponkus et al., 1990), utilizar o sistema de palheta aberta (Vajta et al., 1998; Zaho et al., 2007), o cryotip (Hochi et al., 2001), a rede de nylon (Matsumoto et al., 2001) e, finalmente, o cryotop (Kuwayama et al., 2005). Cada uma destas metodologias apresentou resultados satisfatórios em termos de sobrevivência dos embriões e oócitos vitrificados, mas dúvidas quanto à praticidade dos protocolos, a repetitividade da metodologia e a segurança do material em tais sistemas abertos impedem seu emprego mais generalizado.
Vitrificação como uma técnica acessória em medicina reprodutiva:
Até poucos anos atrás, a maioria dos tecidos ou células era criopreservado com resultados satisfatórios em termos de viabilidade pós-congelamento, a partir de algum método “clássico” de criopreservação. Tais protocolos utilizam baixas concentrações de crioprotetores, os quais permitem a formação de gelo extracelular durante o resfriamento, mas evitam a formação de gelo intracelular pelo rebaixamento lento da temperatura e aquecimento muito rápido. Quais seriam as vantagens da vitrificação sobre estes métodos tradicionais de criopreservação de forma a torná-la uma metodologia alternativa em reprodução assistida?Alguns autores mencionam resultados bastante satisfatórios da vitrificação de embriões e espermatozóides humanos (Kuleshova & Lopata, 2002), enquanto outros salientam que as taxas de sobrevivência e viabilidade pós-aquecimento são muito variáveis (Liebermann et al., 2002). No Brasil, resultados bastante animadores foram relatados por Fioravante e colegas (2007a) em uma série de 39 ciclos de transferências de embriões obtidos pós vitrificação dos oócitos. Os autores descrevem taxas de gestação de aproximadamente 35% após a transferência em média de 2,75 embriões gerados a partir de oócitos re-aquecidos. Ainda, os mesmos autores relatam a apropriação da metodologia para a criopreservação de embriões obtidos, a partir de oócitos previamente vitrificados ou que tenham sido submetidos ao diagnóstico pré-implantacional (Fioravante et al., 2007 b,c).Um dos motivos do aumento espantoso na popularidade da vitrificação nos últimos anos foi a divulgação e disseminação da idéia de que esta seria uma técnica mais simples de ser executada e a menor custo. Entretanto, este conceito pode ser enganador. Se por um lado evita-se a necessidade de um aparelho que proporcione uma velocidade controlada de resfriamento, por outro, as velocidades de resfriamento e aquecimento são críticas e nenhuma destas etapas está sob controle rígido do operador durante a vitrificação. Ainda, o período de tempo exato e a temperatura exata da exposição inicial às altas concentrações do crioprotetor são fundamentais para o sucesso do processo (Bos-Mikich,et al., 1995). Estes parâmetros também ficam expostos a variações involuntárias do operador e /ou do ambiente. Por estes motivos, não é de surpreender, a grande variabilidade em taxas de sobrevivência e viabilidade observada entre diferentes centros que vêm testando a técnica de vitrificação para a criopreservação, principalmente de oócitos e embriões humanos. Outro ponto que deve ser levado em consideração ao fazer-se a opção pela vitrificação como método de criopreservação em um laboratório de reprodução humana é o nível de ocupação do pessoal de laboratório e o nível de movimento do mesmo. Ao iniciar-se um processo de vitrificação o embriologista deve dedicar-se e concentrar-se na técnica até a imersão do material no nitrogênio líquido o que em media leva no máximo, dois minutos. Considerando-se que mesmo os embriologistas mais experientes realizam o processo de vitrificação de não mais do que dois embriões ao mesmo tempo, havendo um número grande de pacientes, cada qual com um número elevado de embriões, o tempo gasto pela equipe de embriologistas será certamente superior àquele gasto no congelamento lento, onde é possível manipular grupos de embriões ao mesmo tempo e os embriões poderão ser expostos a condições subótimas durante o desenvolver do processo (Bos-Mikich, comunicação pessoal, 2007).Há duas situações em que o uso da vitrificação deveria ser considerado (Pegg, 2005): primeiro quando a formação de gelo extracelular é claramente responsável pelo dano celular observado no material biológico e, segundo, quando os resultados de criopreservação por métodos clássicos de congelamento não têm apresentando resultados satisfatórios, como é o caso do congelamento de oócitos humanos.
Vitrificação de oócitos humanos
Levando-se em consideração que as primeiras gestações, a partir de oócitos criopreservados ocorreram à cerca de duas decadas atrás, a eficiência das diferentes metodologias para criopreservação do gameta feminino humano permanece baixa, em termos de fertilização e bebês nascidos. Até mesmo após a introdução da ICSI, que contorna um problema comum da criopreservação de oócitos, qual seja o endurecimento da zona pelucida, a criopreservação de oócitos deve ainda considerada um procedimento experimental e de uso clinico limitado. As técnicas de congelamento lento são potencialmente inapropriadas para à criopreservação de oócitos humanos, devido à sua alta sensitividade ao resfriamento e à baixa condutividade (Liebermann et al., 2003a) explicadas pela baixa permeabilidade do oolema. Esta maior sensibilidade ao resfriamento pode ser compensada por técnicas de resfriamento ultra-rápidas, como a vitrificação, por eliminar a formação de cristais de gelo, tanto dentro do citoplasma como no meio externo.Taxas de sobrevivência de até 96% foram relatadas após a vitrificação de oócitos humanos (Hunter et al., 1995; Kuleshova et al., 1999; Chen et al., 2000; Kuwayama & Kato, 2000; Yoon et al., 2000; Liebermann et al., 2003b; Lucena et al., 2006), deve-se, entretanto, levar em consideração que alguns destes estudos utilizaram uma população bastante reduzida de gametas (Chen et al., 2000; Kuwayama & Kato, 2000). Yoon e colegas (2000) descreveram índices bastante encorajadores de gestação e implantação de 21.4% e 6.4%, respectivamente, após a transferência de até 6 embriões obtidos por ICSI de oócitos previamente vitrificados. Estudo mais recente (Lucena et al., 2006) reporta taxas de gestação mais elevadas (25-100%), após tranferencia de 4-5 embriões obtidos pós-vitrificação e ICSI de oócitos de pacientes tratadas por diferentes etiologias. Recente relato de caso (Huang et al., 2007a) descreve ainda, o uso bem sucedido da vitrificação para a criopreservação de oócitos coletados imaturos e maturados in vitro em uma paciente portadora de tumores ovarianos borderline. Apesar destes sucessos, fica também evidente que, as baixas taxas de implantações dos embriões pós-vitrificação dos oócitos exige a transferência de um número consideravelmente elevado deles, o que por sua vez, requer a produção e criopreservação de números elevados de gametas para dar-se início ao processo e obterse resultados finais satisfatórios.Importante mencionar que, semelhante aos resultados já descritos sobre a constitução cromossomica de embriões obtidos após vitrificação de oócitos murinos (Bos-Mikich et al., 1995), estudo recente tambem mostrou não haver qualquer aumento na taxa de aneuploidias após a vitrificação, quando comparada com o congelamento lento (Huang, et al., 2007b).Estes resultados confirmam a capacidade de re-organização do citoesqueleto do oócito em cultura, após sua despolimerização causada pela criopreservação (Eroglu et al., 1998).
Vitrificação de embriões
A criopreservação de embriões supranumerários dos tratamentos de IVF/ICSI tornou-se um procedimento rotineiro em basicamente todos os centros de reprodução assistida. Vitrificação está sendo gradativamente considerada como uma alternativa ao método de congelamento lento convencional para embriões humanos desde o estágio de pronúcleo até de blastocisto.Vitrificação bem sucedida de embriões de mamiferos foi relatada pela primeira vez por Rall & Fahy em 1985. Logo a seguir Quinn & Kerin (1986) tentaram utilizar o mesmo protocolo para embriões humanos, mas os resultados foram muito inferiores àqueles obtidos em murinos. Desde então, variações da metodologia vêm sendo investigadas para embriões humanos, inclusive o uso de diferents crioprotetores como DMSO, glycerol, etileno glycol, propanodiol e açúcares em diversas concentrações e combinações (Chen et al., 2000; Mandelbaum, 2000; Shaw et al., 2000; Wright et al., 2004).Utilizando concentrações de DMSO relativamente mais baixas do que trabalhos anteriores (4.2 -4.5 mol/l), embriões humanos desde pronúcleo (Van den Abbeel et al., 1997) até 2 -16 células (Barg et al., 1990; Feichtinger et al., 1991) foram vitrificados e resultaram em gestações levadas a termo, demonstrando a propriedade da metodologia. O uso de soluções de vitrificação baseadas em etileno glycol, também resultou em gestações e nascimentos após criopreservação de embriões humanos entre 8-16 células (Mukaida et al., 1998; Saito et al., 2000). Interessante mencionar que um estudo recente utilizando embriões murinos em sucessivos estágios do desenvolvimento demonstrou que a re-vitrificação acarreta menos danos ao embrião que o congelamento lento (Sheehan et al., 2006). Os autores mostraram que a vitrificação sucessiva não compromete o desenvolvimento embrionário subsequente medido em termos de taxas de compactação, desenvolvimento ao estágio de blastocisto, número total de células e qualidade da massa celular interna.Com o desenvolvimento de meios de cultura sequenciais que permitem a produção eficaz de blastocistos in vitro, surgiu também a necessidade de um método eficiente para sua criopreservação. Entretanto, a criopreservação de blastocistos tem se mostrado um desafio para a maioria dos cientistas procurando criopreservá-los utilizando métodos classicos de congelamento lento, semelhantes àqueles empregados para o congelamento de estágios mais precoces do desenvolvimento (Nakayama et al., 1995; Alper et al., 2001; Pantos et al., 2001). Em contrapartida, alguns grupos (Liebermann et al., 2003b) que dão preferência à transferência e congelamento de blastocistos em vista do crescente interesse em transferir-se apenas um embrião, preconizam uma aparente superioridade do estágio de blastocisto para criopreservação, em comparação a estágios mais precoces do desenvolvimento.Não parece, entretanto haver uma superioridade da vitrificação em relação ao congelamento lento em relação as taxas de implantação (em torno de 30%) ou de gestação (em torno de 45%) para a criopreservação de blastocistos (Liebermann & Tucker, 2006). Relato recente (Hiraoka et al., 2007) de quatro casos descreve resultados excelentes em termos de gestações (n=3; 75%) e implantações (n=3; 75%) após a transferência de blastocistos eclodidos previamente vitrificados. Blastocistos humanos são menos permeáveis a água e existe, teoricamente, maior risco da formação de cristais de gelo na blastocele durante o resfriamento e aquecimento. Comparando as taxas de sobrevivência de blastocistos criopreservados pelo método tradicional de congelamento lento e pela vitrificação, Yeoman e colegas (2001) demosntraram que a sobrevivência e eclosão de blastocistos de macacos rhesus eram consideravelmente superiores após vitrificação (36% e 5% vs 85% e 71%, respectivamente). Em 2002, Vanderzwalmen e colegas demonstram taxas de gestação superiores a 20%, após a transferência de blastocistos previamente vitrificados, cujas blastoceles foram artificialmente colabadas antes da vitrificação em solução de etileno glycol, ficoll e sacarose. Estudos subsequentes de vitrificação de blastocistos humanos utilizando o cryoloop monstraram taxas de sobrevivência entre 37-50% e taxas de implantação entre 22-29% (Mukaida et al., 2001; Reed et al., 2002; Mukaida et al., 2003a,b; Stehlik et al., 2005). Além destes estudos, alguns outros trabalhos comparativos entre eficiência do congelamento lento e da vitrificação revelaram que os resultados alcançados pela vitrificação de embriões e oócitos humanos são, no mínimo, equivalents ou significativamente superiores àqueles obtidos pelo congelamento lento (Liebermann et al., 2003a; Walker et al., 2004; Kuwayama et al., 2005).
Vitrificação de tecido ovariano
Por fim, cabe mencionar o emprego da vitrificação na criopreservação de tecido ovariano. A criopreservação de tecido ovariano, apesar de já contar com gestações bem sucedidas e com o nascimento de crianças sadias (Donnez et al., 2004; Meirow et al., 2005; Donnez et al., 2006) após congelamento lento, ainda está em fase experimental em diversos laboratórios do mundo. Analises histológicas pós-congelamento lento de tecido ovariano demonstraram que a maior dificuldade encontrada está na manutenção da estrutura folicular e do estroma ovariano, responsável pelo funcionamento coordenado entre o oócito, células foliculares e o tecido circunvizinho (Gook et al., 1999; Bos-Mikich et al., 2006). Recente estudo comparativo entre congelamento lento e vitrificação de fragmentos ovarianos de diversas especies de mamiferos, inclusive humanos, revelou que a vitrificação de fragmentos ovarianos causou danos mais extensos na estrutura folicular que o congelamento lento (Gandolfi et al., 2006). Em contrapartida, estudos em modelos experimentais monstraram que a restauração da função endócrina ovariana e a capacidade de desenvolvimento dos oócitos, fertilização e até nascimento são possíveis, após a vitrificação de ovarios murinos inteiros, em uma solução contendo DMSO e propilenoglycol (Migishima et al., 2003; Kagawa et al., 2007). Certamente devido às grandes diferencas histológicas e fisiológicas existentes entre ovários murinos e humanos, estes resultados não podem ser extrapolados de uma espécie para a outra e refinamentos da metodologia são evidentemente necessários antes de que sua aplicação clínica possa ser considerada.Em conclusão, a vitrificação de oócitos, embriões e tecido ovariano humano parece estar conquistando uma posição cada vez mais sólida entre as metodologias em reprodução assistida em diversos centros mundiais de reprodução assistida humana. Aprimoramentos da técnica e maior conhecimento dos efeitos de suas diferentes variáveis por parte dos embriologistas envolvidos na sua execução contribuirão, certamente, para maior aceitação e emprego clínico bem sucedido deste método de criopreservação.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Alper M., Brinsden P., Fisher R., Wikland M.- To blastocyst or not to blastocyst? That is the question. Hum Reprod 16: 617-619, 2001.
Mandelbaum J. - Embryo and oocyte cryopreservation. Hum Reprod 15: 43-47, 2000.