JBRA Assist. Reprod 2007;11(3):31-35
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2007.11.3.06
1Departamento de Ciências Morfológicas, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
2Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz, Porto Alegre, RS
RESUMO
A seleção do embrião com maiores chances de implantação e gestação é um ponto crítico para o sucesso das técnicas de reprodução assistida humana, principalmente devido à tendência mundial de transferir um embrião por ciclo. Diversos métodos vêm sendo propostos sem que exista ainda um consenso mundial sobre qual deles, isoladamente, seria o de maior poder prognóstico de implantação e gestação. Métodos qualitativos avaliam características morfológicas, desde o estádio de zigoto até o de blastocisto. Por outro lado, critérios fisiológicos indiretos de viabilidade embrionária, como a dinâmica dos pronúcleos e das divisões celulares e o início da compactação têm recebido cada vez mais atenção e credibilidade. Nenhum desses métodos pode, entretanto, identificar embriões portadores de constituição cromossômica normal sendo este o grande desafio da seleção embrionária, uma vez que 50% ou mais dos embriões considerados aptos para transferência são portadores de anomalias cromossômicas. Certamente o desenvolvimento e aprimoramento de metodologias refinadas de análise direta do metabolismo embrionário representarão o melhor instrumento para seleção do embrião inicial.
Palavras chave: embriões, métodos seleção, implantação, gestação.
SUMMARY
The selection of the embryo with the highest chances of implantation and pregnancy is a key point for the success of human assisted reproduction technologies, mainly due to the worldwide drift to single embryo transfer. Several methods are being proposed without reaching a general consensus on which one, on its own, would be the one with the strongest predictive power for implantation and gestation. Qualitative methods evaluate morphological characteristics from the zygote to the blastocyst stage. On the other hand, indirect physiological methods of embryo viability, such as pronuclear and cleavage dynamics and the beginning of compaction are receiving each time more attention and credibility. None of these methods can, however, identify the embryos with normal chromosomal complement, being that up to 50% or more of the embryos considered suitable for transfer are chromosomally abnormal. Certainly development and improvements of sophisticated methods to directly analyse embryonic metabolism will represent the best tool for embryo selection.
Key words: embryos, selection methods, implantation, gestation.
INTRODUÇÃO
Quando os primeiros embriões humanos foram gerados com sucesso in vitro, pouco era discutido sobre como se fazer a escolha dos embriões que teriam as maiores chances de implantação e gestação. Conforme as tecnologias de reprodução assistida humana foram sendo aprimoradas, a ocorrência de gestações múltiplas e suas conseqüências, se tornou bastante mais freqüente do que a desejada, tanto pelos casais como pelos profissionais envolvidos. Ficou evidente que o numero de embriões a serem transferidos deveria ser limitado a apenas um ou no máximo dois por transferência. Para que essa atitude pudesse ser tomada com a segurança de que os índices de gestação e implantação não viessem a diminuir, os grandes centros mundiais de reprodução assistida iniciaram uma busca sistemática de parâmetros do desenvolvimento embrionário que servissem de marcadores de viabilidade e potencial de desenvolvimento embrionário e fetal. Esperava-se que esse marcador ou marcadores de viabilidade permita a escolha do embrião líder de qualidade entre todos aqueles produzidos em ciclo de estimulação ovariana e fertilização in vitro ou ICSI, de maneira a dar ao casal as maiores chances de um bebe em casa, sem os riscos apresentados pelas gestações múltiplas.
Os primeiros relatórios de tratamentos de fertilização assistida na Europa gerados pela ESHRE para o ano de 1997 descrevem que a taxa de transferências embrionárias simples foi de 11.5%, de transferências duplas de 35.9%,de transferências triplas de 38.4% e de quatro ou mais embriões de 14.3% (EIM, 2001). Entretanto, o numero de embriões transferidos após em tratamentos de reprodução assistida variou enormemente entre diferentes países europeus. De uma maneira geral, aquelas estatísticas não se modificaram muito nos 6 anos seguintes: 15.7%, 55.9%, 24.9% e 3.5% para transferências simples, duplas, triplas e de quarto ou mais embriões, respectivamente. (EIM, Registers 2007). Entretanto, dois paises nórdicos, Suécia e Finlândia, relataram uma mudança radical em direção às transferências embrionárias simples durante este mesmo período: de 15.8% e 9.1%, em 1997 (EIM, 2001) eles aumentaram estes índices para 30.6% e 38.6%, em 2002 (EIM, 2006). As freqüências de gestações e nascimentos foram, entretanto, muito semelhantes nos dois períodos ou até levemente superiores no relatório de 2002. Como manter as taxas de gestação e nascimentos por transferência em torno de ou acima de 25%, ao mesmo tempo em que reduzimos o número de embriões transferidos? Parte da resposta reside na escolha do embrião que tenha as melhores chances de implantação e desenvolvimento a termo.
Como podemos identificar este embrião líder de qualidade em um grupo? Já em 1992, Steer e colegas propuseram um sistema de classificação cumulativo dos embriões, o qual permitiu a seleção do numero ideal de embriões a serem transferidos de maneira a atingirem um percentual máximo de gestações, com uma baixa incidência de gestações múltiplas. Vários parâmetros morfológicos e fisiológicos foram propostos ao longo dos anos. Vamos então discutir alguns pontos relevantes desses métodos e comparar suas performances nos diversos centros de reprodução assistida humana mundiais.
CRITÉRIOS ZIGÓTICOS
Desde o estágio de zigoto existe uma organização não casual das organelas e produtos gênicos que determinam uma polaridade do embrião (Edwards, 2005). Como marcadores de viabilidade e potencial de implantação e gestação da fase zigótica destacam-se a orientação dos pronúcleos e a distribuição e tamanho dos nucleoli (Scott et al., 2000; Zollner et al, 2002; Kattera & Chen, 2004). Não está bem estabelecido, entretanto, até que ponto esse critério pode depender de um único momento de observação, visto que os nucleoli são estruturas dinâmicas que sofrem alterações em número e localização ao longo da interfase mitótica. Em vista disto, alguns autores proclamam que a avaliação morfológica dos embriões em cultivo nos dias 2 e 3 do desenvolvimento, baseada no numero e na regularidade dos blastômeros e no grau de fragmentação, tem um valor prognóstico de implantação e gestação superior a classificação zigótica baseada nos pronúcleos (Payne et al., 2005; Nicoli et al., 2007). Outro indicador de viabilidade zigótica, a dissolução das membranas dos pronúcleos entre 22 e 25 horas pós-inseminação mostrou forte correlação com o número apropriado de células dos embriões nos dias 2 e 3 do desenvolvimento e taxas de gestação e implantação superiores ao grupo que não apresentou esse comportamento(Francsovits et al., 2005; Lawler et al., 2007).
Critérios associados aos primeiros estágios do desenvolvimento
Já em 1984 Edwards e colaboradores relataram a relação existente entre o padrão de clivagem e a qualidade de embriões gerados in vitro demonstrando que pacientes cujos embriões atingiam o estádio de 8 células ate 55 horas pós-inseminação tinham praticamente duas vezes mais chances de gestação do que aquelas cujos embriões atingiam o mesmo estádio 56 horas ou mais pós-inseminação Não surpreendentemente, o mesmo fenômeno foi detectado para o momento da primeira divisão mitótica e este critério tem adquirido cada vez mais força como instrumento de seleção embrionária, em diferentes centros mundiais (Shoukir et al, 1997; Sakkas et al, 1998; Bos-Mikich et al, 2001; Lundin et al., 2001; Salumets et al, 2003).A identificação de embriões que atingiram o estádio de 2-células 25-27 horas após a inseminação,dita clivagem precoce, é um forte marcador de viabilidade embrionária, não menos porque embriões que apresentam a 1a divisão muito antes das 20h ou estão muito atrasados apresentam altas taxas de anomalias cromossômicas e baixo índice de implantação (Ebner et al, 2001). Estudo recente demonstrou ainda que a morfologia dos pronúcleos está correlacionada ao padrão de clivagem (Chen & Kattera, 2006) e a dinâmica de dissolução dos envoltórios nucleares também está relacionada com o padrão de clivagem e a qualidade embrionária (Wharf et al., 2004) evidenciando que a coordenação dos fenômenos fisiológicos do zigoto é fundamental para sua viabilidade e sobrevivência, além de ser um marcador indireto de sua constituição cromossômica.A importância da clivagem precoce na viabilidade do embrião fica também evidente quando consideramos que cada estádio de desenvolvimento representa uma série de transformações morfológicas e, mais importante, alterações fisiológicas que devem acontecer dentro de um período de tempo determinado, de maneira a gerarem um feto viável. Nesse contexto, o momento da 1a divisão mitótica é um passo crucial no desenvolvimento embrionário e representa um indicador de que o “relógio” fisiológico embrionário esta trabalhando em um compasso adequado. Além disso, considerando-se que a 1a. e a 2a divisões mitóticas dependem de componentes maternos do oócito fertilizado e esses componentes irão se exaurir em um dado momento quando as divisões ocorrem no momento certo, pode-se prever que o genoma embrionário será também acionado no momento certo, levando a uma expressão gênica correta e a disponibilidade de seus produtos no momento correto, o que irá dar ao embrião suas melhores chances de sobrevivência e gestação bem sucedidas.Até o momento não existe qualquer estudo que refute o poder prognóstico da seleção embrionária baseada na clivagem precoce, havendo entretanto, alguns autores que preconizam a necessidade de se agregar outros parâmetros a ela, como a morfologia embrionária no dia da transferência (Terriou et al., 2007). Sob o ponto de vista prático do embriologista, a principal vantagem do método de seleção embrionária pela clivagem precoce reside na rapidez da avaliação. O profissional não necessita de mais do que poucos segundos para avaliar um grupo completo de embriões, fator decisivo para viabilidade embrionária quando se considera que a exposição das placas de cultivo a condições não ideais pode levar a inviabilidade dos embriões nelas contidos. As avaliações que utilizam variáveis qualitativas, como a distribuição e regularidade dos pronúcleos e dos nucleoli (Scott et al., 2000) ou a classificação morfológica (Veeck, 1991) exigem maior acuidade de observação e conseqüentemente, demoram mais tempo para serem realizadas, mesmo pelos embriologistas mais experientes, estando ainda sujeitas a divergências entre observadores.Deve-se mencionar, entretanto, que em estudos feitos com a transferência de apenas um embrião, resultados contraditórios foram obtidos quanto à eficiência do uso da clivagem precoce como único critério para seleção embrionária. Enquanto alguns autores preconizam seu emprego como positivo (Van Montfort et al, 2004; Giorgetti et al., 2007), outros descrevem não haver um aumento significativo nas taxas de implantação e gestação, quando os embriões são escolhidos por este critério (Emiliani et al, 2006; Rehman et al., 2007)Padrões de classificação e seleção embrionária para o segundo e terceiro dia do desenvolvimento baseiam-se primariamente na classificação morfológica dos embriões enfatizando o numero apropriado de blastômeros (4 no dia 2 e 7-8 no dia 3) sua regularidade e o grau de fragmentação (Veeck, 1999) sendo que neste último item devemos ainda levar em consideração o tipo, disperso ou agregado, de fragmentos observados (Milki et al., 2002; Racowsky, et al., 2003; Volpes, et al., 2004 ). Ainda outro critério de avaliação, a multinucleação dos blastômeros no dia 2 ou 3 do desenvolvimento demonstrou ser também um forte marcador de viabilidade embrionária (Van Royen et al, 2003). Esse dismorfismo embrionário parece estar diretamente associado a um padrão de clivagens retardado e com um grau aumentado de fragmentação e decréscimo de implantação. Como a presença de multinucleação pressupõe a perda de cromossomos da placa metafásica da última divisão mitótica, acarretando ganhos ou perdas cromossômicas nos blastômeros, deve-se evitar a transferência de embriões portadores dessas anomalias (Sundström, 2007). Outro marcador potencial de competência de desenvolvimento embrionário no terceiro dia é o surgimento de junções oclusivas entre os blastômeros à medida em que se inicia o processo de compactação. O fenômeno da compactação precoce foi descrito primeiramente em conjunto com outros marcadores do desenvolvimento e mostrou haver uma correlação positiva entre a presença de embriões compactados precocemente no 3o. dia e taxas de gestação aumentadas (Desai et al., 2000). Mais recentemente, análise retrospectiva de transferências de um ou dois embriões, mostrou que a compactação precoce associada a um baixo grau de fragmentação é um forte indicador de implantação e gestação (Skiadas et al., 2006). Paradoxalmente, o prognóstico favorável desse marcador torna-se desfavorável, quando a compactação precoce está associada a um elevado grau de fragmentação dos blastômeros. Observação semelhante foi feita por nosso grupo, onde detectamos que a inclusão de pelo menos um embrião com compactação precoce verificada no 3o dia de desenvolvimento, no grupo de embriões transferidos, leva a um aumento significativo nas taxas de gestação e implantação.Por fim, cabe mencionar o impacto causado pela presença e grau de fragmentação dos embriões durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Estudo de 203 ciclos de transferências de um único embrião revelou que, após a transferência de blastocistos selecionados por sua boa qualidade, o grau de fragmentação no terceiro dia de desenvolvimento foi o fator que mostrou maior correlação com as taxas de implantação e gestação (Della Ragioni et al., 2007). Resultados confirmados pelo estudo de Nomura e colaboradores (2006), mas que estão em direto contraste com um estudo anterior (Rijnders & Jansen, 1998) onde não foi detectada uma correlação positiva entre a morfologia embrionária no terceiro dia do desenvolvimento e a sua capacidade de formação de blastocistos, em um programa de transferência de blastocistos. Entretanto, as transferências nesse estudo foram mistas, isto é, blastocistos de diferentes categorias foram transferidos para a mesma paciente, o que dificulta a interpretação dos resultados quanto o potencial de implantação e gestação dos diferentes tipos embriões.
Critérios associados ao blastocisto
No extremo do desenvolvimento embrionário in vitro, o blastocisto representa, por si só, uma seleção “natural’ daqueles embriões mais aptos ao desenvolvimento subseqüente. Ainda, a presença de um ou mais blastocistos no 5o ou 6odia de desenvolvimento in vitro fornece um parâmetro adicional de avaliação da viabilidade embrionária, quando da sua classificação quanto ao grau de expansão, disposição e forma das células do trofectoderma e da massa celular interna (Baladan et al., 2006; Quea et al., 2007; Rehman et al., 2007). A obtenção de bons blastocistos não significa, entretanto, a certeza de se ter embriões viáveis e com capacidade de implantação e desenvolvimento fetal a termo: alguns tipos de anomalias cromossômicas numéricas não impedem a completa progressão embrionária in vitro, como ficou evidenciado em dois estudos. Primeiramente foram descritos casos de mosaicismo extensivo em “bons” blastocistos e embriões trissômicos que atingiram o estágio de blastocisto com uma freqüência de até 37% (Sandalinas et al., 2001). Interessante observar nesse mesmo estudo que somente aquelas monossomias compatíveis com o desenvolvimento no 1o. trimestre (monossomias do X e do 21) foram detectadas no estágio de blastocisto, levando à conclusão de que, embora haja uma forte seleção contra embriões cromossomicamente anormais durante a cultura ao estágio de blastocisto, esse instrumento não pode ser utilizado como um método confiável de seleção contra anomalias cromossômicas clinicamente relevantes tais como as trissomias. Essas observações foram reforçadas em um estudo mais atual (Rubio et al., 2007), onde os autores mostraram que, após a avaliação cromossômica de 6936 embriões de pacientes com indicação para diagnóstico pré-implantação (PGD), embriões de ploidia normal atingiram o estágio de blastocisto em freqüências significativamente maiores (68.2%) do que embriões portadores de aneuploidias (42.8%) e mosaicos (53.7%). Existe, portanto, uma seleção contrária ao desenvolvimento de embriões com anomalias cromossômicas, mas é ainda preocupante a elevada freqüência de embriões anormais que atingem o estádio de blastocisto e que, conseqüentemente, tem boas chances de implantação e gestação.Seria então a análise cariotípica dos embriões a única maneira segura de transferirmos embriões viáveis e cromossomicamente balanceados, com boas chances de implantação e gestação? Se tal fosse verdadeiro, deveríamos fazer o PGD em todos embriões antes da transferência. Como declara Munné (2006, 2007), se considerarmos que as aneuploidias mais freqüentes em mulheres acima de 35 anos de idade, não estão relacionadas com o estádio de clivagem do embrião e as trissomias podem alcançar o estádio de blastocisto e além dele, a análise morfológica por si só não é suficiente para selecionar anomalias cromossômicas nos embriões gerados destas pacientes e, portanto, o PGD deveria ser recomendado para todas pacientes de 35 anos ou mais. Deve-se ressaltar, entretanto, que antes que o uso indiscriminado do PGD se torne uma rotina em laboratórios de reprodução assistida humana, testes clínicos randomizados se fazem necessários para determinar se a análise da aneuploidia leva a melhoras significativas das taxas de gestação, ou ainda, se a biópsia embrionária tem algum impacto na saúde das futuras crianças ou adultos (Gosden, 2007). Além disso, não restam dúvidas de que embriões saudáveis são perdidos com o a prática do PGD. Tal fato pode acontecer, potencialmente, quando embriões mosaicos normalizam em cultura ou, mais significativamente, devido a problemas inerentes da técnica de PGD (Gosden , 2007). Assim sendo, por melhores que sejam as intenções de empregar essa tecnologia para seleção embrionária, ela pode não preencher a expectativa primária de um programa de Reprodução Assistida, qual seja, aumentar as chances de gestação e de bebês nascidos de suas pacientes.Por outro lado, no caso das anomalias pós-meióticas, que têm a mesma freqüência em todas idades maternas (cerca de 33%, Muné, 2006) e estão diretamente relacionadas com dismorfismos embrionários, como velocidade das clivagens, irregularidade dos blastômeros, grau de fragmentação e multinucleação, esses parâmetros podem ser de grande valia para a exclusão da maior parte dos embriões cariotipicamente anormais, especialmente quando utilizados em conjunto para a elaboração de um sistema de classificação embrionária cumulativo ou combinado, como alguns autores têm utilizado com sucesso para a seleção do blastocisto a ser transferido em programas de transferência de um único embrião (De Fish et al., 2001; De Placido et al, 2002 ; Rienzi et al., 2002; Sjöblom et al., 2006; Scott et al., 2007).Cabe ainda citar o papel do antígeno - G leucocitário humano (HLA-G) presente no meio de cultivo embrionário desde o terceiro dia de desenvolvimento (Meniccuci et al., 1999). Esse antígeno parece representar um marcador importante de sobrevivência e implantação embrionária visto que, quando detectado em concentrações elevadas no meio de cultivo, ele está associado a clivagens mais aceleradas e potenciais de gestação e implantação maiores (Fuzzi et al., 2002). Mais recentemente, o uso prospectivo da medição dos níveis de HLA-G no meio de cultivo para seleção embrionária provou ser um instrumento prognóstico poderoso de gestação e implantação (Sher et al., 2005). O grande problema da opção por esse critério de seleção é a metodologia em si, bastante mais trabalhosa e que requer ensaios laboratoriais e reagentes específicos, os quais certamente elevarão os custos do tratamento.Em um futuro próximo, a avaliação do desempenho fisiológico do embrião in vitro deverá ser o indicador mais forte de viabilidade e de potencial de implantação e gestação por refletir mais diretamente a constituição cromossômica do embrião. Nesse sentido, a analise do metabolismo embrionário medido em termos de captação de aminoácidos do meio de cultivo (Brison et al, 2004), da análise do proteoma embrionário (Katz-Jaffe et al., 2006) ou ainda o registro das taxas de respiração embrionária (Lopes et al, 2007) são tecnologias emergentes que deverão ser implementadas nos laboratórios de reprodução assistida humana dentro de poucos anos.Em conclusão, é correto assumirmos que, no momento, não há um único método capaz de indicar, em um grupo de embriões, aquele com maiores chances de implantação e gestação. Podemos, entretanto, embasar nossa escolha em critérios fisiológicos como a dinâmica dos pronúcleos e nucleoli, a clivagem e a compactação precoce, ausência de fragmentação e, preferencialmente, considerar esses parâmetros em conjunto para a seleção do embrião com maior potencial de implantação e gestação.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Balaban B.,Yakin K., Urman B. - Randomized comparison of two different blastocyst grading systems. Fertil Steril 85: 559-563, 2006.
17. Gosden R. - Genetic test may lead to waste of healthy embryos. Nature 445: 372, 2007.
46. Sundström P.-Interpretations of multinucleation-is it ever normal? Fertil Steril 86: e3 , 2007.