JBRA Assist. Reprod 2007;11(3):39-42
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.2007.11.3.08
Maturação In Vitro de Oócitos Obtidos de Pacientes com a Síndrome dos Ovários Policísticos em Ciclos sem Estimulação Ovariana Controlada: Resultados Iniciais
In Vitro Maturation of Oocytes from Patients with Polycystic Ovarian Syndrome without Controlled Ovarian Stimulation. Preliminary Results
1Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz, Porto Alegre, RS
2Departamento de Ciências Morfológicas, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
RESUMO
O presente trabalho tem por objetivo descrever o primeiro relato nacional sobre maturação in vitro de oócitos obtidos de pacientes com a síndrome dos ovários policísticos, em ciclos sem estimulação ovariana controlada. Dez pacientes foram encaminhadas ao programa. Oócitos foram coletados de todas pacientes de folículos medindo 2 - 8 mm entre o 8o.. e 10o.. dia do ciclo. Não houve diferença significativa entre as taxas de oócitos que maturaram às 24 e às 48 horas pós-coleta, nem entre as taxas de fertilização nos dois grupos (p<0.005). Noventa e dois por cento (n=34) dos oócitos fertilizados clivaram ao estágio de duas células, mas apenas 5 (13%) deles apresentaram clivagem precoce às 27 horas pós-inseminação. Todas as pacientes obtiveram embriões para transferência, mas a qualidade dos embriões, segundo critérios morfológicos e sua dinâmica de clivagem foi bastante pobre. Não obtivemos qualquer gestação nesta série de pacientes. Acreditamos que a metodologia uma vez aperfeiçoada,representa uma alternativa viável para pacientes portadoras da síndrome dos ovários policísticos.
Palavras chave: ovários policísticos, maturação in vitro
SUMMARY
The present work aims to describe the first national report on in vitro maturation of oocytes collected from patients with the polycystic ovarian syndrome in cycles with no controlled ovarian stimulation. Ten patients were enrolled in the program. Oocytes were collected from all patients from follicles with 2-8mm in diameter between the 8o. and 10o. day of the cycle. There wasn’t any significant difference between the rates of oocyte maturation at 24 or 48 hours post collection or fertilization in the two groups (p<0.005). Ninety two percent of the fertilized oocytes (n=34) cleaved to the 2-cell stage, but only 5 (13%) of them showed early cleavage at 27 hours postinsemination. All patients had embryos for transfer, however, the quality of the embryos, according to morphological criteria and their cleavage dynamics, was very poor in this study. We did not obtain any pregnancy in this séries of patients. We believe that once the methodology has been improved, it represents a viable choice for patients with the polycystic ovarian syndrome.
Key words: polycystic ovaries, in vitro maturation.
INTRODUÇÃO
A maturação in vitro (IVM) de oócitos coletados a partir de ciclos não estimulados é uma tecnologia emergente que vem apresentando resultados bastante promissores em alguns centros de reprodução assistida mundiais. Apesar de a técnica estar apenas recentemente sendo explorada como uma alternativa em reprodução humana, ela tem longa data em reprodução animal principalmente na pecuária, em bovinos (Blondin et al., 2002). As vantagens do emprego da maturação in vitro de oócitos humanos incluem a não necessidade do uso de hormônios estimuladores do crescimento folicular e bloqueadores da hipófise, além da ausência total do risco de hiperestímulo ovariano e suas conseqüências indesejáveis.
As principais recomendações de IVM são os casos de ovários policísticos, casais com fertilidade anterior comprovada ou casais com infertilidade não relacionada a fator feminino (Jurema & Nogueira, 2006). No caso de mulheres portadoras da síndrome dos ovários policísticos com distúrbios menstruais ou ovários policísticos com ciclos menstruais regulares, as vantagens da metodologia são evidentes: elas possuem um número considerável de folículos para serem puncionados e não correm o risco de sofrerem o hiper estímulo, bastante freqüente neste grupo de pacientes.
A maioria dos relatos sobre a experiência dos centros de reprodução humana com maturação in vitro de oócitos humanos refere-se à maturação e fertilização de oócitos imaturos obtidos juntamente com os gametas maduros, em metáfase II, em ciclos de estímulo ovariano controlado. Poucos centros têm-se dedicado a captura de oócitos em pacientes não estimuladas com gonadotrofinas exógenas, para maturação e fertilização in vitro. Por este motivo, os relatos de maturação e desenvolvimento embrionário in vitro após maturação de oócitos obtidos de folículos com diâmetro entre 2 e 8mm em ciclos não estimulados são escassos e evidenciam a busca dos pesquisadores da melhora dos resultados obtidos em termos de implantações e de gestações levadas a termo.
O Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz iniciou as primeiras coletas de oócitos imaturos em ciclos não estimulados em 2005, especificamente para pacientes portadoras da síndrome dos ovários policísticos. Neste relato descrevemos nossa experiência com esta metodologia emergente e discutimos os resultados em relação ao descrito na literatura enfatizando especialmente as características do desenvolvimento embrionário após maturação in vitro dos oócitos.
MATERIAL & MÉTODOS
Dez pacientes, com idades entre 25 e 36 anos (média de 28,4 anos) portadoras da síndrome dos ovários policísticos foram encaminhadas para o programa de coleta de oócitos imaturos, sem qualquer estímulo hormonal durante a fase de crescimento folicular. Para inclusão das pacientes foram utilizados os critérios de Síndrome dos ovários policísticos do consenso de Rotterdan. publicados pelo grupo de Rotterdam ESHRE/ASRM (2004). Todas pacientes que concordaram participar do programa assinaram consentimento livre e esclarecido. Estas pacientes apresentavam diversos cistos foliculares pequenos entre 2 e 8mm de diâmetro, espalhados ao longo do córtex ovariano. As pacientes apresentavam ainda sintomas de hiperandrogenismo e/ou amenorréia ou oligomenorréia. Nenhuma das mulheres obteve gestação anterior ao tratamento e não respondiam adequadamente a estímulo ovariano induzido por citrato de clomifeno. As pacientes com amenorréia receberam acetato de medroxiprogesterona para induzir sangramento de privação.Todas as pacientes foram monitoradas por ultrassom no dia 2 do ciclo para assegurar a ausência de cistos ovarianos. Outra avaliação por ultrassom foi executada nos dias 7 ou 8 de maneira a excluir-se a presença de um folículo dominante. Os oócitos imaturos foram coletados entre o 8º e o 10o dia do ciclo, 36h após injeção de hCG (Ovidrel, Serono) utilizando-se uma agulha de 19-Gauge, especialmente desenhada pela fabricante Cook para aspiração de folículos imaturos, e pressão de sucção de 75 a 80 mmHg.
Os oócitos imaturos coletados foram isolados e incubados em placas contendo meio de maturação (Oocyte Maturation Médium, Sage, USA), já acrescido de fonte protéica e suplementado com 75UI de FSH, 75UI de LH (Menopour, Ferringer, Suecia) a 37o.C, 5% CO2 em atmosfera úmida por 24 ou 48 horas. Após as primeiras 24 horas de cultivo, os oócitos foram denudados pela exposição à hialuronidase (Sage) e avaliados para a ausência de vesícula germinativa e presença de primeiro corpúsculo polar. Os oócitos que atingiram o estágio de MII foram inseminados por ICSI, 3 a 4 horas após a denudação. Fertilização foi avaliada 18 horas após ICSI pela presença de dois pronúcleos. Os zigotos obtidos foram cultivados em meio Embryo Mantenance Medium (Sage) por 72 horas antes da transferência, quando a avaliação morfológica foi executada (Veeck, 1999) e os embriões com melhores índices foram transferidos para as pacientes.
Para o preparo do endométrio, as pacientes receberam valerato de estradiol oral (6mg), a partir do dia da coleta dos oócitos. Todas pacientes apresentaram endométrio de espessura igual ou superior a 7 mm, adequado à transferência no 2o. ou 3o. dia pós-inseminação sendo portanto e estádio de desenvolvimento dos embriões variável em uma mesma paciente. Suporte lúteo foi feito pela administração de progesterona micronizada (600mg/dia), a partir do dia da fertilização.
RESULTADOS
Foi coletado um total de 111 oócitos, 11 em média por paciente. Deste total, 35.1% (39/111) atingiram o estágio de MII em 24 horas e outros 22.1% (25/111) atingiram o mesmo estágio em 48 horas de cultivo (P<0.005), perfazendo um total de 64 oócitos em MII (57% dos gametas coletados). Após ICSI, 51% (23/39) dos oócitos que atingiram MII em 24 horas e 48% (12/25) daqueles que atingiram MII em 48 horas apresentaram 2PN (P<0.005). Destes zigotos, 92% (34/37) clivaram ao estágio de 2 células. Apenas 5 embriões (13%), quatro de 24 horas de maturação e um de 48 horas de maturação, apresentaram clivagem precoce ao estágio de 2 células. Todas as pacientes obtiveram embriões para transferência. Foram transferidos 33 embriões no dia 2 ou 3 de desenvolvimento embrionário, sendo a media de 3,3 embriões por paciente. Apenas 4 pacientes obtiveram embriões no estágio de 7-8 células, no terceiro dia do desenvolvimento. A Tabela I apresenta um resumo das características dos dez ciclos de coleta, maturação in vitro e transferência realizados nesta série de pacientes. Nenhum embrião foi classificado como grau I, apenas 6 embriões (18%) obtiveram classificação GII, sendo os restantes todos classificados como GIII, GIV ou GV, portadores de fragmentos e irregularidades dos blastômeros. Não houve congelamento de embriões excedentes. Não obtivemos gestação neste grupo de pacientes.
Tabela I. Características da fertilização e desenvolvimento embrionário pós-maturação in vitro de oócitos coletados em ciclos sem estímulo ovariano controlado.
DISCUSSÃO
Nossos resultados demonstram que a coleta, maturação e fertilização in vitro de oócitos obtidos a partir de ciclos utilizando apenas a gonadotrofina coriônica anterior à coleta é um procedimento factível para o tratamento de infertilidade em pacientes com ovários policísticos. Esta metodologia evita a hiperestimulação ovariana e os riscos e custos associados a ela. A prevalência de hiperestímulo especialmente em pacientes jovens portadoras de síndrome dos ovários policísticos pode ser de até 6% (MacDougall et al., 1993; Brisden et al., 1995). Embora diversas estratégias tenham sido criadas para prever e evitar esta complicação, nenhuma delas é inquestionavelmente segura. O único método confiável é evitar a estimulação com FSH (Orvieto, 2005).
Desde o trabalho pioneiro de Cha e colegas em 1991, diversos estudos em diferentes centros descreveram o uso da maturação in vitro de oócitos coletados em ciclos não estimulados (Trounson et al., 1994; Tan & Child, 2002; Cha et al., 2000; Chian et al., 2000; Child et al., 2001; Mikkelsen & Lindenberg, 2001; Lê Du et al., 2005; Al-Sunadi et al., 2007; Ge et al., 2007). Ao nosso entender, esta é a primeira descrição do mesmo processo realizado no Brasil, especificamente para pacientes portadoras da síndrome dos ovários policísticos.
A média de 11 oócitos coletados por pacientes neste estudo está bastante próxima aos resultados apresentados em trabalhos anteriores (Trounson et al., 1994; Cha et al., 2000; Child et al., 2001; Lin et al., 2003; Cha et al., 2005; Lê Du et al., 2005;..Al-Sunaidi et al., 2007), apesar de ser mais baixa que relatos mais recentes (Ge et al., 2007). Cinqüenta e sete por cento dos oócitos coletados imaturos atingiram o estágio de metafase II após 24 ou 48 horas de cultura indicando capacidade de maturação nuclear in vitro comparável a resultados publicados anteriormente (Lê Du et al., 2005; Vlaisavljević et al., 2006; Ge et al., 2007). O presente estudo utilizou hCG, 36 horas antes da coleta dos oócitos. Assunto ainda controverso, alguns estudos (Chian et al., 2000; Son et al., 2002; Lê Du et al., 2005; Son et al., 2007) demonstram taxas mais elevadas de desenvolvimento embrionário e gestações, a partir do uso de hCG (10.000IU) antes da coleta dos gametas. Por outro lado, quando a qualidade dos embriões foi analisada em relação à multinucleação e fragmentação dos blastômeros, o grupo de pacientes que recebeu hCG antes da coleta apresentou taxas significativamente inferiores destes parâmetros comparado com o grupo que não recebeu hCG (Vlaisavljević et al., 2006).
Dentre os zigotos obtidos neste estudo, o desenvolvimento embrionário até o dia 2 foi bastante satisfatório no sentido de que apenas 3 zigotos apresentaram bloqueio de desenvolvimento inicial, um fenômeno esperado com certa freqüência quando da maturação in vitro, devido à interrupção do crescimento e desenvolvimento in vivo da estrutura folicular e do oócito nela contido (Trounson, 2001). Entretanto, a qualidade dos embriões clivados ao terceiro dia foi bastante pobre. Dentre os 33 embriões transferidos às 10 pacientes, nenhum foi classificado como grau I. A grande maioria dos embriões transferidos apresentou atraso no desenvolvimento, diferentes graus de fragmentação e blastômeros não homogêneos, além de apresentarem baixo índice de clivagens precoces comparados a embriões de ciclos estimulados (Bos-Mikich, 2001).Único trabalho anterior que também menciona sobre a baixa qualidade morfológica dos embriões de IVM foi do grupo francês de Lê Du e colaboradores (2005). Tais características provavelmente estejam relacionadas com alterações cromossômicas incompatíveis com desenvolvimento embrionário e implantação, geradas durante o processo de maturação in vitro. Esta situação ganhou relevância a partir do estudo utilizando microscopia confocal do fuso metafásico e a constituição cromossômica de oócitos maturados in vitro (Li et al., 2005). Estes gametas apresentaram um índice de anomalias do fuso e de configuração dos cromossomos cerca de três vezes superior aos oócitos maturados in vivo. Trabalho ainda mais recente confirmou o retardo no desenvolvimento e o elevado índice de anomalias cromossômicas em embriões gerados a partir de oócitos maturados in vitro em presença ou não do esterol estimulador da meiose presente no fluído folicular (Lundin et al., 2007).
Visto que o sucesso da maturação in vitro é profundamente dependente das condições de cultivo (Chian, 2004), o grande desafio para a aplicação rotineira da IVM em reprodução humana é identificar e controlar as variáveis ambientais que certamente estão influenciando na qualidade dos embriões produzidos e conseqüentemente na dificuldade em obtermos gestações, a partir destes embriões. Interessante notar que, com exceção de um trabalho em que a média de embriões transferidos por paciente foi de 1,6 (Sönderström-Anttila et al., 2005), a maioria dos estudos relata a transferência de um numero elevado de embriões, de 3 a 6 (Cha et al., 2005; Al-Sunaidi et al., 2007, Ge et al., 2007), em um momento em que há uma tendência mundial para a transferência de uma menor quantidade embrião nas pacientes de IVF/ICSI de ciclos estimulados. Por outro lado, muito pouco ainda é conhecido sobre os fatores envolvidos na maturação citoplasmática, que são acumulados no oócitos durante o crescimento folicular e que serão responsáveis pelo desenvolvimento embrionário e fetal subseqüente.
Provavelmente, as condições atuais de IVM não estão permitindo a completa aquisição de competência citoplasmática dos oócitos, enquanto que a competência nuclear é relativamente fácil de ser alcançada. Certamente, fatores extrínsecos ao gameta imaturo, do sistema de coleta e cultivo, originalmente desenvolvidos para oócitos maturos pré-ovulatórios podem estar afetando a competência destes gametas a se desenvolverem e atingirem uma gestação. Um exemplo desta situação é dado pelo trabalho recente de Hashimoto e colaboradores (2007), o qual mostrou que em um programa de IVM, oócitos coletados com uma agulha de 20 G e pressão de 180mmHg tem significativamente melhor desenvolvimento embrionário e atingem numero significativamente maior de gestações, do que aqueles coletados com vácuo de 300mmHg. Entretanto, semelhante ao estudo de Ge e colaboradores (2007) que, como nós, utilizaram pressão entre 75 e 80mmHg, com excelentes resultados de desenvolvimento embrionário e gestações, acreditamos que esta medida de sucção é apropriada para a coleta de oócitos imaturos em pacientes com ovários policísticos. Outro fator que também deve estar contribuindo para as baixas taxas de sucesso de ciclos de IVM em termos de implantações e nascimentos, é a não-sincronia inerente do processo, entre as etapas de maturação citoplasmática e nuclear (Trounson, 2001; Combelles et al., 2002; Lanzendorf, 2006).
CONCLUSÃO
Em conclusão, vários trabalhos têm demonstrado que oócitos humanos maturados in vitro não tem a mesma capacidade de desenvolvimento que aqueles coletados de folículos maduros. Entretanto, esta é uma tecnologia ainda experimental apresentando resultados não plenamente favoráveis em todos os centros procurando estabelecer a tecnologia. Pode-se assumir que os eventos fundamentais da maturação para que o gameta adquira sua total competência de desenvolvimento não ocorram de forma apropriada durante o processo in vitro. Mais estudos são necessários para determinar quais adequações ao sistema de coleta e de cultivo são necessárias de maneira a tornar a maturação in vitro mais bem sucedida, em diferentes centros de reprodução assistida mundiais. Certamente, a experiência de um número maior de casos de IVM nos fornecerá os elementos necessários para aprimoramentos da metodologia.
Apesar de suas limitações, acreditamos que a oferta e aplicação de IVM para pacientes cientes e esclarecidas sobre o procedimento e suas limitações têm o potencial de oferecer a um grupo seleto de pacientes, chances de gestação em ciclos não estimulados.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Al-Sunaidi M., Tulandi T., Holzer H., Sylvestre C., Chian R.C., Tan S.L. - Repeated pregnancies and live births after in vitro maturation treatment Fertil Steril 87: 1212e9-1212e12, 2007.