JBRA Assist. Reprod 2007;11(4):9-13
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2007.11.4.02
A Morfologia da Amostra Seminal não Prediz os Resultados em Ciclos de ICSI
Sperm Sample Morphology is not Correlated with ICSI Outcomes
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RESUMO
OBJETIVO: A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) tem sido utilizada para o tratamento de infertilidade, particularmente em casos de alteração seminal grave. O papel do espermatozóide no sucesso da ICSI ainda é controverso, assim como a correlação entre a morfologia espermática na amostra seminal e a qualidade do único espermatozóide utilizado para injeção. O presente estudo teve como objetivo investigar se avaliação da morfologia espermática na amostra seminal está relacionada aos resultados em ciclos de ICSI.
MATERIAIS E MÉTODOS: Noventa ciclos de reprodução assistida foram realizados no período de Agosto de 2004 à Março de 2005. As amostras seminais foram obtidas por masturbação e processadas por migração ascendente de espermatozóides. Antes e após o processamento, foi realizada análise seminal completa e a avaliação da morfologia de acordo com o critério estrito de Kruger. As mulheres foram submetidas a estímulo ovariano controlado através da administração do agonista de GnRH associada ao FSH recombinante. Trinta e seis horas antes da punção oocitária foi administrado hCG recombinante para a maturação oocitária final.
RESULTADOS: Após a ICSI, 535 embriões foram avaliados em relação à fertilização, morfologia de pró-núcleo, clivagem precoce e morfologia, número de células no segundo e terceiros dias de desenvolvimento (dia da transferência). A correlação entre a porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais (pré e pós preparo) e sucesso da ICSI foi analisada, e foi observado um aumento significativo na porcentagem de espermatozóides com morfologia normal quando comparadas as amostras pré e pós processamento (2,3% vs 4,5%, P<0,001). Foi também observada uma diferença significativa na concentração, motilidade total e motilidade progressiva das amostras pré versus pós preparo (81,4 ± 54,6 vs 4,4 ± 8,3, p<0,001; 63,9% vs 91,4%, p<0,001; 54,3% vs 84,4%, p<0,001, respectivamente).
CONCLUSÃO: Nossos resultados não apresentaram correlação significante entre a porcentagem de espermatozóides com morfologia normal em toda amostra, antes ou após o processamento, e os parâmetros relacionados ao sucesso da ICSI, como taxa de fertilização (P=0,602 e P=0,894, pré e pós processamento, respectivamente); morfologia de pró-núcleo (P=0,289 e P=0,316, pré e pós processamento, respectivamente); clivagem precoce (P=0,224 e P=0,604, pré e pós processamento, respectivamente) e morfologia embrionária no terceiro dia de desenvolvimento (P=0,113 e P=0,807, pré e pós processamento, respectivamente). Sabe-se que a seleção do espermatozóide com melhor morfologia e motilidade para injeção é realizada pelo embriologista. Portanto concluímos que a morfologia dos espermatozóides humanos de acordo com o critério estrito de Kruger não possui valor preditivo no sucesso da ICSI.
Palavras-chave: ICSI, morfologia, espermatozóide
ABSTRACT
OBJECTIVE: Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) has become the treatment of choice of severe male factor of infertility. The role of the spermatozoa in the success of ICSI is controversial. We hypothesized that the sperm sample morphology is correlated to the quality of the single sperm used for ICSI, therefore the aim of the present study was to investigate whether embryo quality is influenced by the sample morphology in ICSI cycles and to compare sperm morphology pre and post-swim-up.
MATERIAL AND METHODS: Ninety assisted reproduction cycles were performed between August 2004 and March 2005. All semen samples were obtained by masturbation and processed by swim up. Before swim-up, routine semen analysis was performed and such before as after sperm preparation, morphology was assessed by Kruger strict criteria. The women were submitted to controlled ovarian hyperstimulation achieved by a long pituitary down regulation using a GnRH agonist followed by ovarian stimulation with recombinant-FSH. Third six hours before ovum pick-up rhCG was administrated to trigger ovulation. After ICSI, 535 embryos were assessed for normal fertilization, pro-nuclei morphology, early cleavage and morphology and number of cells on the second and third day of development (day transfer). Correlation between percentage of normal sperm morphology (pre and post-swim-up) and ICSI outcomes were analyzed.
RESULTS: Our results didn’t show any significant correlation between the percentage of normal sperm morphology on the whole sample, neither before nor after swim-up, and the ICSI outcomes parameters evaluated, such as normal fertilization rate (P=0,602 and P=0,894 for pre and post swim-up respectively); pro-nuclei morphology (P=0,289 and P=0,316 pre and post swim-up respectively); early cleavage evaluation (P=0,224 and P=0,604 pre and post swim-up respectively) and embryo morphology in the third day of development (P=0,113 and P=0,807 pre and post swim-up respectively).
CONCLUSIONS: Our findings demonstrated that there are no correlations between morphological assessment of the semen sample and ICSI outcomes. Indeed, the embryologist selects the spermatozoa with better morphology and motility for ICSI. Therefore, we concluded that morphology in human spermatozoa sample according to Kruger´s criteria has no predict value for ICSI outcomes.
Key-words: ICSI, morphology, spermatozoa
INTRODUÇÃO
Atualmente, sabe-se que por volta de um em cada seis casais terá problemas de fertilidade em algum estágio de sua vida reprodutiva. A infertilidade causada por fator masculino acomete aproximadamente 50% dos casais que procuram centros de reprodução humana assistida (RHA) (Donnelly et al., 1998; Maduro et al., 2003; Salgado Jacobo et al., 2003) e desde o primeiro relato de sucesso, a injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) tem sido especialmente usada para casos de alteração seminal grave, (Palermo et al., 1992; Van Steirteghem et al., 1993; Bartoov et al., 2003).
Diferentes parâmetros têm sido utilizados para avaliação seminal, como concentração, motilidade e morfologia (Host et al., 2001). A técnica mais comumente utilizada para avaliação da morfologia espermática é o critério estrito de Kruger (Kruger et al., 1986; Menkveld et al., 1990; Yang et al., 1995) onde todas as formas limítrofes são consideradas anormais.
O papel do espermatozóide no procedimento da ICSI é controverso. Em condições naturais, a interação entre o espermatozóide e óvulo envolve uma série de eventos bioquímicos e fisiológicos, tais como reconhecimento específico, adesão e fusão entre os gametas (Ciapa and Chiri, 2000). O último estágio desse processo é a ativação oocitária que culmina com a formação dos pronúcleos masculino e feminino, início da síntese do DNA e clivagem (Yanagimachi, 1994). Porém, quando o espermatozóide é injetado diretamente no citoplasma, o gatilho para a ativação oocitária é produzido pela própria manipulação do ooplasma (Tesarik et al., 2002).
Um estudo prévio relatou que a porcentagem de espermatozóides com morfologia normal na amostra seminal tem alta correlação com as taxas de fertilização, sugerindo que a morfologia do espermatozóide seja um importante fator preditivo dos resultados da ICSI. (Sukcharoen et al., 1995)
Entretanto, estudos mais recentes têm proposto que a avaliação da morfologia espermática, isoladamente, pode não ser um parâmetro fidedigno para predizer sucesso da ICSI. Huang et al. (2005) relataram que a morfologia do espermatozóide deve ser cuidadosamente associada à investigação da motilidade. Além disso, tem sido descrito que a morfologia espermática não está relacionada à integridade da cromatina do espermatozóide, e espermatozóides com DNA intacto têm sido considerados essenciais para fertilização e desenvolvimento embrionário (Moustafa et al., 2004).
Esterhuizen et al. (2002) sugerem que a qualidade do empacotamento da cromatina do espermatozóide pode estar associada à falha de fertilização e previamente foi relatado que defeitos durante a descondensação da cromatina sejam uma das maiores causa de falha de fertilização (Nikolettos et al., 1999).
O presente estudo teve como objetivo investigar se avaliação da morfologia espermática na amostra seminal está relacionada aos resultados de ciclos de ICSI,.
MATERIAIS E MÉTODOS
Noventa pacientes submetidos a tratamento de RHA, entre Agosto de 2004 à Março de 2005, concordaram com a realização de todos os procedimentos descritos nesse estudo, através do preenchimento de termo de consentimento livre esclarecido. Este estudo obteve aprovação através do comitê de ética e pesquisa do Hospital Professor Edmundo Vasconcelos.
As amostras de sêmen ejaculado foram obtidas por masturbação, após três a cinco dias de abstinência ejaculatória, coletadas em frasco plástico e estéril e enviadas para análise e processamento seminal.
A análise seminal foi realizada de acordo com as normas da Organização Mundial de Saúde (World Health Organization, 1999) e a morfologia através do critério estrito de Kruger tanto antes quanto após o processamento seminal (Kruger et al., 1986; Menkveld et al., 1990; Yang et al., 1995)
O processamento seminal foi realizado por migração ascendente de espermatozóides e para tal a amostra de sêmen foi lavada, adicionando-se o mesmo volume de meio de cultura (HEPES -
Irvine Scientific, Santa Ana, USA) e centrifugada por 8 minutos a 300g. O precipitado foi coletado, adicionado a 1mL do mesmo meio de cultura e incubado por uma hora a 37ºC, com o tubo inclinado à 45o. Após este período, foi retirado 0,5mL do sobrenadante e enviado ao laboratório de fertilização in vitro para utilização dos espermatozóides na técnica de ICSI.
A indução da ovulação foi realizada através de bloqueio com agonista do GnRH (acetato de leuprolide, Lupron, Abbott Laboratories, Illinois, USA) por pelo menos 14 dias. Para a superovulação foi utilizado FSH recombinante (Gonal-F®; Serono Laboratórios, São Paulo, Brasil) em doses decrescentes, até que no mínimo dois folículos tivessem atingido um diâmetro de aproximadamente 18 mm e 36 horas antes da punção, foi administrado hCG recombinate (Ovidrel; Serono Laboratórios, São Paulo, Brasil). para a maturação oocitária final. A punção foi realizada sob anestesia geral, guiada por ultra-sonografia trans-vaginal.
O procedimento de ICSI foi realizado com oócitos em metáfase II de acordo com a técnica descrita por Palermo et al. (1992). Após a ICSI, os oócitos foram incubados em meio de cultura não tamponado (Human Tubal Fluid -HTF com 5% Human Albumin Serum, HSA, Irvine Scientific, Santa Ana, USA) cobertos com óleo mineral (Oil for embryo culture + 30% Multiblast Médium, Irvine Scientific, Santa Ana, USA) por 16-18 hs, quando foi confirmada a fertilização normal (dia +1), pela presença de dois pró-núcleos distintos e extrusão do segundo corpúsculo polar.
Durante a checagem da fertilização foram classificados como pré-embriões bons ou ruins, baseando-se na comparação de tamanho dos pró-núcleos e discrepância de nucléolos.
A transferência embrionária ocorreu no terceiro dia de desenvolvimento e os embriões foram avaliados diariamente do dia da fertilização até o dia da transferência e classificados como bons ou ruins de acordo com a morfologia e ritmo de clivagem. Aqueles embriões com quatro blastômeros no segundo dia de desenvolvimento ou oito blastômeros no terceiro dia de desenvolvimento e até 20% de fragmentação foram considerados embriões de alta qualidade.
A gestação positiva foi confirmada pela dosagem de β-hCG realizada 12 dias após a transferência embrionária e a implantação confirmada pela detecção de saco gestacional com batimento cardíaco positivo, através de ultra-sonografia.
A correlação entre a porcentagem de espermatozóides com morfologia normal (pré e pós migração ascendente de espermatozóides) e sucesso da ICSI foi analisada por coeficiente de correlação de Pearson e teste não paramétrico Mann-Whitney. A significância estatística foi determinada quando P = 0.05.
RESULTADOS
O presente estudo incluiu 90 ciclos de ICSI, onde foram utilizados, para a microinjeção, espermatozóides móveis provenientes do ejaculado. As mulheres com idade média 34,3 ± 4,8 anos, índice de massa corpórea (IMC) médio de 22,8 ± 4,75 e nível de estradiol no dia do procedimento de 2065,7 ± 1711,8, receberam dose média de FSH por ciclo de 2480,3 ± 756,0 UI,
Em relação aos parâmetros espermáticos, quando comparados os valores das amostras pré e pós preparo por migração ascendente de espermatozóides foi observada uma diferença significativa entre os valores de concentração (81,4 ± 54,6 vs 4,4 ± 8,3, P <0,001, respectivamente), motilidade total (63,9% vs 91,4%, P <0,001, respectivamente) e motilidade progressiva (54,3% vs 84,4%, P <0,001, respectivamente) . Houve um aumento significante na porcentagem de morfologia normal dos espermatozóides pós processamento quando comparada à morfologia pré migração ascendente (2,3% vs 4,5%, P<0,001).
Foram avaliados 535 embriões. Não foi observada nenhuma correlação significante entre porcentagem de espermatozóides com morfologia normal na amostra total, antes ou após migração ascendente e os resultados de ICSI avaliados como taxa de fertilização normal, morfologia de pró-nucleo, clivagem precoce e morfologia no terceiro dia de desenvolvimento (Tabela I).
Tabela I. Correlação entre parâmetros avaliados pré e pós migração ascendente de espermatozóides e taxa de fertilização normal, morfologia de pró-núcleo, clivagem precoce e morfologia dia+3.
Dos embriões avaliados, 285 foram transferidos e 139 foram criopreservados. Neste estudo pudemos observar uma taxa de gestação de 28% e taxa de aborto de 19%.
DISCUSSÃO
O preparo seminal através da técnica de migração ascendente é frequentemente utilizado para aumentar a concentração de espermatozóides normais na amostra de sêmen. Porém, estudos anteriores que avaliaram a integridade genética de amostras seminais provenientes da migração ascendente, observaram que a taxa de anomalias cromossômicas após o processamento são similares àquelas da amostra de sêmen inicial (Samura et al., 1997; Van Dyk et al., 2000; Calogero et al., 2003). Por outro lado, outros autores relataram uma redução na concentração de espermatozóides diplóides após o processamento por migração ascendente (Han et al., 1993; Martinez-Pasarell et al., 1997; Li and Hoshiai, 1998).
No presente estudo, a migração ascendente de espermatozóide foi capaz de melhorar a qualidade seminal em relação à motilidade e morfologia, entretanto, não observamos qualquer correlação entre a morfologia espermática, quer seja antes ou após o processamento seminal, e os resultados dos ciclos de ICSI.
A relevância da morfologia espermática como elemento determinante na concepção assistida tem despertado muito interesse, sendo este fator de maior significância entre os parâmetros espermáticos avaliados na análise seminal convencional. Entretanto, ainda não se sabe ao certo o quanto à morfologia está correlacionada a habilidade do espermatozóide em promover a fertilização, ou se a presença de espermatozóides anormais em uma amostra seminal pode influenciar negativamente o sucesso da ICSI (Donnelly et al., 1998).
Ainda que as taxas de sucesso do ICSI tenham sido inicialmente relatadas como independentes da qualidade seminal (Kupker et al., 1995), estudos mais recentes têm sugerido que falhas repetidas após a ICSI sejam conseqüência da ação de fatores espermáticos relacionados ao desenvolvimento embrionário peri-implantacional, conhecidos como efeitos paternos (Tesarik, 2005; Tesarik et al., 2006).
De fato, diversos autores demonstraram que quanto pior a qualidade do sêmen pior a fertilização, desenvolvimento embrionário, implantação e gravidez (Gomez et al., 2000; Rossi- Ferragut et al., 2001; Rossi-Ferragut et al., 2003; Nicopoullos et al., 2004). Além disso, o efeito da fonte do espermatozóide para o sucesso da ICSI tem sido amplamente discutido. Nosso grupo descreveu em um estudo prévio que, em pacientes azoospérmicos, a qualidade embrionária difere dependendo da origem do espermatozóide. Além disso, pudemos observar que espermatozóides ejaculados e epididimários dão origem a embriões de melhor qualidade quando comparados àqueles provenientes de espermatozóide testicular (Rossi-Ferragut et al., 2003). Pasqualotto e cols também encontraram uma pior taxa de fertilização quando foram injetados espermatozóides testiculares, quando comparados ä injeção de espermatozóides epididimários (Pasqualotto et al., 2002) e maiores taxas de aborto foram observadas quando utilizados espermatozóides testiculares (Ghazzawi et al., 1998; Pasqualotto et al., 2002; Buffat et al., 2006).
Estudos prévios demonstraram também que pacientes com alterações seminais têm maiores taxas de aneuploidia quando comparados a pacientes férteis ou pacientes sem alteração seminal (Calogero et al., 2003; Vicari et al., 2003; Aittomaki et al., 2004; Burrello et al., 2004). Também foi verificada maior incidência de erros epigenéticos e danos em DNA em espermatozóides de homens com alterações seminais importantes (Seli and Sakkas, 2005; Emery and Carrell, 2006; Tesarik et al., 2006).
Contudo, os resultados do presente estudo mostraram que a avaliação morfológica da amostra seminal não está relacionada à fertilização e desenvolvimento embrionário. Nossos achados estão de acordo com estudos que indicaram que o resultado de ciclos de ICSI não está correlacionado com a morfologia da amostra usada para a microinjeção (De Vos et al., 2003). A explicação para essa observação é o fato de o embriologista selecionar espermatozóides de melhor motilidade e morfologia para a injeção.
Uma vez usados para microinjeção espermatozóides morfologicamente normais e móveis, a taxas de fertilização e gestação após a ICSI não são afetadas. Por outro lado, ainda que resulte em fertilização e clivagem, a injeção de espermatozóides morfologicamente anormais resulta em taxas de gestação mais baixas assim como maiores taxas de aborto (Tasdemir et al., 1997)
Dessa maneira, podemos concluir que a morfologia de amostras de espermatozóides humanos, de acordo com o critério estrito de Kruger, não possui valor prognóstico para o sucesso da ICSI. O desenvolvimento de novos métodos de avaliação espermática são de extrema importância na identificação dos melhores espermatozóides a serem utilizados em procedimentos de ICSI.