JBRA Assist. Reprod 2007;11(4):20-24
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2007.11.4.04
Fertilização In-vitro com Meios de Cultivo GV
In Vitro Fertilization = GV Culture Media
Materbaby - Reprodução Humana e Genética Av. XV de Novembro, 1232, Maringá - Pr - CEP: 87.013-230
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi relatar nossa experiência com os meios de cultivo GV, produzidos no Brasil, como alternativa aos meios importados. Em nosso país, a importação destes produtos tem frequentemente nos trazido problemas, principalmente, na dificuldade de armazenamento e na pontualidade das entregas. Usamos os meios GV em 100 pacientes com transferência de embriões no dia 3 após coleta oocitária. Obtivemos taxas de fertilização de 71,44%, de gravidez clínica de 38,77% e de implantação de 14,75%. Estes resultados são semelhantes àqueles descritos na literatura, porém com taxas homogêneas de implantação e gravidez. Portanto, a partir de nossa experiência, podemos concluir que os meios GVs produzidos no Brasil apresentam resultados semelhantes aos importados, com a vantagem de poderem ser usados com menor prazo de validade sem sofrer as oscilações de temperatura e armazenamento durante o transporte.
Unitermos: meio de cultura, fertilização in-vitro, embriões humanos.
ABSTRACT
The objective of this work was to report our experience with GV culture media, produced in Brazil, as alternatives to imported media. In our country, the import of these products has frequently caused problems, especially in regard to difficulties in storage and logistics. We have used The GV media in 100 patients with embryo transfer on day 3 after oocyte pick-up. We have obtained fertilization rates of 71.44%, ongoing pregnancies of 38.77% and implantation of 14.75%. These results are similar to those described in the literature, but with fewer oscillations in the implantation and pregnancy rates. Therefore, we conclude that the GV media produced in Brazil, present similar results to imported media, with the advantage of being used fresher without the great oscillations in temperature and storage conditions experienced during transportation.
Key words: culture médium, in vitro fertilization, human embryos.
FERTILIZAÇÃO IN-VITRO COM MEIOS DE CULTIVO GV
INTRODUÇÃO
O primeiro desafio que a fertilização artificial teve foi o de criar um ambiente que mimetizasse o tubário com probabilidade de se reproduzir artificialmente o início da vida. A busca de se criar um fluido que oferecesse aos gametas a oportunidade de se desenvolver foi iniciada com a purificação da água que deveria ser utilizada para este propósito. (Fleetham et al. 1988). Além da água, naturalmente, foram necessários estudos para definir a composição de sais e nutrientes que oferecessem suporte para o desenvolvimento embrionário. (Behr et al., 1990); (Gianaroli et al., 1989); (Holst et al., 1990) Somado a estas necessidades tornou-se imperativo um ambiente que mantivesse as condições básicas para os embriões, ou seja, ambiente com estabilidade de temperatura e umidade possibilitando manutenção de pH e osmolaridade. Vários pesquisadores têm, desde então, proposto várias combinações de sais, aminoácidos, adição de soro, soro albumina, concentrações altas ou baixas de glicose, na tentativa de oferecer as melhores condições possíveis para o desenvolvimento embrionário. (Mehta et al., 2001); (Quinn et al., 2004); (Simon.et al., 2003) Desde os primórdios, quando os poucos serviços de Reprodução preparavam seus próprios meios de cultura, até no momento, quando temos grandes indústrias especializadas na produção destes, pouca coisa mudou. As taxas de gravidez e implantação variam bastante entre os diversos serviços, sendo muito baixas na maioria deles, e mesmo os melhores resultados estão longe de ser o que gostaríamos. Mais recentemente tem-se estudado a necessidade de gametas e embriões de acordo com seu desenvolvimento e tentando dar suporte compatível com tal necessidade (Artini et al., 2004); (Gardner et al,. 2000); (Loutradis et al., 2000) Vários autores tem ressaltado a importância da ausência de endotoxinas nos meios (Artini et al., 2004); (Dumoulin et al., 1991); (Steyaert et al., 2000), enquanto outros tem estimulado o cultivo de longa duração na tentativa de aumentar a taxa de gestação ou minimizar a taxa de gestação múltiplas. (Gardner et al., 2000); (Karaki et al., 2002); (Schoolcraft et al., 2001). Naturalmente hoje temos boas formulações que nos possibilitam termos bom desenvolvimento embrionário no laboratório. Porém, em nosso país, a importação destes produtos tem frequentemente nos trazido problemas principalmente quanto ao preço, na dificuldade de armazenamento ou na pontualidade das entregas. Na tentativa de diminuir estas dificuldades temos desenvolvido meios há cinco anos. Relatamos nossa experiência com os meios de cultivo GV, produzidos no Brasil, com transferência de embriões no dia 3 após coleta oocitária como alternativa aos meios importados.
MATERIAIS E MÉTODOS
Pacientes
Após aprovação pelo comitê de ética do Hospital Almodin, 100 pacientes foram submetidas à fertilização in-vitro com a utilização de meios de cultivo GV. Este estudo envolveu pacientes com idade entre 20 a 46 anos, durante o ano de 2006, que necessitaram de procedimentos de fertilização in-vitro. A causa da infertilidade foi 43% fator masculino. Nos casos restantes, em 13% foram múltiplas causas, 12% infertilidade sem causa aparente e em 32% exclusivamente problemas femininos. A inclusão das pacientes no estudo ocorreu após avaliação propedêutica de rotina e com consentimento prévio.A estimulação ovariana foi realizada em 40 casos com acetato de leuprolide (Lupron; TAP Pharmaceutical, Abbot Laboratories, Chicago, U.S.A.); 0,15 ml/dia, iniciado entre o vigésimo primeiro ao vigésimo terceiro dia do ciclo menstrual até o início da menstruação seguinte. No terceiro dia de sangramento era iniciada a indução, com redução do Lupron para 0.05 ml/dia e a estimulação ovariana era iniciada com hormônio folículo estimulante - FSHr (Gonal F - Serono Brasil) 150-450 UI/dia por oito dias quando era realizada a primeira ecografia para avaliação do desenvolvimento folicular. A indução era mantida até que pelo menos dois folículos estivessem entre 18 a 20 mm de diâmetro. Em 60 pacientes foi realizada indução sem bloqueio hipofisário. A indução era iniciada no segundo dia menstrual com a utilização de FSHr (Gonal F - Serono Brasil) 150-450 UI/dia nos cinco primeiros dias seguidos de HMG 150 - 450 UI/dia (Merional (Meizler, São Paulo) 75-225 UI/dia. Em ambos protocolos quando visualizado pelo menos dois folículos entre 18 a 20 mm de diâmetro foi administrado 10.000 UI de HCG (Choriomon - Meizler, São Paulo). Os ovócitos foram aspirados 34-36 horas após a injeção de HCG usando punção ovariana transvaginal guiada pelo ultra-som.
Fertilização in-vitro
Os ovócitos colhidos foram lavados em GV hepes (Ingamend, Maringá, Brasil), transferidos para placas contendo meio de cultura GV (Ingamed, Maringá, Brazil) com 10% de soro sintético (Irvine Scientific, EUA) sob óleo mineral (Sigma, EUA), e mantidos em incubadora (Forma modelo 3159) a 37°C, com atmosfera contendo 6% de CO2 e umidade de 97%. O sêmen foi preparado através de gradiente descontínuo (55 /90%; Pharmacia, Uppsala, Sweden). Nos casos de infertilidade por fator masculino os ovócitos foram submetidos à injeção intra-citoplasmática. Tal procedimento era realizado 3 a 6 horas, após a coleta dos ovócitos, quando denudados com o auxílio de hialuronidase (Irvine Scientific, EUA). Nos casos onde os parâmetros do sêmen eram adequados foi realizada a inseminação dos ovócitos com 100.000 espermatozóides/ml.Para realização da micromanipulação, foi utilizado o microscópio invertido Diaphot 300 (Nikon, Japan) equipado com contraste de fase Hoffman, sob aumento de 400X. Ao microscópio foram adaptados micromanipuladores hidráulicos MMO-204D e injetores IM6 (Narishige, Tokyo, Japão). O procedimento iniciava-se com a identificação, imobilização e aspiração de um único espermatozóide a partir de uma gota de GV hepes contendo polivinilpirrolidona (Irvine Scientific, EUA). Os ovócitos foram mantidos por uma pipeta de sustentação, enquanto o espermatozóide foi injetado.
Cultivo dos embriões e transferência uterina
No caso dos ovócitos submetidos ao ICSI, após este procedimento ter sido terminado, eles eram transferidos para micro gotas de 50 ul de meio de cultura GV com 10% de soro sintético (Irvine Scientific,EUA) sob óleo mineral. até 4 ovócitos por micro gota). Quando a fecundação foi realizada através da inseminação, os pré-embriões (2 prónúcleos) eram então transferidos para as placas contendo as micro gotas de 50 ul de GV com 10% de soro somente no momento da confirmação da fecundação, 15 a 18 horas após a fertilização. O congelamento dos embriões quando realizado, era em pró-núcleo segundo protocolo proposto por Check et al. (1996). O mesmo aconteceu nos casos de criopreservação de ovócitos ou embriões divididos (4 células a blastocisto), através do método de vitrificação segundo Massashige e colaboradores (Massashige et al., 2005)Os embriões eram mantidos em cultivo até o dia 3 pósfertilização, quando eram transferidos para o útero das pacientes. A fase lútea foi suplementada com 50 mg/IM/dia de progesterona injetável. A gravidez foi definida pela presença de gestação viável e batimento cardíaco presentes após a 13° semana pós-tranferência.As variáveis qualitativas foram representadas por freqüência absoluta (n) e relativa (%).
RESULTADOS
Das 100 pacientes submetidas aos procedimentos de fertilização in-vitro, 10 foram receptoras de oócitos. Do total das pacientes, em 45 foi realizado o procedimento de injeção intra-citoplasmática de espermatozóides, e nas demais (55) foi realizado inseminação em meio de cultura, conforme descrito em materiais e métodos. A taxa de fertilização não foi diferente entre os dois procedimentos realizados para fertilização, 69,91% nos casos com inseminação e 72,98% nos casos com ICSI. Em 1 caso apenas, quando a inseminação foi realizada, houve falha de fertilização. A média dos oócitos colhidos por paciente foi 10,92 e a média do número de embriões transferidos foi 3,01 (tabela I). Houve congelamento de oócitos ou embriões em 20 pacientes.
Tabela I. Descrição das taxas obtidas com o meio GV no ano de 2006.
A taxa de implantação obtida foi de 14,75%, com taxas de gravidez clínica e aborto de 38,77 % e 7,14% respectivamente (tabela I).
DISCUSSÃO
Desde a década passada ressurgiu o interesse quanto aos meios de cultura utilizados na fertilização in-vitro. Infelizmente durante este tempo mais confusão que consenso parece ter-se obtido sobre a composição do meio. Desenvolvimento in-vitro de embriões humanos 48-72 h após a fertilização pode ser obtido usando-se uma variedade de meios, desde soluções balanceadas simples a meios mais complexos.
Dois grandes problemas surgem ao formular um meio quimicamente: primeiro, a seleção dos componentes a serem incluídos no meio e segundo a determinação da concentração de cada um dos componentes selecionados. Atualmente, os componentes dos meios de cultura consistem principalmente de substâncias comuns a todos os fluidos. Poucos deles são específicos do oviduto, e alguns são produtos químicos artificiais não encontrados naturalmente. O número de componentes pode ser pequeno, definindo o meio como simples o qual contém somente 12 componentes ou meio complexo, o qual contém mais que 12 componentes (Summers et al., 2003).
Acreditava-se que as concentrações das substâncias às quais são incorporadas aos meios de cultura, deveriam ser próximas às concentrações às quais os embriões são naturalmente expostos. Este princípio foi primeiramente usado por Tervit (1972) em cultura de ovelhas. Entretanto, há evidências em estudos com ratos que as concentrações das substâncias do fluido no oviduto não necessariamente suportam o desenvolvimento de embriões pré-implantação (Summers et al., 2003). Esse fato foi primeiramente observado em estudos com K+. Embora o fluido do oviduto de rato contenha maiores concentrações de K+ (~ 25 mmol/l) (Roblero et al., 1976; Borland et al., 1977). Quinn e colaboradores encontraram máximo desenvolvimento quando as concentrações de potássio giraram em torno de 2,3 a 5,1 mmol/l (Quinn et al., 1985). Outro grupo encontrou que os embriões desenvolveramse melhor quando a concentração de K+ foi < 6 mmol/l (Wiley et al., 1986).
Análises do fluido do oviduto e do útero através do ciclo hormonal revelam mudanças na concentração de carboidratos tanto dentro do ciclo como entre o oviduto e o útero. Gardner e Lane verificaram que os níveis de glicose no oviduto são mais baixos quando o ovócito /pré-embrião estão presentes (0,5mM), enquanto o piruvato está aumentado (0,32 mM) e no útero a glicose alcança um pico de 3,15 mM e o piruvato está bem diminuído (0,1mM). Baseados principalmente nesses achados surgiram os meios seqüenciais, cuja idéia baseia-se na divisão do período pré-implantacional em 2 fases. A primeira corresponde ao estágio de clivagem do embrião, caracterizado por níveis baixos de biossíntese, baixa capacidade respiratória e limitada capacidade de utilizar glicose como fonte de energia Já no período pós-compactação as taxas de biossíntese aumentam, assim como a capacidade respiratória e a habilidade para utilizar glicose (Gardner et al., 1997). Nenhum consenso quanto à utilização ou não dos meios seqüenciais parece ter-se obtido nesses últimos 10 anos. Parece bem estabelecido apenas que até o período pré-compactação as exigências dos embriões são realmente menores, ou seja, é possível mantê-los em cultura em meios chamados simples, já após esse período são necessários meios mais complexos com vitaminas e aminoácidos, por exemplo.
Sempre quisemos trabalhar com meios seqüenciais, na tentativa de diminuir o número de embriões transferidos para as paciente, mas infelizmente, nossa primeira tentativa não foi um sucesso como gostaríamos. Observando os excelentes resultados de Schoolcraft et al. (1999) com o uso de meios seqüenciais resolvemos incluir o meio G1.2 e G2.2 em nosso serviço. Infelizmente, comparando os resultados do uso de G1 e G2 com o cultivo em células Vero que era o já adotado em nosso serviço anteriormente, não observamos diferenças significativas entre os resultados verificados. A taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e 14% com células Vero e G1.2/G2.2 respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientes engravidaram com uma taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1.2/G2.2 as taxas de gravidez e implantação foram 28,9% com 14,9% respectivamente (Almodin et al., 2001). Uma diferença importante entre o estudo de Schoolcraft et al. (1999) e o nosso é que nós usamos o G1/G2 “comercial” no cultivo dos embriões, meio este que passou por transporte e provavelmente oscilações de temperatura, entre outras, que poderiam causar danos aos embriões. Infelizmente, no Brasil não temos nenhuma empresa nacional que produza meios de cultura para embriões, com isso quando começamos a utilizar o lote do meio ele já está preparado há algum tempo, devido à dificuldade de acesso aos produtos importados. Como as maiorias dos meios de cultura têm uma validade curta, fica bastante difícil sua utilização dentro das melhores condições.
Resolvemos, então, verificar se poderíamos melhorar nossos resultados com meios preparados em nosso próprio Serviço, com validade de apenas 3 semanas e controle de qualidade com embriões bovinos. Os meios de cultura podem ser preparados “em casa” ou obtidos comercialmente. O aumento do uso de produtos comerciais tem sido devido à consideração prática e econômica, pois a preparação dos meios “em casa” pode ser mais laboriosa e requer equipamentos específicos, além, da dificuldade em estabelecer um controle de qualidade. Em contrapartida, nos meios comerciais existem variáveis não controladas, como a origem e pureza dos componentes envolvidos, além, de sua composição não ser claramente definida. Existem poucos estudos comparando meios preparados “em casa” e comercialmente (Staessen et al., 1994; Karamalegos et al., 1999). E nos últimos anos apenas comparações entre os diferentes meios comerciais têm sido realizadas (Van Langendonckt et al., 2001).
Karamelagos e Bolton fizeram um estudo comparando o uso da solução balanceada Earle’s (EBSS) preparada “em casa” com um meio equivalente muito próximo produzido pela Medi-cult (IVF Medium; Medi-Cult, Redhill, Surrey, UK). Os dois meios diferem na composição apenas no suplemento de antibiótico e proteína usados e na concentração de piruvato. Não houve diferença significante nas taxas de fertilização, gravidez ou implantação entre os dois grupos. No entanto diferença estatisticamente significante entre os dois grupos foi identificada no número de ciclos com falha de fertilização, e na taxa de clivagem de embriões que desenvolveram 2 PN. Muitos ciclos resultaram em falha de fertilização quando os ovócitos foram inseminados em meio Medi-Cult (10/230) que em EBSS (1/218), apesar da inseminação com espermatozóides aparentemente normais. Dos 10 ciclos que resultaram em falha de fertilização, 6 obtiveram fertilização e transferência de embriões em seus subseqüentes ciclos de tratamento. Embriões em estágio de pró-núcleo sofreram a primeira divisão mais rapidamente em Medi-Cult que em EBSS. Embriões que clivam mais rapidamente parecem ter um potencial de implantação maior, entretanto não houve diferença na taxa de implantação entre os dois meio (Karamalegos et al., 1999).
No trabalho de Karamalegos & Bolton eles obtiveram falha de fertilização em 10/230 ciclos quando usaram o IVF da Medi-cult, sendo que 4 foram usando o mesmo lote de meio, entretanto mais 12 ciclos foram realizados com o mesmo meio resultando em fertilização. Foi comentado no trabalho que não houve diferença significativa nas taxas de fertilização, clivagem, morfologia embrionária, implantação e gravidez com relação aos diferentes lotes, mas, como os dados não são mostrados, fica difícil dizer se esses resultados excluíram ou não os ciclos com falha de fertilização da análise estatística. Outra questão importante que não fica clara é se as falhas de fertilização ocorreram próximas aos prazos de validade dos lotes. Por esse motivo, resolvemos usar um meio preparado “em casa”, com um prazo de validade mais curto que os meios comerciais apresentam, tentando minimizar possíveis transtornos quanto á validade e transporte do meio, devido á nossa dificuldade em adquirir produtos não nacionais.
Em nosso estudo, em que utilizamos o meio GV, denominado e preparado por nós, obtivemos taxas de gravidez clínica de 38,77 %, com 7,14% de aborto, demonstrandose superior a outros anos, com o uso de outros meios. Apenas quando utilizamos células Vero os resultados foram semelhantes. Nosso meio é considerado em termos de literatura um meio simples para transferência até o dia 3 de desenvolvimento, portanto não acreditamos que os constituintes sejam os responsáveis pelos resultados. O principal resultado de nosso estudo foi a homogeneidade dos nossos resultados em termos de lote. Não houve diferença em termos de taxas de gravidez e implantação de acordo com os lotes (dados não mostrados). Acreditamos que seja devido ao fato do prazo de validade de apenas 3 semanas determinado aos meios de cultivo GV, além de não termos tido oscilações devidas a transporte. Tivemos apenas uma falha de fertilização, o que é bastante encorajador, visto que muitas clínicas no Brasil adotaram fazer ICSI em todas as suas pacientes, para evitar esse problema. Baseado em nossos resultados, acreditamos que a utilização de meio de cultura de mais fácil acesso pode interferir com os resultados. Pretendemos fazer outras formulações de meios mais complexos inclusive para cultura até blastocisto, para maiores avaliações.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Almodin, C. G., Minguetti-Câmara, V. C., Pereira, L. A. C. Cultura de embriões até o estágio de blastocisto: comparação entre o uso de meios seqüenciais e de co-cultura.RBGO, 23:589-595, 2001.