JBRA Assist. Reprod. 2008;12(1):15-20
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.1.03
Influência do ácido hialurônico presente no meio de transferência embrionária na taxa de implantação em pacientes com idade avançada
Hyaluronic acid supplemented medium and its influence in implantation rates in older women
SEGIR - Serviço de ecografia genética e reprodução humana Mostardeiro 5/601 Porto Alegre 90430-001
Resumo
Objetivo: Avaliar o efeito de um meio para transferência embrionária, suplementado com ácido hialurônico (AH), nas taxas de implantação e gestação, comparando parâmetros de qualidade embrionária a estas em pacientes com idade avançada submetidas à fertilização in vitro.
Métodos: Ensaio clínico prospectivo não randomizado. Foram incluídas 128 pacientes, com idade ≥35 anos e embriões para transferência, de janeiro de 2004 a junho de 2005. Os 128 ciclos obtidos foram divididos em 69 ciclos com AH e 59 ciclos com albumina sérica humana ( HSA).
Resultados: Foram similares, média de idade nos grupos de 38,6 ± 2,87 vs. 38,5 ± 2,6 anos, embriões transferidos (161 vs. 157) e embriões transferidos/paciente (2,33 ± 1,28 vs. 2,66 ± 1,17). As taxas de implantação e gestação foram superiores para o grupo com AH (19,3% e 36,2%) respectivamente, comparadas ao grupo com HSA (14,6% e 32,2%).
Conclusão: O meio com AH apresentou uma elevação nas taxas de implantação e gestação, sem diferenças estatisticamente significativas e houve manutenção da taxa de implantação independente da qualidade embrionária, indicando possível efeito positivo no processo de implantação em pacientes com idade avançada.
Palavras-chave: Ácido hialurônico, implantação, gestação, idade avançada.
Abstract
Objective: To evaluate the effect of using an embryos transfer (ET) medium supplemented with hyaluronic acid (HA) on the implantation and pregnancy rates, as well as to compare embryo quality parameters to those rates in advanced aged patients under in vitro fertilization treatment.
Methods: Case-control prospective non-randomized study. This study included 128 patients were age ≥35 years who were under in vitro fertilization and ET treatment from January 2004 and June 2005. Group A had 69 cycles with ET medium supplemented with HA and Group B had 59 cycles with medium containing human serum albumin (HSA).
Results: There was no significant statistic difference between groups concerning patients’ age (38.6 ± 2.87 years vs. 38.5 ± 2.6 years), number of embryos transferred (161 vs. 157) and number of embryos transferred for each patient (2.33 ± 1.28 vs. 2.66 ± 1.17). Implantation and pregnancy rates in group HA, being 19.3% and 36.2%, respectively, in group HAS, which had implantation rate of 14.6% and pregnancy rate of 32.2%.
Conclusion: The medium supplemented with HA presented increase on implantation and pregnancy rates, although with no statistically significant differences. The implantation rate of the ET medium with HA presented no linear tendency related the embryo quality; implantation was independent of embryo quality. The supplementation of HA in the ET medium presented positive effect on the implantation process for advanced aged patients.
Key Words: Hyaluronic acid, implantation, pregnancy, advanced age.
INTRODUÇÃO
A capacidade reprodutiva feminina decresce ao longo dos anos e a idade avançada está associada à redução da fertilidade tanto in vivo quanto in vitro. Em procedimentos de reprodução assistida, as taxas de gestação e implantação diminuem a partir dos 35 anos, e são extremamente pobres em mulheres acima de 40 anos (Dew, Don et al,1998).
Os constantes aperfeiçoamentos nos sistemas de cultivos despertaram, recentemente, questionamentos sobre a necessidade do desenvolvimento de meios específicos para a transferência embrionária. Schoolcraft et al (2001) sugerem que a utilização de um meio mais apropriado para os embriões no momento da transferência possa oferecer vantagens ao processo de implantação.
Estudos demonstraram que um candidato prospectivo para aumentar a funcionalidade do meio de TE e possivelmente aumentar as taxas de implantação é o ácido hialurônico (AH). O AH é um glicosaminoglicano, encontrado em abundância na matriz extracelular. Apresentase de maneira fisiológica no trato reprodutivo, estando presente no muco cervical, no complexo cumulus-oophorus, no fluído folicular, e no plasma seminal (Eppig,1999 e Binette, Ohishi et al, 1996) . É o glicosaminoglicano em maior quantidade no fluido uterino e parece estar relacionado ao processo de adesão célula-célula e célula-matriz. Este estudo tem o objetivo de avaliar o efeito da utilização de um meio para TE, acrescido de ácido hialurônico e albumina humana recombinante, nas taxas de gestação e implantação, assim como comparar parâmetros de qualidade dos embriões transferidos a estas taxas em mulheres com idade avançada.
MATERIAL E MÉTODOS
Estimulação ovariana
A estimulação ovariana utilizada em ambos os grupos iniciou-se com 4mg de estradiol no 20° dia do ciclo anterior até o segundo dia do ciclo em questão. A partir do 3º dia iniciava-se a aplicação de hormônio Folículo Estimulante recombinante, seguida de controle ecográficos seriados, sendo introduzido análogo anatgonista de hormônio liberador de gonadotrofina quando os folículos atingiam ≅ 14mm.A administração de 5000UI de Gonadotrofina coriônica humana (hCG) subcutânea ocorreu quando dois ou mais folículos atingiram o diâmetro de 16mm. As aspirações foliculares foram realizadas 34 - 36 horas após a administração do hCG. Os oócitos foram direcionados tanto para fertilização in vitro convencional como para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, de acordo com critérios prévios de qualidade seminal e falhas de fertilização, sendo em meio IVF (Vitrolife, Suécia) até o segundo dia após a fertilização, quando ocorreram as TEs.
Seleção das pacientes
Foram incluídas 128 pacientes, correspondentes a 128 ciclos, submetidas à fertilização in vitro e TE na Clínica SEGIR - Serviço de Ecografia, Genética e Reprodução Humana, no período de janeiro de 2004 a junho de 2005. Critérios de inclusão: idade igual ou superior a 35 anos e um ou mais embriões para transferência no segundo dia após a fertilização. Grupo A, formado por 69 ciclos realizados no período de setembro de 2004 a junho de 2005 e o grupo B, por 59 ciclos entre janeiro de 2004 a agosto de 2004.
Avaliação da qualidade embrionária
Os critérios para avaliação da qualidade embrionária seguiram os padrões descritos por Terriou, Sapin et al ( 2001). Os parâmetros de avaliação utilizados foram, o escore cumulativo dos embriões (CES) transferidos e a média de escores dos embriões transferidos (MSTE). O escore baseava-se em 4 pontos, de acordo com critérios de qualidade embrionária, sendo um ponto para cada critério: embriões clivados, ausência de fragmentação (ou fragmentação >20% do embrião), ausência de irregularidades no tamanho ou formato dos blastômeros e embriões no estádio de 4 células, permitindo para cada embrião uma variação de 1 a 4 pontos. O número máximo de embriões/transferência foi de 4 embriões. O CES foi obtido através da soma dos escores individuais dos embriões transferidos e o MSTE obtido a partir da divisão do CES pelo número de embriões transferidos. O CES variou de 1 a 16 pontos e o MSTE de 1 a 4 pontos. Para comparação com as taxas de implantação e gestação os escores foram segregados em quatro intervalos. O CES em intervalos de 1 a 4, de 5 a 8, de 9 a 12, de 13 a 16 pontos e o MSTE, de 1 > 1,5; de 1,5 > 2,5; 2,5 > 3,5; e 3,5 ≥ 4,0 pontos.
Transferência embrionária
Em ambos os grupos os embriões permaneceram em equilíbrio de 10 minutos nos respectivos meios antes da TE. O meio suplementado com 0,5 mg/ml de AH e rAH (EmbryoGlue -Vitrolife, Suécia) foi utilizado no grupo A e no grupo B o meio IVF com 10% de HSA (Vitrolife, Suécia). Todas as etapas laboratoriais foram realizadas pelo mesmo operador durante os diferentes períodos. Todos os embriões foram transferidos com visualização e auxílio de ultra-som abdominal e cateter Wallace 1816N (Smiths Medical International, Reino Unido).Foi utilizado de suporte a progesterona natural micronizada via vaginal, na dose diária de 600mg, a partir da punção folicular.A dosagem de β-hCG ocorreu 14 dias após a TE e foram definidas como gestações clínicas todas aquelas com presença de saco gestacional visualizado por ultra-som transvaginal.
Análise estatística
Os resultados das taxas de implantação e gestação obtidas a partir das transferências embrionárias do grupo A foram comparados aos resultados do grupo B. Os CES e MSTE foram comparados às taxas de implantação e gestação em ambos os grupos. A tendência linear foi avaliada para o grupo A e B em relação ao CES e ao MSTE para Taxas de implantação e gestação. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. Para análise dos resultados utilizamos o teste qui-quadrado (χ2) e/ou teste T de Student, ou Fisher quando apropriado, sendo considerado estatisticamente significativo quando p<0,05. As análises foram realizadas utilizando o programa estatístico SPSS 11.0.
RESULTADOS
Comparação dos grupos com as taxas de implantação e gestação
A média de idade e o número de embriões transferidos foram similares em ambos os grupos (tabela 1). A idade variou de 35 a 46 anos no grupo A, e de 35 a 45 anos no grupo B. Todos os parâmetros de idade, causa de infertilidade, protocolos de indução e utilização de fertilização in vitro convencional ou com injeção de espermatozóide apresentaram médias similares em ambos os grupos, sem diferenças estatisticamente significativas. A taxa de gestação demonstrou-se superior no grupo A comparada ao grupo B (tabela 1), assim como a Taxa de implantação (31/161 vs. 23/157 sacos gestacionais/ embriões transferidos) grupos A e B respectivamente, entretanto, sem diferenças estatisticamente significativas. Podemos observar um aumento também no número de abortos espontâneos no grupo A em comparação com grupo B (tabela 1), sem diferenças estatisticamente significativas.
Tabela 1. Resultados clínicos dos ciclos de transferência embrionária para os dois grupos em estudo.
Escore cumulativo dos embriões (CES)
Os grupos A e B apresentaram uma distribuição comparável dos CES nos intervalos avaliados (tabela 2). A figura 1 mostrou uma associação linear entre a Taxa de implantação e o CES, para o grupo B (P 0,02), existindo um decréscimo linear na Taxa de implantação do maior intervalo de CES para o menor (P 0,02). Por outro lado, o grupo A não apresentou tendência linear para os intervalos de CES, demonstrando uma manutenção da Taxa de implantação (figura 1). A figura 2 mostra uma tendência linear entre a Taxa de gestação e o CES, apresentando melhores taxas para os intervalos de CES maiores, para ambos os grupos A e B (P 0,01 e P 0,02) respectivamente.
Tabela 2. Distribuição de ciclos entre os intervalos de CES para os grupos A e B.
Figura 1. Taxa de implantação dos grupos A e B para os intervalos de CES. Grupo A (barras azuis), não demonstrou tendência linear (P = 0,45) e correlação (τ = 0,10) entre a taxa de implantação e os intervalos de CES. O grupo B, (barras roxas), demonstrou uma tendência linear (P < 0,02) e correlação (τ = 0,17) entre as variáveis em estudo.
Figura 2. Taxa de gestação dos grupos A e B para os intervalos de CES. Grupo A (barras azuis) e grupo B (barras roxas), ambos apresentaram tendência linear entre as variáveis em estudo, (P < 0,01 e P < 0,02, respectivamente) e correlação (τ = 0,39 e τ = 0,36, respectivamente).
Média de escore dos embriões transferidos (MSTE)
Os grupos A e B apresentaram uma distribuição comparável dos MSTE nos intervalos avaliados (tabela 3). O grupo A apresentou taxas de implantação (figura 3) e gestação (figura 4) similares para os quatro intervalos de MSTE, demonstrando que as taxas de implantação e gestação apresentam-se elevadas para todos os intervalos MSTE, mostrando uma manutenção da implantação independente da qualidade embrionária. O grupo B apresentou um aumento linear de acordo com MSTE maiores, para implantação (P 0,004) e gestação (P <0,001). Existindo um decréscimo linear do maior intervalo de MSTE para o menor (P <0,001) em relação à Taxa de implantação (figura 3) e da mesma forma para a Taxa de gestação (figura 4).
Tabela 3. Distribuição de ciclos entre os intervalos de MSTE para os grupos A e B.
Figura 3. Taxa de implantação dos grupos A e B para os intervalos de MSTE. Grupo A (barras azuis), não apresentou tendência linear (P = 0,358) e correlação (τ = 0,07) entre a taxa de implantação e os intervalos de MSTE. O grupo B (barras roxas), apresentou uma tendência linear (P < 0,004) e correlação (τ = 0,26) entre as variáveis em estudo.
Figura 4. Taxa de gestação dos grupos A e B para os intervalos de MSTE. Grupo A (barras azuis), não apresentou tendência linear (P = 0,335) e correlação (τ = 0,09) entre a taxa de gestação e os intervalos de MSTE. O grupo B (barras roxas), apresentou uma tendência linear (P <0,001) e correlação (τ = 0,46) entre as variáveis em estudo.
DISCUSSÃO
O decréscimo da capacidade reprodutiva feminina ao longo dos anos pode ser observado pela redução da fertilidade tanto in vivo quanto in vitro em mulheres com idade avançada. Estudos como de Kenny (1994), e Segal e Casper (1990), demonstraram, em pacientes submetidas à fertilização in vitro, uma correlação estreita com a redução da fertilidade a partir dos 35 anos e Piette, Mouzon et al (1990) demonstraram esta a partir dos 37 anos.
No presente estudo, avaliamos o efeito de um meio enriquecido com 0,5mg/ml de AH utilizado no momento da TE em pacientes com idade avançada. As taxas de gestação e implantação apresentaram-se elevadas, no grupo que utilizou AH quando comparado ao grupo suplementado com HSA, entretanto, sem diferenças estatisticamente significativas.
As perdas gestacionais não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, entretanto, podemos observar uma elevação na taxa para o grupo A em comparação com o grupo B, podendo ser um reflexo dos fatores relacionados à idade. Pacientes com idade avançada, normalmente recrutam um número pequeno de oócitos; juntamente com o declínio da reserva ovariana, ocorre um aumento na incidência de aneuploidias nos oócitos, sendo um fator significativo para as altas taxas de abortos espontâneos encontradas neste grupo de pacientes (Richardson e Nelson,1990). O aumento da idade está diretamente relacionado com o decréscimo da qualidade embrionária (Chetkowski, Rode et al,1991). Alguns estudos demonstram que não somente a qualidade oocitária e embrionária como também diversos fatores de receptividade uterina estão envolvidos no declínio das taxas de implantação e aumento nas taxas de perdas gestacionais com o aumento da idade (Hull, Fleming et al, 1996).
O aumento do número de embriões implantados no grupo suplementado com AH sugere um possível efeito promotor de AH no processo de implantação. O aumento do número de perdas gestacionais neste grupo reflete outros fatores associados ao avanço da idade, não sendo a implantação suficiente para suplantar estes demais fatores relacionados ao declínio reprodutivo.
Em um estudo prospectivo randomizado com pacientes de diferentes idades, divididas em dois grupos, um utilizando meio de TE suplementado com 0,5mg/ml de AH e outro com meio acrescido de 0,125mg/ml de AH, apresentaram para o primeiro grupo taxas de gestação e implantação de 26,6% e 11,5%, e para o segundo grupo 30,4% e 25,5%, respectivamente. No estudo de Ravhon, a suplementação aumentada de AH não agregou valores às taxas de gestação e implantação, as quais apresentaram-se similares em ambos os grupos (Navot D, Bergh,1996)[13]. Entretanto, Hazlett et al avaliando o efeito da suplementação com AH no meio de TE em pacientes com resposta ovariana normal, divididas em grupos com TE no terceiro ou no quinto dia, obtiveram melhores taxas de gestação e implantação nos grupos suplementados com AH [14]. As taxas de gestação e implantação demonstraram-se aumentadas na presença de AH no meio de TE para os dois diferentes momentos de TE, porém não foram encontradas diferenças significativas.
O estudo de Gardner et al com camundongos demonstraram um aumento na implantação e no desenvolvimento fetal de embriões na presença de AH no meio de TE, sugerindo uma regulação de AH no processo de interação do embrião com endométrio [15].
Simon et al demonstraram que o AH pode substituir a albumina no meio de TE utilizado em embriões humanos, proporcionando taxas de gestação e implantação comparavelmente aumentadas [16].
Nosso estudo demonstrou que a presença de AH no meio de TE proporcionou taxas de implantação similares para embriões de diferentes qualidades embrionárias quando comparado ao meio com HSA. No grupo suplementado com AH a implantação ocorreu de maneira independente à qualidade embrionária quando comparado com o meio de TE com HSA o qual apresentou uma associação linear entre os parâmetros de avaliação da qualidade e Taxa de implantação. Estes dados sugerem um efeito promotor do AH no processo de implantação do embrião, possibilitando aos embriões melhores taxas de implantação de forma independente a qualidade embrionária, melhorando as condições do processo de implantação. O grupo com meio acrescido com HSA apresentou baixas taxas de implantação para embriões de pouca qualidade e um aumento das taxas de acordo com o crescente aumento da qualidade embrionária.
O estudo de Terriou et al. demonstrou uma forte correlação para CES e MSTE em relação à Taxa de gestação [5]. Em nosso estudo uma tendência linear pode ser observada entre o CES e a Taxa de gestação para ambos os grupos, entretanto o MSTE não seguiu uma tendência linear com a qualidade embrionária para o grupo suplementado com AH, apresentando uma manutenção da Taxa de gestação para os diferentes intervalos avaliados.
Terriou et al demonstram uma queda na Taxa de gestação em pacientes acima de 38 anos, em todos os intervalos de MSTE avaliados, quando comparadas as pacientes com idade igual ou inferior a 37 anos. Observaram uma distribuição de MSTE no grupo acima de 38 anos similar à encontrada nos demais grupos com idade inferior, demonstrando que a qualidade dos embriões não depende da idade. Sugerem que o decréscimo nas taxas de gestação de pacientes com idade avançada não esta relacionado à qualidade embrionária, mas sim ao declínio da receptividade uterina.
Muitos são os possíveis mecanismos pelos quais, o AH possa apresentar um efeito promotor no processo de implantação. O AH encontra-se liberado na matriz extracelular e está envolvido na formação da matriz, no processo de adesão célula-célula e célula-matriz, na proliferação e migração celular, apresentando também co-receptores para fatores de crescimento, podendo estar relacionado, de alguma maneira, ao processo inicial de interação, aposição, adesão e invasão do blastocisto no endométrio [16,17,18].
O AH é o principal glicosaminoglicano presente nos fluídos foliculares e uterinos, e fluidos dos ovidutos propiciando uma alta viscosidade à estes micro-ambientes [19,20,21]. A presença do AH talvez possa facilitar a rápida difusão do conteúdo do meio de transferência dentro da cavidade uterina. O meio contendo uma apropriada concentração de AH apresenta uma maior viscosidade em comparação aos meios de TE contendo apenas proteínas [22].
A síntese de ácido hialurônico aumenta substancialmente no dia em que a implantação normalmente ocorre [23]. Em contraste com este aumento, a síntese da maioria dos outros glicosaminoglicanos permanece constante durante o estádio de peri-implantação [24].
Na avaliação dos grupos a Taxa de implantação apresentou-se superior na presença de AH no meio de TE. Ainda que sem diferenças significativas, o número de embriões implantados é superior com esta suplementação. A expressão de receptores de AH nas células endometriais e nos embriões humanos e de mamíferos em geral, sugere uma possível função do AH no processo de implantação embrionário [25,26,27]. A expressão de CD44, um receptor de AH, nos embriões e nas células endometriais e deciduais, indicam um possível envolvimento desta molécula no processo de implantação [28,29].
Outro tipo de receptor para AH, RHAMM/IHABP, é expresso pelo embrião no estádio de pré-implantação e com níveis mais elevados no estádio de blastocisto expandido [30].
O mecanismo envolvido na implantação embrionária relacionado ao efeito do AH ainda não é claro. A presença deste no meio de transferência possivelmente se pronuncie de maneira mais importante em estádios mais avançados de desenvolvimento embrionário, quando há um aumento na expressão de receptores específicos para AH e onde a sinalização entre o blastocisto e o endométrio ocorre de maneira crucial.
Este estudo demonstrou que a suplementação do meio de TE, com AH, proporcionou uma elevação nas taxas de implantação e gestação para pacientes com idade avançada, entretanto sem diferenças estatisticamente significativas. Na avaliação dos parâmetros de qualidade dos embriões transferidos e Taxa de implantação o meio suplementado com AH demonstrou uma sustentação das taxas independente a qualidade embrionária, sugerindo uma melhor interação embrião-endométrio. Aparentemente a suplementação com AH apresenta um efeito positivo no momento de implantação embrionária.
A presença de AH no meio de TE melhorando as condições do processo de implantação embrionária pode otimizar as chances de implantação dos embriões. Esta possibilidade pode auxiliar em uma redução no número de embriões transferidos sem queda nas taxas de gestação e implantação e ao mesmo tempo, evitando as gestações múltiplas, principalmente para grupos de pacientes mais jovens.
Estudos prospectivos randomizados, direcionados a grupos específicos, com suplementação de AH no meio de TE para embriões em estádios mais avançados de desenvolvimento embrionário podem demonstrar uma otimização dos resultados de gestação e implantação.