JBRA Assist. Reprod. 2008;12(1):32-39
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.1.05
Uso da trealose intracelular na vitrificação de oócitos bovinos maturados
Intracell trehalose in vitrification of matured oocytes
Universidade Estadual do Norte Fluminense Centro de Medicina Reprodutiva - Origen
Financiamento: Fundação de apoio a pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Resumo
Introdução: A criopreservação de oócitos é alternativa que possibilitará a preservação do futuro reprodutivo em mulheres que tenham que adiar a maternidade por desejo próprio ou tratamento. Poderá ser alternativa para o congelamento de embriões em casais submetidos a técnicas de reprodução assistida. Até o momento, não existem resultados consistentes com congelamento de oócitos, estando indefinido o melhor protocolo de congelamento.
Objetivo: Determinar a efetividade da trealose como crioprotetor intracelular na vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro.
Metodo: estudo experimental com oócitos bovinos. Grupos: controles (maturados-Tc, penetrados-Tp e microinjetados-Tm) e os grupos da vitrificação (microinjetados com trealose-Tmv, crioprotetores penetrantes-Tvde e eletropermeabilizados com trealose-Tev). Avaliou-se a capacidade de retorno ao volume isotônico, integridade de membrana (marcação com iodeto de propídio) e alterações glicoproteicas da zona pelúcida (marcação com lectinas).
Resultados: A taxa de retorno ao volume isotônico após a desvitrificação mostrou resultado superior para o grupo Tev, com trealose (80%); oócitos dos tratamentos Tmv e Tvde apresentaram índices de 55 e 68%, respectivamente. Oócitos do tratamento Tev foram os de menor taxa de extrusão citoplasmática (13%). A avaliação da integridade de membrana, resultou em ausência de marcação em 36 %(Tmv), 64% (Tvde) e 29%(Tev) dos oócitos. A marcação das glicoproteínas de superfície da zona pelúcida dos oócitos vitrificados não apresentou diferença entre os tratamentos.
Conclusão: Os resultados demonstram que a trealose intracelular é um importante agente crioprotetor para a vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro, mas estudos em humanos ainda deverão determinar sua aplicação em mulheres.
Palavras-chave: trealose, oócitos, microinjeção, vitrificação, eletropermeação
Abstract
Introduction: The technique of oocytes cryopreservation is a helpful tool for assisted reproduction as it can be used to preserve female reproductive capacity.Objective:To determine the effectiveness of trehalose as intracellular cryoprotectant in the vitrification of bovine oocytes matured in vitro.
Methods: The groups were controlled (Tc, Tp and Tm) and groups for vitrification (Tmv - microinjected with trehalose, Tvde - with penetrating crioprotectant and Tev-lectropermeabilizations with trehalose). After thawing we evaluated the capacity of cytoplasmic re-expansion, the integrity of membrane (marking with propidium iodide) and glycoprotein alterations of the pellucid zone (with lectins conjugated with fluorescein 5-isotiocianato FITC).
Results: The evaluation of the tax of return to the isotonic volume after thawing showed a superior result for the eletroporation oocyte with trehalose (80%). Oocytes of the treatments Tmv and Tev presented indices of 55 and 68%, respectively. In the same way the oocytes of the treatment Tev were the ones that presented low cytoplasmic drawing tax (13%). However the evaluation of the integrity of membrane, determined for the exclusion of the IP, resulted in absence of marking in 36%, 64% and 29% of the oocytes of the treatments Tmv, Tvde and Te, respectively. The marking of residues of manose and sialic acid of the surface of the pellucid zone of the oocytes after thawing did not present difference between the treatments, having all presented 100% of marking.
Conclusion: These results demonstrate that intracellular trehalose presents an important effect crioprotectant for the vitrification of bovine oocytes matured in vitro.
Key-words: trehalose, oocytes, microinjection, electropermeation.
INTRODUÇÃO
A criopreservação é técnica de conservação de tecidos e células por tempo indeterminado, mantendo as propriedades biológicas destas. Atualmente protocolos de criopreservação de fibroblastos, embriões, tecidos ovariano e de sêmen são aplicados na rotina de laboratórios, com sucesso. Apesar do congelamento de oócitos ser técnica ainda não estabelecida, sua aplicação é de grande interesse para a reprodução assistida. Uma vez que a técnica pode auxiliar no aproveitamento de oócitos excedentes de ciclos de FIV, formação de bancos, na preservação da qualidade e quantidade de oócitos de mulheres que querem adiar a maternidade, mulheres que serão expostas a tratamentos de quimioterapia e radioterapia, além de transpor a ética que envolve a criopreservação dos embriões (Eroglu et al., 2002; Chian et al., 2004).
Por ter características peculiares oócitos possuem baixa viabilidade no pós-descongelamento (Parks & Ruffing, 1992; Chen et al., 2003). O gameta feminino apresenta uma grande dimensão celular (≅ 120 µm) e uma pequena relação superfície volume, fato que dificulta a desidratação celular adequada. Chen e tal.,(2002) relataram que oócitos maturados são afetados em sua estrutura de fuso meiótico formado nessa fase, pela despolimerização dos microtúbulos dessa estrutura durante o resfriamento, ou pela ação dos crioprotetores.
As injúrias aos oócitos podem ocorrer em qualquer fase do congelamento e durante o descongelamento com efeitos tóxicos e osmóticos. Tem sido tentadas técnicas que melhorem os resultados. A vitrificação, método de congelamento rápido,é alternativa ao congelamento lento, que causa injúrias osmóticas, bioquímicas e formação de cristais de gelo (Vajta et al., 1998). A vitrificação permite a passagem rápida por essa fase, além de promover a formação do estado vítreo, sem nucleação de gelo. Teoricamente, este estado vítreo pode ser conseguido com o aumento da velocidade de redução da temperatura e com o auxílio de elevadas concentrações de crioprotetores. O sucesso da vitrificação está relacionado também com a capacidade de penetração do crioprotetor, o tempo de exposição e o volume de crioprotetor, que devem ser adequados para impedir a formação de cristais de gelo intracelularmente, sem levar a lesões tóxicas e osmóticas (Martino et al., 1996; Vajta et al., 1997; Lane et al., 1999; Vajta, 2000).
Outra forma de prevenir lesões osmóticas e tóxicas durante o congelamento é a escolha do crioprotetor (Palasz & Mapletoft, 1996). A trealose, um dissacarídeo extracelular, é excelente estabilizador de membranas, além de atóxico. Tem sido sugerido que grupos hidrofílicos da trealose formam pontes de hidrogênio em locais normalmente ocupados pela água, evitando o enrijecimento da membrana, mantendo-a em estado fluido. Além de substituir a água em condições de anidrobiose, a trealose aumenta a capacidade de transformação vítrea (Donnamaria et al., 1994; Richards et al., 2002). Devido a sua grande massa molecular e características bioquímicas, a trealose é incapaz de atravessar a membrana plasmática. Alternativas para permitir o ingresso deste açúcar no citoplasma dos ovócitos têm sido testadas, uma vez que a ação protetora da trealose á membrana plasmática, durante o resfriamento, pode ser potencializado quando intra e extracelular. Este trabalho buscou avaliar a capacidade crioprotetora da trealose intracelular, na vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro, a fim de determinar estratégias possíveis para metodologias futuras que permitam integrar a criopreservação do gameta feminino à rotina das técnicas de reprodução e preservação.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção e seleção dos oócitos
Complexos cumulus oophorus (CCO) foram aspirados de ovários obtidos em matadouros da localidade do município de Campos dos Goytacazes, os quais foram transportados em solução fisiológica estéril (tabela 1) à temperatura ambiente.Foram aspirados apenas folículos ovarianos com diâmetro de 2-6mm com auxílio de uma agulha de 19 “G” (40 x 1.2 mm) ligada a um tubo cônico de 50 mL, conectado a uma bomba de vácuo, sob uma pressão de 90 mm/Hg. Após 10 minutos de decantação, parte do sobrenadante foi descartado e o restante passado para uma placa de Petri (Corning, 100 x 20 mm) para busca dos CCOs.Estes foram transferidos para gotas de meio de manipulação (tabela 1). Posteriormente procedeu-se a avaliação e classificação dos mesmos. Somente CCOs classificados como grau I e II, os que possuem mais de 3 camadas de células do cumulus oophurus envolvendo completamente e compactamente o ovócito, forma arredondada, granulações finas e homogênea e de coloração marrom; o citoplasma preenche o interior da zona pelúcida, grau I ; e o ovócito de grau II, cumulus rodeando completamente com menos de 3 camadas celulares; citoplasma com granulações distribuídas com heterogeneidade, podendo estar mais concentrado centro e mais clara na periferia; o citoplasma preenche o interior da zona pelúcida (Kulesshova et al., 1999) foram utilizados para os experimentos.Os CCOs selecionados foram lavados em meio de manipulação e em seguida transferidos para o meio de maturação (tabela I). Os CCOs foram mantidos em gotas de 100 µL do meio de maturação (20-25 oócitos por gota), sob óleo mineral, por um período de 22 horas a 38,5 ºC, em atmosfera de 5% de CO2. Após esse período os oócitos foram lavados em 10 gotas de meio de manipulação e posteriormente desnudados.
Tabela I. Composição de meios de cultura utilizados para cripreservação dos oócitos bovinos
Denudação dos oócitos
A remoção das células do cumulus, foi realizada de forma mecânica para facilitar a visualização do corpúsculo polar (indicador da maturação nuclear) e evitar erros de interpretação dos resultados após as marcações fluorescentes.
Micromanipulação
As micropipetas de holding e microinjeção foram confeccionadas a partir de capilares de vidro de borossilicato (Narishige) com uso de estirador de capilares (Sutter Instrument Company) e de microforja (Narishige). Antes de ser acoplada ao micro-manipulador, a pipeta de microinjeção foi preenchida com uma pequena quantidade de óleo mineral, depositado com auxílio de uma seringa acoplada com uma fina agulha, para que a solução a ser microinjetada não entre em contato com os elementos que foram colocados nas colunas posteriores.
Tratamentos
Oócitos aspirados de ovários provenientes de matadouros sofreram maturação in vitro e depois foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos:O tratamento controle foi dividido nos seguintes grupos: oócitos maturados in vitro (Tc); grupo penetrados (Tp), oócitos foram apenas perfurados pela pipeta de microinjeção; grupo microinjetados (Tm), oócitos foram microinjetados com solução de trealose .Tratamento dos vitrificados: grupo dos microinjetados (Tmv), oócitos microinjetados com 0,8M de trealose de acordo com Eroglu et al., 2002 e posteriormente vitrificados; grupo vitrificados com dimetilsufóxidodeído (DMSO) e etilenoglicol (EG) (Tvde), segundo Vajta et al., 1998. Grupo eletroporação (Te), oócitos foram submetidos à eletropermeação no meio contendo trealose e seguido sua vitrificação.Os oócitos submetidos aos tratamentos Tp e Tm foram postos em cultivo em atmosfera controlada de 5 % de CO2 e temperatura a 38 ºC, durante 3 horas, para avaliar se houve rompimento celular.Os oócitos vitrificados (tratamentos Tmv, Tvde e Te) foram descongelados, e avaliados quanto a sua capacidade de re-expansão durante a desvitrificação e pós-cultivo de 3 horas. Determinou-se a integridade de membrana com iodeto de propídio, e finalmente avaliou-se mudança de oligossacarídeos da zona pelúcida, manose e ácido siálico.
Microinjeção de solução de trealose
Seguiu o protocolo descrito por Eroglu et al., 2002. Inicialmente, os oócitos foram colocados, por 10 min, em uma gota de solução de equilíbrio (tabela I), para provocar uma retração do volume citoplasmático. Após este período a extremidade da palheta de microinjeção foi preenchida com uma solução de microinjeção (tabela I) iniciando-se o procedimento de microinjeção, com auxílio de um microinjetor (Transjector 5246 Eppendorf), acoplado a um microscópio invertido (Axiovert Zeiss). O ovócito foi posicionado de modo que o corpúsculo polar ficasse situado na posição superior (doze horas) ou na posição inferior (6 horas). O corte da zona pelúcida e o rompimento da membrana plasmática foram realizados por pulsos piezoelétricos (PiezoDrill, marca Burleigh), de freqüência 2 Hz, duração 66 µs, amplitude 60V. Após a penetração da micropipeta de injeção no citoplasma, os oócitos foram microinjetados com a solução de trealose 0,8M até que seu volume retornasse ao volume isotônico (correspondente a 0,15M de trealose).
Vitrificação
Após a microinjeção de trealose 0,8 M, grupo de três oócitos foram transferidos para uma gota de 20 µl de meio de vitrificação (tabela I) e mantidos por 1 min nessa solução, a temperatura ambiente. Os oócitos foram envasados por capilaridade em palhetas estiradas e abertas, e em seguida mergulhados em nitrogênio líquido.
Vitrificação dos oócitos com crioprotetores penetrantes
Os oócitos foram vitrificados segundo Vajta et al., 1998. As soluções utilizadas no procedimento foram distribuídas em placas de quatro poços, sobre uma placa aquecedora mantida a 39 ºC. No primeiro e no segundo poços foram depositados 800μl de solução “holding” (Tabela I), no terceiro poço foi colocada a solução de vitrificação 1 (SV1 - 800 μl de meio “ holding”+ 100 μl de EG + 100 μl de DMSO) e no quarto poço a solução de vitrificação 2 (SV2-600 μl de solução de sacarose 0,6M + 200 μl de EG+ 200 μl de DMSO). Antes do congelamento os oócitos foram parcialmente desnudados e em seguida mantidos por 30 segundos em cada um dos três primeiros poços. Posteriormente foram colocados em uma gota de 20 µl da solução SV2, de onde foram envasados em número de 3 oócitos por capilaridade em OPS e imersos em nitrogênio líquido, num tempo máximo de 30 segundos.
Eletropermeabilização
Visando simplificar a metodologia de introdução da trealose no citoplasma dos oócitos, foi testado o método de eletropermeabilização. Para isso, grupos de dez oócitos foram colocados em 400 µl de um meio de eletropermeabilização (tabela I) e transferidos para uma cubeta contendo eletrodos de alumínio, com 2mm de espaço entre eles (BTX TM). A eletroporação foi realizada em um eletromanipulador (ECM 2001, marca BTX), com 8 ciclos de 150V, no modo alta voltagem (HV) em intervalos de 50 µsegundos de tempo entre os pulsos. Após 15 min os oócitos foram retirados da cubetas, colocados num meio de vitrificação, por 1 min e então envasados em OPS (3 oócitos/ palheta), em 1 µl de meio, e imediatamente colocados no nitrogênio líquido.Para verificar a abertura de poros na membrana, adicionou-se uma solução de iodeto de propídio (10 µg/ml, Sigma, P 4170) ao meio de eletropermeabilização. Após 3 minutos da eletroporação, os oócitos foram colocados entre lâmina e lamínula, com 5 µl do meio de eletroporação, e observados em microscópio invertido Eclipse TE 300 (Nikon) com fluorescência.
Desvitrificação dos oócitos
Realizada segundo Vajta et al., (1998) em uma placa de quatro poços. No primeiro e segundo poços foram colocados 800μl de solução “holding” acrescida de sucrose 0,5M. No terceiro poço foram colocado 800 μl de solução de “holding” acrescida de sacarose 0,25M. O quarto poço recebeu 800 μl de solução “holding”. Todo o procedimento foi realizado sobre placa aquecedora a 41º C. Após a preparação da placa, cada OPS foi retirada do botijão criogênico e sua extremidade mergulhada no primeiro poço, para a recuperação dos oócitos. Imediatamente os oócitos foram transferidos para o segundo poço com auxílio de uma pipeta, sendo mantidos por cinco minutos. O mesmo procedimento ocorreu nos demais. Em seguida os oócitos foram colocados por 3 horas em condições de cultivo in vitro. Cultivo in vitro dos oócitosO cultivo pósdesvitrificação foi realizado como método auxiliar para avaliação da integridade da membrana plasmática. Para isso os oócitos foram colocados em 100 µl de meio de cultivo (tabela I) durante 3 horas, a 38,5 ºC e atmosfera com 5% de CO2.
Avaliação morfológica pós-desvitrificação
Após o período de 3 horas de cultivo in vitro foi avaliada a integridade da membrana plasmática e re-expansão citoplasmática, com auxílio de um microscópio invertido Eclipse TE 300 (Nikon), sob aumento de 200x (figura I).
Figura I. Fotografias da resposta volumétrica do ovócito bovino maturado in vitro, antes (A) e após (B) exposição à solução de trealose 0,15M. Em B se observa à retração do citoplasma (desidratação) promovida pela solução hipertônica de trealose. Microscopia de luz, aumento de 400x.
Avaliação da viabilidade celular
Foi determinada pela exposição dos oócitos à solução de iodeto de propídio (100µg/mL). Após o descongelamento os oócitos foram lavados em solução de PBS livre de cálcio e magnésio, com 20% de soro fetal bovino. Posteriormente, foram colocados em 5 µl de solução de iodeto de propídio por cinco minutos, ao abrigo da luz. Em seguida, entre lâmina e lamínula e observados com auxílio de um microscópio invertido Axiovert (Zeiss) com fluorescência verde. Oócitos emitindo fluorescência vermelha foram considerados danificados, enquanto aqueles que não emitirem fluorescência foram considerados viáveis. Foi realizado um grupo maturado e exposto ao triton (detergente, que faz poros na membrana), de forma que este seja um grupo controle para marcação positiva, de forma a pré-determinar a marcação da placa metafásica por IP .
Avaliação com lectinas
Durante a fertilização há a ligação dos espermatozóides no ovócito maturado através de oligossacarídeos da zona pelúcida. A ausência ou a mudança de conformação espacial desses oligossacrídeos impossibilita a fertilização, uma vez que a ligação do espermatozóide a essas glicoproteínas é uma ligação específica tipo chave-fechadura. Para avaliar os oligossacarídeos da zona pelúcida, manose e ácido siálico, também responsáveis pela ligação dos espermatozóides, utilizou-se lectinas marcadoras concanavalina-A (Con-A) e n-glucosamina (WGA), que marcam respectivamente manose e ácido siálico.As células foram previamente lavadas por 10 minutos numa solução de PBS com 10% de BSA, logo após foram incubadas em uma solução de cloreto de amônio de 50mM em PBS durante 30 a 60 minutos. Seguidos, foram incubadas com as lectinas, Con-A (marcação de manose) e WGA (marcação do ácido siálico), diluídas em PBS com 1 % de BSA para uma concentração não aglutinante, a temperatura ambiente e em câmara úmida por 1 hora, ao abrigo da luz. Os oócitos foram lavados novamente em uma solução de PBS com 1 % de BSA. Finalmente foram montados e então avaliados num microscópio invertido
RESULTADOS
Efeito dos tratamentos sobre a taxa de retorno ao volume isotônico
O retorno dos oócitos ao seu volume isotônico é maneira prática de se avaliar a funcionalidade e a integridade da membrana plasmática. Oócitos dos diferentes tratamentos foram submetidos à avaliação da taxa de retorno ao volume isotônico, visto que as soluções de vitrificação utilizadas eram hipertônicas, promovendo dessa forma uma redução do volume citoplasmático devido a desidratação (Figura I). Da mesma forma, dos tratamentos, tratamento de oócitos penetrados-Tp e tratamento de oócitos microinjetados-Tm, foram submetidos a essa avaliação como forma de determinar possíveis danos provocados pela microinjeção intracitoplasmática.A avaliação dos efeitos mecânicos da técnica de microinjeção mostrou que os oócitos simplesmente penetrados pela pipeta de microinjeção (Tp) e aqueles apenas microinjetados com solução de trealose (Tm) apresentaram taxas de retorno ao volume isotônico parcial ou total da ordem de 100%, mesmo após o período de cultivo in vitro (3h). Alterações importantes foram observadas, no entanto, nos oócitos vitrificados (Tabela 3).Dos 79 oócitos vitrificados após a microinjeção de trealose (Tmv), 55% retornaram total ou parcialmente ao seu volume isotônico, enquanto 21 % permaneceram com citoplasma contraído.Oócitos vitrificados com crioprotetores penetrantes (Tde) apresentaram de taxas de retorno superiores aos do tratamento T3 (68%) e taxa de não retorno de, apenas, 11%.O tratamento Te (vitrificados após eletropermeabilização) proporcionou o retorno ao volume isotônico total ou parcial de 80% dos oócitos criopreservados, contra apenas 7% sem nenhuma modificação do volume citoplasmático, após as 3h de cultivo in vitro (Tabela II).
Tabela II. Taxa de retorno ao volume isotônico de oócitos bovinos após descongelamento e cultivo in vitro
Além de alterações detectadas no retorno ao volume isotônico, alguns tratamentos provocaram grandes lesões de membrana plasmática com conseqüente extrusão de conteúdo citoplasmático, sendo observada em 24, 21 e 13% dos oócitos de Tmv, Tde e Te, respectivamente.
Efeito dos tratamentos sobre a integridade da membrana plasmática
A integridade da membrana plasmática foi avaliada pela técnica da exclusão do iodeto de propídio. Oócitos controle (Tc) não apresentaram marcação intracitoplasmática, sendo possível apenas observar a marcação do corpúsculo polar no espaço perivitelínico (Figura I). Com exceção os oócitos de Tc (controle), todos os outros tratamentos interferiram com a integridade da membrana plasmática dos oócitos, determinando marcação pelo IP em 20%, 40%, 64%, 26% e 71% dos oócitos de Tp-penetrados, Tm-microinjetados, Tmv-microinjetados/ vitrificados, Tde-vitrificados/ DMSO e EG e Te-eletropermeabilizados, respectivamente.A marcação pelo IP demonstrou, ainda, espalhamento de cromossomos provocado por alguns tratamentos, interferindo com a configuração morfológica da placa metafásica. Esse efeito foi causado mecanicamente pela técnica de microinjeção, como evidenciado pela ocorrência de cromossomos dispersos em 40% dos oócitos de Tm. O espalhamento de cromossomos também foi observado em oócitos de Tmv (27%), Tde (23%) e Te (14%) (Tabela III).
Tabela III. Integridade da membrana plasmática e alterações cromossômicas de oócitos bovinos após descongelamento e cultivo in vitro
Avaliação de componentes de glicoproteínas da superfície da zona pelúcida
A determinação da presença da manose e ácido siálico na superfície da zona pelúcida de oócitos bovinos foi realizada pela marcação com Con-A e WGA acoplados ao FITC. Foi possível demonstrar a presença desses açúcares como constituintes da zona pelúcida, tendo ambas as marcações sido evidenciadas em 100% dos oócitos examinados.Oócitos vitrificados (Tmv, Tvde e Te) foram examinados para verificar a ocorrência de alguma alteração na distribuição desses açúcares na superfície da zona pelúcida em decorrência dos tratamentos efetuados. Todos os oócitos avaliados apresentaram uma marcação homogênea por toda a zona pelúcida sem diferença da marcação observada nos oócitos controle.
DISCUSSÃO
Vários grupos de pesquisa de áreas como a Embriologia e Reprodução Animal e Humana vêm procurando estabelecer um protocolo de congelamento de oócitos mais efetivo, com o objetivo de minimizar efeitos danosos da vitrificação (Begin et al., 2002; Chian et al., 2004, Eroglu et al., 2002, Isachenko et al. 2005). Foi demonstrado que a trealose é um eficiente estabilizador de membranas biológicas, capaz de preservar sua integridade estrutural e funcional (Kulesshova et al.,1999). Entretanto, para exercer essa ação é preciso uma metodologia que permita sua internalização, visto ser a trealose um crioprotetor de grande massa molecular, não sendo capaz de atravessar a membrana plasmática. Esse trabalho utilizou duas técnicas de introdução da trealose em oócitos bovinos (microinjeção e eletropermeabilização), a fim de avaliar a capacidade crioprotetora desse dissacarídeo intracelular na vitrificação desses gametas.
A microinjeção foi utilizada pela primeira vez por Eroglu (Eroglu et al., 2002) para injetar trealose no citoplasma de oócitos humanos. Porém, não há dados sobre a utilização dessa técnica, nem mesmo da eletropermeabilização para internalização da trealose em oócitos bovinos.
A microinjeção pode ser uma fonte de injúrias ao ovócito. A avaliação da ação mecânica da microinjeção foi testada no Tp-penetrados e foi demonstrado que a simples penetração da agulha de microinjeção promoveu danos em 20% dos oócitos, os quais se apresentavam marcados pelo IP. Os efeitos da microinjeção foram ainda mais evidentes nos oócitos de Tm-microinjetados, os quais mostraram marcação pelo IP em 40% dos oócitos microinjetados. Apesar desses resultados, as taxas de retorno ao volume isotônico obtidas com oócitos microinjetados com solução de trealose (Tmv) e eletropermeabilizados (Te) antes da vitrificação, demonstram que a trealose intracelular foi capaz de preservar a integridade e funcionalidade da membrana plasmática de oócitos vitrificados. Apenas 21% e 7% dos oócitos desses tratamentos, respectivamente, não apresentaram retorno ao seu volume isotônico após a desvitrificação.
A trealose tem a capacidade de promover a proteção contra a remoção de água durante a desidratação, através da substituição da água de hidratação, estabilizando os fosfolipídeos da membrana pela formação de pontes de hidrogênio e assim inibindo a desnaturação irreversível destes (Donnamaria et al., 1994). Essas características que podem influenciar positivamente a viabilidade dos oócitos frente a vitrificação, concorrendo para minimizar as alterações da membrana plasmática durante o congelamento/descongelamento.
Oócitos vitrificados com concentrações mais elevadas de trealose (0,29 M) após eletropermeabilização apresentaram menor taxa de extrusão citoplasmática (13%), que oócitos vitrificados após microinjeção de trealose (0,15 M) (24%) e oócitos vitrificados com crioprotetores penetrantes (21%).
Porém apenas 36% dos oócitos microinjetados não apresentaram marcação ao IP, possivelmente devido a alterações na membrana plasmática provocadas pela microinjeção. Resultado semelhante foi observado nos oócitos eletropermeabilizados.
A elevada taxa de retorno observada é incompatível com a elevada taxa de marcação pelo IP, o que sugere fortemente que as lesões foram ocasionadas após o descongelamento, provavelmente provocadas pela reidratação excessiva dos oócitos. Tal situação pode ter sido ocasionada pela metodologia de desvitrificação, que seguiu o procedimento para desvitrificação com crioprotetores penetrantes (Vajta. et al., 1998) ou devido a elevada concentração interna da trealose, principalmente nos oócitos do grupo Te, que receberam 0,29 M desse crioprotetor. Essa condição, aliada ao fato da trealose não se difundir através da membrana, pode levar a importante dano osmótico, pela entrada excessiva de água após o descongelamento.
Oócitos bovinos apresentam boa resposta à trealose extracelular. A exposição destes à solução de 0,35M de trealose diluída em TCM-Hepes com 10% de SFB, não alterou as taxas de clivagem e de blastocisto (66,4% e 33,9%, respectivamente) (Martins, 2001). Mas experimentos prévios realizados neste laboratório demonstraram que oócitos bovinos são mais sensíveis que oócitos de camundongos a exposição a trealose (Martins 2001).
A vitrificação de oócitos com crioprotetores penetrantes foi utilizada para comparação por ser amplamente utilizada e atualmente apresentar os melhores resultados de viabilidade ovocitária pós-desvitrificação. A utilização de crioprotetores penetrantes para a vitrificação de oócitos tem sido utilizada de várias maneiras. Otoi (Otoi et al.,1998), vitrificaram oócitos bovinos com 40% etilenoglicol (EG) e obtiveram 24% de clivagens. Usando DMSO e EG na vitrificação de oócitos bovinos, Chian (Chian et al., 2004), conseguiram uma taxa de sobrevivência ovocitária de 92,8% e taxa de blastocisto de 7%.
Oócitos vitrificados com crioprotetores penetrantes (Ted) apresentaram taxa de retorno de 68%, superior a dos oócitos de Tmv (55%), porém inferior a de Te (80%). É importante ressaltar também o efeito desse tratamento sobre a disposição da placa metafásica. Dos dez oócitos que apresentaram marcação pelo IP, nove tinham cromossomos dispersos. O DMSO, um dos crioprotetores utilizados, pode ser causador de despolimerização dos fusos meióticos, levando ao aumento do potencial da poliploidia (Chian et al., 2004). Esses resultados vêm confirmar a possibilidade de utilização da trealose intracelular como crioprotetor na vitrificação de oócitos bovinos e ressaltar sua baixa toxicidade celular. Zigotos de camundongos toleram bem a trealose intracelular até 0,15 M, sem diminuição na taxa do desenvolvimento (Chian et al., 2004). Da mesma forma oócitos humanos, quando expostos ao meio contendo 0,15 M, apresentam uma retração de 70-75% do seu volume isotônico, retornando ao normal após a microinjeção de trealose 0,8 M (Eroglu et al., 2002). O congelamento de oócitos humanos a -60º C, com trealose intracelular numa concentração de 0,15 M, resultou em 63% de viabilidade pós-descongelamento, medida como taxa de retorno ao volume isotônico (Eroglu et al., 2002). A concentração de trealose utilizada em Tvm (0,15M) corresponde a concentração de trealose encontrada em muitos dos organismos anidrobióticos (Eroglu et al., 2002), porém pode não ser a mais adequada para oócitos bovinos.
Oócitos bovinos são mais sensíveis ao congelamento do que oócitos humanos e de camundongos, porque, entre outras causas, possuem grande quantidade de lipídios no citoplasma (Martins, 2001). Os baixos índices de viabilidade ovocitária podem estar diretamente ligados à extrema sensibilidade da membrana a alterações de temperatura (Martins, 2001).
A trealose intracelular apresenta efeitos benéficos para a criopreservação de oócitos, porém é necessário adequar a técnica. A microinjeção demanda grande familiarização com equipamentos sofisticados, para evitar a ocorrência de injúrias mecânicas à zona pelúcida, à membrana plasmática e demais organelas dos oócitos. Além disso, a membrana plasmática do ovócito bovino é altamente elástica (Eroglu et al., 2002), acompanhando facilmente a agulha de microinjeção sem se romper, fazendo com que o operador realize a injeção erroneamente no espaço perivitelínico. A utilização do Piezo (PiezoDrill, Burleigh) facilita essa penetração, cortando a zona pelúcida e abrindo caminho na membrana plasmática, por pulsos piezoelétricos, sem a necessidade de comprimir o ovócito para a penetração da agulha, o que diminui as injúrias provocadas pelo procedimento de microinjeção.
A microinjeção é uma técnica já estabelecida para fertilização de oócitos, porém demanda grande experiência do operador, equipamentos caros e sofisticados e baixo rendimento. Por isso, neste trabalho, foi testada a utilização da eletropermeabilização para o mesmo fim. Ela permite trabalhar um maior número de oócitos em um curto espaço de tempo, de forma prática e simples, mas ainda com a desvantagem de necessitar de equipamento caro e sensível.
A vitrificação com crioprotetores penetrantes, apesar de amplamente utilizada, não apresenta resultados satisfatórios. A utilização de concentrações extremamente elevadas de crioprotetores tem sido um limitante desse método, devido ao grande potencial tóxico.
CONCLUSÃO
Ficou demonstrado que a trealose intracelular tem um importante potencial para a criopreservação de oócitos bovinos, necessitando, no entanto a adequação de protocolos mais eficientes para sua internalização, assim como determinar concentração ideal e métodos de descongelamento que permitam sua utilização de forma eficiente, contribuindo assim para a utilização rotineira da criopreservação de oócitos humanos.