JBRA Assist. Reprod. 2008;12(2):27-31
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.2.06
1Hospital das Clinicas (HC) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG
2Cirurgião Geral
3Doutor em Ginecologia pela Faculdade de Medicina (FM) da UFMG
4Faculdade de Medicina (FM) da UFMG, Clínica Origen, BH
Serviço:
Trabalho executado na Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais
Financiamento:
Não houve
Resumo
Um dos problemas da medicina reprodutiva é a incapacidade da preservação de oócitos em candidatas a tratamento quimio ou radioterápico e/ou cirurgia. O transplante de tecido ovariano criopreservado poderia, além de recuperar a capacidade fértil, ser alternativa à terapia de reposição hormonal. Objetivo: verificar a viabilidade funcional do transplante ovariano autólogo para o peritônio, após congelamento e descongelamento. Métodos: Estudo experimental descritivo com 67 ratas Holtzman: grupo 1 (20), submetido a ooforectomia bilateral; grupo 2 (24), submetido a laparotomia e inspeção ovariana e grupo 3 (23), ooforectomia bilateral seguida de congelamento de um dos ovários e posterior descongelamento e transplante peritoneal, à esquerda do feixe vásculo-nervoso epigástrico esquerdo. Foi realizada citologia vaginal funcional por 10 dias nos três grupos e análise histopatológica dos ovários transplantados para avaliação da função ovariana. Resultados: Todas as 20 ratas ooforectomizadas apresentaram padrão persistente de atrofia na citologia vaginal, compatível com ausência de ciclo estral. No grupo controle, todas apresentaram citologia vaginal típica de estro. No grupo transplante, 21 animais (91,3%) apresentaram alterações citológicas compatíveis com ciclo estral. Aplicado modelo de regressão logística, não se verificou efeito significativo do tipo de intervenção cirúrgica na probabilidade da ocorrência de ciclos irregulares. Após 40 dias do transplante, todos os 23 ovários apresentavam folículos em todas as fases de desenvolvimento, além de corpos lúteos. Conclusão: o transplante ovariano autólogo, sem reanastomose vascular, em peritônio de ratas, após congelamento e descongelamento, é capaz de restaurar o desenvolvimento folicular adequado, havendo até mesmo evidências da ocorrência de ovulação nos implantes.
Palavras-chave: Transplante, ovário, criopreservação, ratos
Abstract
One of the major problems against reproductive medicine is the incapacity of oocyte preservation. In these cases, ovary preservation could restore hormonal e fertility capacity. Objective: Assess the ovarian function after removal of the ovaries, cryopreservation and intraperitoneal autotransplantation. Materials/Methods: Prospective experimental study involving 67 Holtzman rats randomized to one of the three groups: Group 1 (20) bilateral oopherectomy, Group 2 (24) shame operation, Group 3 (23) cryopreserved ovarian autotransplantation group. The rats in Group 3 had frozen/thawed ovaries replaced to the peritoneum 10 days after freezing with DMSO. Daily vaginal cytology was performed for 10 days starting 7 days after surgery in group 1 and 2, and 15 days after surgery in group 3. Histologic examination of the transplanted frozen/thawed ovarian tissue was performed in all cycling animals 40 days following transplantation. Results: In group 1 none of the animal showed cytologic alterations compatible with estrus. All animals in group 2 were considered as having hormone secretion. Cytologic examination of vaginal smears from group 3 revealed 21 animals with the normal cycle (91.3%). Morphologic study of the ovaries showed no ischemic or inflammatory alterations and all ovaries showed follicles in different stages of maturation, i.e., viable primordial, antral follicles and corpus luteum. Conclusions: Our study demonstrates that frozen/thawed ovaries transplanted to the peritoneum without vascular anastomosis in rats preserve endocrine and reproductive functions.
Key-words: Transplantation, ovary, cryopreservation, rats
INTRODUÇÃO
A necessidade de preservação dos gametas femininos e o problema da reposição hormonal relacionado à melhor droga, dose e via de administração, indicações e efeitos colaterais são assuntos que vêm sendo discutidos há décadas e que até o momento não apresentam soluções definitivas. O banco de tecido ovariano congelado pode ser uma das alternativas possíveis para atender estas questões e encontra-se em investigação experimental tanto em animais quanto em humanos, ainda em fases iniciais. Ele pode ser uma solução para a preservação da fertilidade em pacientes com câncer, situação em que o tratamento poderá levar à falência hormonal, assim como o que ocorre em pacientes com endometriose grave ou tumores ovarianos benignos.
No ano de 2006, foram estimados 1.399.790 novos casos de câncer nos Estados Unidos, sendo 679.540 em mulheres e 8% disso em mulheres abaixo de 40 anos (Jemal et al., 2006). A American Cancer Society (ACS) preconizou que, em 2007, ocorreriam 22.430 eventos novos em relação aos tumores ovarianos e 11.150 eventos de tumor do colo uterino (ACS, 2008).
Os efeitos das quimioterapias, radioterapias e cirurgias mutiladoras no futuro da fertilidade são matéria de estudos e preocupações das pacientes e de seus familiares. A quimioterapia, especialmente quando se utilizam agentes alquilantes, é reconhecidamente gonadotóxica (Lobo, 2005). Já a dose de radiação calculada para destruir 50% da reserva oocitária é estimada em menos de 2 gray (Gy) (Wallace, 2003).
O único método estabelecido até o momento e rotineiramente utilizado em clínicas de reprodução assistida é a criopreservação de embriões, mas essa opção requer estimulação ovariana, coleta de oócitos e fertilização in vitro, o que pode levar entre 2-5 semanas. Assim, o atraso no inicio do tratamento quimioterápico para o armazenamento de embriões não é factível para algumas pacientes e pode ser, até mesmo, um risco em alguns tipos de câncer. Mais ainda, esse método não deve ser considerado uma opção em garotas pré-puerperais e é freqüentemente inaceitável por mulheres que não possuem parceiro fixo e naquelas que não desejam utilizar espermatozóide de doadores (Kim, 2006).
Outra alternativa é a criopreservação de oócitos, que pode ser utilizada em mulheres sem parceiro sexual definido e que tenham condições de serem submetidas a um ciclo de estimulação ovariana antes do início da quimioterapia (Jain & Paulson, 2006). Meta-análise publicada por Oktay et al. (2006a) mostrou: taxa de nascimento por oócito descongelado variando de 1,9 a 2,0%; taxa de nascimento por oócito injetado de 3,4% e por embrião transferido de 21,6%. Pode ser considerado um método promissor, mas ainda assim apresenta baixas taxas de sucesso.
A criopreservação de tecido ovariano é a única opção disponível para mulheres pré-púberes e para aquelas em que não é possível postergar o início da quimioterapia. O congelamento de tecido ovariano foi realizado, até o momento, por três técnicas: ovário inteiro com pedículo vascular, fragmentos do córtex ovariano e folículos isolados. A maioria das pesquisas animais e em humanos concentra-se em métodos de congelamento e transplante de fragmentos da córtex avascular, sendo que essa técnica foi a única que possibilitou a ocorrência de nascimentos em humanos até o momento (Donnez et al., 2006). Realmente, a preservação do tecido ovariano através de congelamento/descongelamento tem se mostrado um sucesso em animais, mas existe ainda a questão de como desenvolver esses folículos imaturos armazenados no tecido congelado e permitir a fertilização. Algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para permitir o desenvolvimento dos folículos, entre elas cita-se o transplante autólogo/heterólogo e a cultura in vitro. A estratégia mais desejada seria a que permitisse o desenvolvimento de um meio que possibilitasse o crescimento e maturação in vitro, considerando a ausência de novos procedimentos cirúrgicos, melhor acompanhamento do desenvolvimento e risco zero de transmissão de células cancerosas (Shaw et al., 1996). Apesar de já ser possível isolar folículos primordiais de tecido ovariano humano, não se obteve sucesso na sua maturação in vitro. A confirmação da viabilidade do transplante autólogo foi confirmada por Barros et al. (2001), após demonstrarem que o transplante ovariano autólogo, sem reanastomose vascular, em peritônio de ratas castradas, restaura o ciclo estral desse animal e o desenvolvimento folicular adequado.
OBJETIVO: do nosso estudo foi verificar a viabilidade funcional hormonal do transplante ovariano autólogo para o peritônio de ratas, após o congelamento e descongelamento, através de citologia vaginal seriada e estudo histológico dos fragmentos de ovários transplantados.
MATERIAL E MÉTODOS
Estudo experimental descritivo que utilizou ratas albinas da raça Holtzman, nuligestas, com idade e peso semelhantes. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). A abordagem dos animais foi feita de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque e com as Normas Internacionais de Proteção aos Animais (Cooper, 1985).
As ratas foram divididas em 3 grupos e os animais foram operados em conjuntos de 6, todos pertencendo à mesma ninhada, sendo 2 para cada um dos grupos de estudo, de forma aleatória. No grupo 1 (n=20) foi realizada ooforectomia bilateral. No grupo 2 (n=24), foi realizada laparotomia e inspeção dos ovários (controle). No grupo 3 (n=23) foi realizada ooforectomia bilateral, seguida de congelamento e descongelamento de um dos ovários e posterior transplante para a superfície peritonial, à esquerda do feixe vásculo-nervoso epigástrico esquerdo (transplante). Desta maneira, os três grupos foram emparelhados quanto à habilidade do cirurgião, no decorrer do experimento e ao tempo decorrido entre a cirurgia e o início da realização da citologia vaginal funcional. Todas as ratas foram identificadas por meio de pequenas incisões (± 0,5 cm) nas orelhas das mesmas.
Os ovários removidos foram colocados em meio de cultura tamponado (Hepes buffered - Earle’s Balanced Salt Solution) em tubos Eppendorf numerados, em gelo, para transporte. O ovários foram então preparados para o congelamento, através da retirada de toda gordura peritoneal e peri-ovariana e secção em duas metades. Foi realizado o congelamento de apenas uma das metades de cada ovário. Cada fragmento foi lavado por três vezes em meio de cultura tamponado contendo 10% de substituto sintético de soro (SSS - Irvine® - Estados Unidos da América - EUA) e então colocado em criotubos contendo um volume final de 1,8 ml de crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO - Sigma-Aldrich® - EUA) 1,5 Molar, acrescido de 10% de SSS. Os criotubos foram identificados com a mesma marcação dos tubos Eppendorf que continham os ovários previamente. Em seguida, foram colocados em uma máquina de congelamento (KRYO 10 - Planer - EUA) para a realização do procedimento, seguindo-se o protocolo lento, primeiramente descrito por Newton et al. (1996). Inicialmente, a temperatura foi reduzida em 2oC por minuto até atingir a temperatura de -9oC, quando foi realizado o seeding e a temperatura foi mantida por 10 minutos. Em seguida, as rampas foram de: 3oC por minuto até -40oC e 10oC por minuto até atingir -140oC, quando os tubos foram levados para os racks e inseridos em nitrogênio líquido a -196oC, onde foram mantidos por 10 dias (Geber et al., 2002).
O descongelamento de cada fragmento de ovário foi realizado após 10 dias do congelamento, individualmente na manhã do transplante seguindo protocolo rápido (Newton et al. 1996): os tubos foram colocados em banho-maria à temperatura de 37oC por 3 minutos em agitação. A metade do ovário descongelada era, então, suturada com um ou dois pontos simples à superfície peritonial, à esquerda do feixe vásculo-nervoso epigástrico esquerdo.
A citologia vaginal funcional foi realizada por 10 dias seguidos, nos três grupos, e iniciada 7 dias após a cirurgia nas ratas dos grupos 1 e 2, e 15 dias após a segunda cirurgia nas ratas do grupo 3. O padrão de atrofia foi definido pelos achados citológicos das ratas do grupo 1 (Ooforectomia). O ciclo foi considerado inadequado quando havia estro persistente, por pelo menos quatro dias, ou quando não havia uma ciclicidade com padrão proestro => estro => metaestro => diestro => proestro.
As ratas do grupo do transplante (Grupo 3) foram sacrificadas por meio de deslocamento cervical 40 dias após a segunda cirurgia e tiveram seus implantes ovarianos excisados e preparados para análise histológica. As lâminas foram estudadas no microscópio ótico, com aumentos de 100 e 400 x (Nikon Labophot 2, Japão), procurando-se folículos nos seus vários estágios de desenvolvimento (primordiais, primários, pré-antrais e antrais) e corpos lúteos, de acordo com as características descritas por Oktay et al. (1995).
RESULTADOS
Um total de 67 ratas, todas com aproximadamente 60 dias de vida, foram incluídas neste estudo. Não foram observados óbitos ou perdas durante a realização do mesmo. O peso das ratas variou de 200 a 350g e não houve diferença significativa entre os três grupos pela análise de variância (p = 0,432).
Com relação à análise do ciclo hormonal estral nas ratas estudadas, no grupo 1 (ooforectomia), todas as 20 ratas apresentaram um padrão persistente de atrofia na citologia vaginal, compatível com ausência de ciclo estral. No grupo 2 (controle), todas as ratas apresentaram citologia vaginal típica de secreção hormonal cíclica (estro). No grupo 3 (transplante), 13 animais apresentaram ciclo estral normal e 8 apresentaram alterações citológicas compatíveis com o ciclo estral. Uma rata teve 4 dias de diestro e 2 de metaestro, outra apresentou 3 dias de estro, seguido de 1 dia de metaestro e 1 dia de diestro. O estudo histológico para análise morfológica dos ovários congelados/descongelados e transplantados demonstrou uma ausência de alterações isquêmicas ou inflamatórias, e todos os ovários apresentaram folículos em diferentes estágios de desenvolvimento e maturação, isto é, folículos primordiais, antrais e corpo lúteo. Verificou-se uma grande quantidade de vasos sanguíneos, em todos os cortes de todos os implantes, traduzindo a intensa revascularização dos tecidos.
DISCUSSÃO
Nosso estudo demonstrou a viabilidade funcional hormonal do transplante ovariano autólogo para o peritônio de ratas, após o congelamento e descongelamento, através de citologia vaginal seriada e estudo histológico dos ovários transplantados.
Optamos por utilizar ratas com o mesmo peso e a mesma idade, com objetivo de evitar as possíveis interferências desses, no resultado final. As ratas da mesma ninhada foram aleatorizadas para os três grupos a fim de evitar interferência da habilidade do cirurgião, uma vez que a curva de tempo de aprendizado poderia ser fator de viés nos resultados.
Utilizamos o DMSO para o congelamento, devido a nossa maior experiência com esse crioprotetor (Geber et al., 2002). Mais ainda, Newton et. al. (1996) compararam a eficácia de diversos crioprotetores (DMSO, Propileno-glicol, Etileno-glicol, Glicerol) avaliando a viabilidade de fragmentos de tecido ovariano que foram congelados através de protocolo lento e transplantados para ratas imunodeficientes.
O posterior transplante do tecido ovariano criopreservado é outro fator fundamental para a aplicação da técnica de congelamento ovariano. A simplicidade do procedimento e sua viabilidade técnica são os principais aspectos a serem considerados, uma vez que não adiantará se preservar o tecido ovariano se não houver condições de reimplantá-lo. O uso da técnica de transplante sem reanastomose vascular para a superfície peritoneal já foi comprovadamente demonstrado como viável por nosso grupo (Barros et al., 2001) e apresenta as vantagens de ser um procedimento simples, que evita a utilização das complexas técnicas e do material de microcirurgia.
Quando procedemos ao estudo histológico dos ovários transplantados após criopreservação, não observamos alterações isquêmicas ou inflamatórias e todos os ovários apresentaram folículos em diferentes estágios de desenvolvimento e maturação, isto é, folículos primordiais, antrais e corpo lúteo. Verificou-se uma grande quantidade de vasos sanguíneos, em todos os cortes de todos os implantes, traduzindo a intensa revascularização dos tecidos. Segundo Dissen et al. (1994), é necessário um intervalo de aproximadamente 7 dias para que ocorra a revascularização total do implante e conseqüente retomada da produção hormonal. Em nosso estudo, aguardamos um período de 15 dias entre o transplante e o início da coleta de citologia para que não houvesse dúvida com relação à funcionalidade no implante. Já em relação ao crescimento folicular, Freeman (1994) relata que este dura entre 8 e 14 dias e que a duração máxima do corpo lúteo é de 19 dias. Assim, a presença de folículos nos seus estágios avançados de desenvolvimento, incluindo os grandes folículos antrais, e o encontro de corpos lúteos nos implantes, após um intervalo mínimo de 20 dias, descartam a possibilidade de que estes elementos estivessem presentes desde o momento da primeira cirurgia, já que o estudo histológico foi realizado 40 dias após a segunda cirurgia.
Com relação à análise do ciclo hormonal estral nas ratas estudadas, pudemos verificar que, como esperado, no grupo ooforectomizado, todas as ratas apresentaram um padrão persistente de atrofia na citologia vaginal. No segundo grupo, que foi submetido apenas à laparotomia, todas as ratas apresentaram citologia vaginal típica de secreção hormonal cíclica (estro), mostrando que o procedimento cirúrgico por si só não leva a alterações importantes na secreção hormonal.
A eficácia do transplante de tecido ovariano congelado, em nosso estudo, foi comprovada pela presença de 91% de ratas com ciclo estral regular e 100% de folículos em diferentes estágios de desenvolvimento, ao exame histológico. Em apenas 2 ratas não identificamos ciclo estral regular, mesmo com evidências de desenvolvimento folicular à histologia. Diversas hipóteses podem ser levantadas para explicar a ausência de ciclos regulares em duas ratas, levando à produção hormonal irregular: isquemia transitória do tecido durante transporte; ausência de neovascularização suficiente para suprir o tecido transplantado; reação endócrino metabólica prolongada no pós operatório; e até mesmo o fato das ratas do grupo transplantado terem sido submetidas a dois procedimentos cirúrgicos, o que pode ter aumentado a necessidade metabólica nesse grupo devido ao stress, levando a aumento da necessidade de suprimento sanguíneo. Esses fatos podem ter ocorrido no intervalo entre o transplante e o início da coleta de material e, provavelmente, normalizado-se no período entre a coleta da citologia e o estudo histológico.
A taxa de sucesso de ciclos estrais regulares observada após o transplante de fragmentos de tecido ovariano em ratas, em nosso estudo, foi semelhante ou maior do que a observada na literatura (Sugimoto et al., 2000; Kagabu & Umezu, 2000; Yin et al., 2003) .
Em humanos, Donnez et al. (2004) descreveram o primeiro relato de gravidez após reimplante de tecido ovariano descongelado sobre ovário remanescente. Em 2005, Meirrow et al. descreveram FIV e posterior gravidez após reimplante de tecido ovariano criopreservado para o ovário remanescente. Demeestere et al. e Rosendahl et al., em 2006, publicaram relatos de gravidezes espontâneas e após FIV, em mulheres submetidas a transplante autólogo de tecido ovariano criopreservado para o ovário remanescente. Anderson et al. (2007) (inDemeestere et al., 2007) relataram o terceiro caso de nascimento a partir de transplante ovariano autólogo e ICSI. Segundo Demeestere et al. (2007), já foram descritos mais de 25 casos de transplante ortotópico e/ou heterotópico em humanos de tecido ovariano criopreservado e apenas 4 nascimentos a partir dessa técnica, sendo duas gestações obtidas através de fertilização assistida e as outras duas a partir de ciclos naturais, sendo o quarto descrito no próprio estudo. Apesar desses relatos de gravidezes em humanos, ainda permanecem dúvidas a respeito da origem desses oócitos, já que, em todos os casos, havia ovário residual que poderia ter reassumido sua função (Oktay, 2006b).
Nosso estudo demonstrou que ovários congelados e posteriormente descongelados e transplantados para o peritôneo sem anastomose vascular em ratas preservam a função endócrina. Estes achados podem auxiliar no desenvolvimento de protocolos de transplante autólogo de ovários humanos para mulheres com risco aumentado de falência ovariana, incluindo aí pacientes submetidas a tratamento radio e/ou quimioterápico, cirurgias castradoras, mulheres que desejam postergar a maternidade. Além desse benefício, outras perspectivas futuras surgem para o uso do transplante ovariano. A sua utilização em substituição à terapia de reposição hormonal do climatério seria uma alternativa mais fisiológica. Com o desenvolvimento de novas drogas imunossupressoras cada vez mais potentes e com menos efeitos colaterais, para a prevenção da rejeição de tecidos não-autólogos e com o aperfeiçoamento das técnicas de criopreservação e de crioprotetores, poderia se pensar em um banco de tecido ovariano. Entre as pacientes que se beneficiariam da existência desse tipo de banco, estão as portadoras de disgenesia gonadal, aquelas com falência ovariana precoce e até mesmo mulheres que tiveram que atrasar o projeto maternidade.
Referências
American Cancer Society (ACS). www.cancer.org. Estimated new cancer and death for 2007 and 2008, 02/2008.
Cooper M. Ethics and Laboratory animals. Vet. Rec.1985;116: 594-5.
Jain JK. and Paulson RJ. Oocyte cryopreservation. Fertil Steril.2006;86: 1037-46.
Jemal A et al. Cancer Statistics. CA. Cancer J. Clin.2006; 56: 106-30.
Lobo RA. Potential options for preservation of fertility in women. N Engl J Med.2005;353: 64-73.
Wallace WH. The radiosensitivity of the human oocyte. Hum. Reprod.2003;18: 117-21.