JBRA Assist. Reprod. 2008;12(2):37-39
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.2.08
Instituto Brasileiro de Reprodução Assistida - IBRRA Belo Horizonte / Minas Gerais
Resumo
Por várias razões, mulheres, especialmente em países desenvolvidos, desejam torna-se grávidas em idade avançada. Desde a primeira gravidez obtida em humano com oócito congelado, o método de congelamento lento tem sido aplicado com sucessos variados. Recentes avanços na criopreservação de oócitos e embriões têm sido relatados com a utilização da vitrificação, originalmente aplicada na embriologia por Rall & Fahy, 1985 com embriões de rato. A variedade desta técnica pode ser encontrada na literatura e tem sido aplicada com variados graus de sucesso em mamíferos, incluindo os humanos. A última técnica com mínimo volume de vitrificação é o Cryotop® que foi desenvolvido por M. Kuwayama. Neste relato de caso, aplicamos o método Cryotop para vitrificação em nosso programa de doação de oócitos, avaliando o desenvolvimento dos embriões vitrificados, com gestação em curso.
Palavras-chave: Criopreservação de embriões, vitrificação, desenvolvimento dos embriões.
Abstract
For many reasons women, specially in developed countries, wish to delay the age at which they become pregnant. Since the very first pregnancy was achieved in humans from previously frozen oocytes, the slow cooling method has been applied with varying success. Recent advances in oocyte and embryo cryopreservation have been reported by use of vitrification, which was originally applied in embryology by Rall & Fahy, 1985 to mouse embryos. Several methods have been devised in which very small volumes of sample to be vitrified are used.A variety of these techniques can be found in the literature and have been applied with varying degrees of success in several species of mammals, including humans. The latest approach to minimum volume vitrification is the Cryotop® device that was designed by M. Kuwayama. In our current study, we have applied the Cryotop method for vitrification from a oocyte-donation donation program, assessing development of vitrified embryos. There is one on-going pregnancy.
Keywords: Embryo cryopreservation, vitrification, embryo development
INTRODUÇÃO
Por muitas razões, as mulheres estão postergando a gravidez para uma idade avançada. Infelizmente, quando procuram assistência médica, a reserva ovariana já está prejudicada, necessitando de tratamentos médicos de maior complexidade, como o caso da doação de óvulos. Com os avanços científicos, novas técnicas em Reprodução Assistida estão melhorando o prognóstico das pacientes. Dentre esses avanços, está a técnica de congelamento rápido denominada de Vitrificação. Trabalhos recentes demonstram resultados promissores e concretos da sobrevida e qualidade dos pré-embriões e gametas após o congelamento rápido e descongelamento (Kuwayama et al., 2005, Ruvalcaba et al., 2005, Antinori et al., 2007, Katayama et al., 2003 ).
Até o presente, a melhor metodologia de criopreservar oócitos e pré-embriões humanos ainda permanece em discussão (Martino et al., 1996, Liebermann et al., 2002, Lane & Gardner, 2001, Matsumoto et al., 2001Papis et al., 2000, Vajta et al., 1998). Alguns serviços já utilizam esta técnica em seus laboratórios com sucesso significativo.
A equipe do Instituto Brasileiro de Reprodução Assistida -IBRRA-relata caso de doação de gametas com vitrificação embrionária pelo método Cryotop® , seguida de gravidez em evolução na receptora, portadora de falência ovariana.
DESCRIÇÃO DO CASO
Programa de doação de gameta e estimulação ovariana controlada
O Programa de doação de gameta segue as normativas da Resolução CFM Nº 1.358 e da RDC Nº 33. A doação teve caráter altruísta, não lucrativa, não comercial e anônima. A doadora apresentava semelhança fenotípica e imunológica com a receptora, tendo assinado termo de consentimento livre e esclarecido sobre o programa de doação de gametas. Ela foi avaliada através de exames clínicos e laboratoriais, incluindo os testes para as doenças infectocontagiosas, que foram repetidos após 6 meses da data da coleta dos oócitos, avaliação de doenças genéticas familiares ou próprias, descartando história de doenças cromossômicas e hereditárias. A doadora era fértil, 26 anos, não tabagista, não etilista, ciclos menstruais regulares com intervalos de 28 dias, ambos ovários presentes e desprovidos de anormalidade morfológica, sem patologias endócrinas, índice de massa corporal 22 Kg/m2, sem endometriose, cariótipo normal. A avaliação da reserva ovariana no 3ºdia do ciclo menstrual demonstrou FSH 3,4mUI/mL LH 4,5mUI/mL , E2 36pg/mL, AMH 3,4ng/ mL, número de folículos antrais (AFC) em ambos ovários de 16 pelo ultra-sonografia transvaginal (USTV).No ciclo menstrual anterior à estimulação ovariana, utilizou contraceptivo oral (ACO) Gestodeno + Etinilestradiol (Allestra ® /Aché) e no 21º dia do ciclo menstrual, iniciou 20 unidades/dia de agonista de GnRH (Acetato de Leuprolida - Lupron ® SC - 2,8ml / Abbott) até o 1º dia da menstruação. Após a confirmação da dessensibilização pituitária (E2<30pg/mL e ausência de folículos de tamanho superior a 6mm, espessura endometrial<5mm), a paciente reduziu para a metade a dose do agonista de GnRH e iniciou a estimulação com FSH recombinante (Gonal F® SC / Merck Serono) na dose de 225UI/dia + hMG altamente purificado (Menopur® SC //Ferring) na dose de 75UI/dia nos 3 primeiros dias. A dose foi então ajustada de acordo com a dosagem hormonal de E2 e USTV, revista em intervalos de 2 dias. A duração do estímulo ovariano foi de 7 dias e a administração do hCG recombinante (Ovidrel® SC /Merck Serono) ocorreu quando de >5 folículos acima de 16mm de diâmetro, E2= 2200pg/mL, P4<1,4ng/mL, LH< 5 mUI/mL. A punção ovariana ocorreu 36 horas após o Ovidrel guiada por USTV. Foram coletados 12 oócitos, sendo 9 metáfase II. A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) foi, então, realizada e 7 pré-embriões tipo A e B sofreram o processo de congelamento rápido - vitrificação para utilização posterior.
PREPARO ENDOMETRIAL DA RECEPTORA E TRANSFERÉNCIA PRÉ-EMBRIONÁRIA
A receptora recebeu e assinou termo de consentimento livre e esclarecido para a recepção de gametas. Ela apresentava 47 anos de idade, ciclos irregulares e infertilidade secundária, com passado de aborto espontânea e curetagem uterina. Foi avaliada através de exames clínicos e laboratoriais, sendo as dosagens hormonais de 3º dia do ciclo de FSH 10,9mUI/mL, E2 21pg/mL, AMH 0,26ng/ mL e Inibina B=15pg/mL. Na avaliação ultra-sonográfica e histeroscópica, não haviam alterações uterina e ovariana. A paciente iniciou ACOCiproterona + Etinilestradiol (Diane 35® /Schering) no mês anterior à preparação endometrial e no 21º dia do ciclo menstrual, aplicou 1 ampola de agonista de GnRH (Triptorrelina IM - NeoDecapeptyl® 3,75mg /Aché). No 1º dia da menstruação o repouso ovariano foi confirmado através do USTV, com dosagem de E2<30pg/mL e ausência de folículos de tamanho superior a 6mm e espessura endometrial<5mm.A preparação endometrial foi realizada através de estrogênios transdérmicos (Estradott®, estradiol 100,0 mcg/ Novartis) iniciando com um adesivo a cada 2 dias e aumentando a dose de acordo com a linha endometrial e as dosagem hormonal realizada em intervalos de 3-4 dias.. Ao mesmo tempo, utilizou ácido acetil-salicílico VO (AAS®, 100mg / Sanofi-Synthelabo) diário até o teste de gravidez. Quando a linha endometrial apresentava aspecto trilaminar e espessura>7mm e E2>1000pg/mL, foi iniciada a suplementação com progesterona micronizada 800mg/dia intravaginal (Utrogestan® 200mg / FQM) e após 2 dias , realizado o descongelamento dos pré-embriões.A transferência pré-embrionária de 3 pré-embriões Tipo A e B foi realizada através do cateter Wallace (18mm). A paciente manteve os adesivos transdérmicos de estrogênios (300mcg a cada 48h), a progesterona micronizada intravaginal (800mg/dia), o ácido acetilsalicílico oral (100mg/dia ) e iniciou a utilização de nifedipina (Adalat Retard ® - Bayer 30mg/dia) até o teste de gravidez ,12 dias após a transferência.Em 15 dias o USTV realizado evidenciou saco gestacional único e com batimentos cardiofetais presentes. No momento a paciente se encontra no quinto mês de gravidez, pré-natal sem intercorrências, desenvolvimento fetal normal.
LABORAT ÓRIO DE FEC UNDA ÇÃO In-VItro (iCSi)
Todos os oócitos coletados foram doados à mesma receptora. Após a punção oocitária, os oócitos foram mantidos no meio “human tubal fluid” (HTF / Irvine) suplementado a 10% de albumina ( Irvine ) por 4 horas. Em seguida, foram desnudados para avaliar o grau de maturidade. Dos 12 oócitos coletados, 9 eram metáfase II sendo realizada a ICSI . Ocorreu fecundação em 7 dos 9 oócitos e com bom desenvolvimento em dia 2, embriões foram criopreservados pelo método Cryotop.
Os pré-embriões foram equilibrados em 7.5% (v/v) ethylene glycol (EG) + 7.5% dimethylsulfoxide (DMSO) em TCM199 medium +20% synthetic serum substitute (SSS), referido como “solução ES” à temperatura ambiente por 10 minutos. Após este tempo , foram então colocados na “vitrification solution-VS” parecida com a solução ES exceto pela concentração de 15% EG + 15% DMSO + 0.5 M sucrose. Depois de um minuto nesta solução, os préembriões foram colocados no Cryotop strip (Kuwayama et al., 2005) e imediatamente submersos em nitrogênio líquido( Air Liquide). Após período de congelamento de 6 meses , foi programada a desvitrificação . Os Cryotops foram retirados um a um do nitrogênio líquido e instantaneamente colocados em 1.0M sucrose em TCM199+ 20%SSS a 37º C. Depois de um minuto os pré-embriões foram colocados em 0.5M sucrose em TCM199+ 20%SSS a temperatura ambiente por 3 minutos. Finalmente, duas lavagem de 5 minutos foram feitas com TCM199+ 20%SSS à temperatura ambiente antes de incubar os pré-embriões em HTF ( Irvine ) suplementado a 10% de albumina ( Irvine ) . Todo o material e soluções necessários para a vitrificação e desvitrificação foram obtidos de Kitazato (Tóquio, Japão).
Após o descongelamento, todos os 7 pré-embriões sobreviveram e foram mantidos em cultura por 2 horas, reavaliada sua classificação e então, após a assinatura do consentimento livre e esclarecido do número de pré-embriões a transferir, foi realizada a transferência pré-embrionária de um pré-embrião do tipo A e dois do tipo B.
A qualidade pré-embrionária foi avaliada nos estágios precoces (clivagem precoce) e dia 2 . O tipo A apresentava de 2 a 5 células e <10% de fragmentação tipo I e ausência de multinucleação. O tipo B corresponde a embrião de 2 a 5 células , entre 10 a 15% de fragmentação tipo I-II e ausência de multinucleação. Considerado fragmentação tipo I quando tinha volume mínino e tipicamente associado a somente um blastômero; fragmentação tipo II localizado e ocupava predominantemente o espaço perivitelino.
DISCUSSÃO
O método de congelamento rápido, vitrificação, apresenta algumas vantagens, principalmente evitando a formação de gelo e a injúria celular ocorrido no congelamento lento entre +15 a -5 graus Celsius (Watson & Morris, 1987). Esses eventos lesam essencialmente o citoesqueleto e as membranas celulares (Pickering et al., 1990 , Ghetler et al., 2005), evitadas pelo congelamento rápido.
Em contrapartida, na vitrificação utiliza-se alta concentração de crioprotetores que são tóxicos para as células. Buscando minimizar esta toxicidade, várias combinações de alguns agentes durante o processo de vitrificação são estudadas e pesquisadas, especificamente o EG, DMSO e a sucrose. Por este motivo, a metodologia ideal de vitrificação ainda está em discussão (Arav, 1992, Yoon et al., 2000).
O método descrito por Kuwayama et al., 2005 utiliza um pequeno volume de solução para o congelamento rápido, evitando a injúria celular. Apresenta uma redução de 30% na concentração de crioprotetores, atenuando a toxicidade celular.
Trabalhos recentes (Ruvalcaba et al., 2005, Lucena et al., 2006, Katayama et al., 2003, Antinori et al., 2007) reportam taxa de sobrevida de oócitos variando de 89 a 99%, taxa de clivagem entre 89 a 91%, taxa de blastocisto por volta de 50% e taxa de gravidez variando entre 32,5 a 45% pelo método Cryotop.
Neste caso clínico, pode-se observar uma taxa de sobrevida pré-embrionária elevada e uma ausência ou discreta queda na qualidade pré-embrionária em alguns pré-embriões.
Nossas observações clínicas e laboratoriais exemplificadas neste caso clínico demonstram que o método Cryotop® descrito por Kuwayama et al. foi eficiente e viável para pré-embriões.
Arav A. Vitrification of oocyte and embryos. England: Portland Press ; 1992. p.255-64.
Watson PF, Morris GJ. Cold shock injury in animal cells. Symp Soc Exp Biol. 1987;41:311-40.