JBRA Assist. Reprod. 2008;12(3):11-14
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.3.02
Avaliação do desenvolvimento in vitro de embriões humanos após cultivo em microambiente
Embryo development in vitro in microenvironment culture
Núcleo Santista de Reprodução Humana
RESUMO
objetivo: O objetivo desse estudo foi avaliar as taxas de formação de blastocisto e gravidez após cultivo embrionário no sistema WOW, que consiste em um microambiente obtido através de “microfuros” sobre a cavidade de uma placa de cultura.Metodologia: O presente estudo foi realizado em 14 pacientes entre 20 a 43 anos, que se submeteram ao tratamento por fertilização in-vitro. Os embriões foram cultivados em placas WOW até o dia 5 de desenvolvimento (d5). A transferência foi realizada no dia 3(d3) ou no dia 5(d5) de desenvolvimento ou em ambos.
Resultados: Dos 112 embriões obtidos, 28 foram transferidos no d3 e 84 colocados em cultivo até o d5, sendo que 21 tornaram-se blastocistos (25%). Das 14 pacientes, 11 tiveram transferência dos embriões classes I e II no d3, permanecendo o restante de seus embriões em cultivo até o d5 e as outras 3 pacientes tiveram transferência apenas no d5. Das 11 pacientes que tiveram transferência no d3, 7 também tiveram blastocistos transferidos no d5 (64%). Então, das 14 pacientes do estudo, 10 tiveram blastocistos para serem transferidos, e um total de 8 pacientes engravidaram (57%).
Discussão: A taxa de gravidez obtida no presente estudo demonstra que o sistema WOW parece uma alternativa promissora para o desenvolvimento in vitro de embriões. O efeito pode ser explicado devido à quantidade de meio extremamente baixa em torno do embrião, permitindo ao embrião manter seu próprio microambiente, com a manifestação eficiente de fatores autócrinos e parácrinos.
Palavras-chave: sistema WOW, cultivo de embriões, blastocistos.
ABSTRACT
Objective: The objective of this study was to assess blastocyst development and pregnancy rates after embryo culture in the WOW system, which consists of a microenvironment obtained through “micro-holes” on a culture dish cavity.
Methodology: The present study was carried out in 14 patients aged between 20 and 43 years that were submitted to in-vitro fertilization treatment. The embryos were cultured in WOW dishes until day 5 of their development (d5). Transfer was carried out on day 3 (d3), on day 5, or on both days.Results:From 112 embryos obtained, 28 were transferred on d3, and 84 placed in culture medium until d5, of which 25 became blastocysts (25%). From 14 patients, 11 had classes I and II embryos transferred on d3, and their remaining embryos staying in culture until d5. The other 3 patients had embryos transferred only on d5. From the 11 patients that received the embryos on d3, 7 also had blastocysts transferred on d5 (64%). Therefore, from the 14 patients in the study, 10 received blastocysts, and a total of 8 patients got pregnant (57%).
Discussion: The pregnancy rate obtained in this study demonstrates that the WOW system seems to be a promising alternative for the development of in-vitro embryos. The positive effect may be explained by the extremely low amount of medium around the embryo, allowing the embryo to keep its own environment with an efficient manifestation of autocrine and paracrine factors.
Keywords: WOW system, embryo culture, blastocysts
INTRODUÇÃO
A taxa de sucesso na fertilização in-vitro está diretamente ligada a muitas variáveis tais como: protocolo de indução, qualidade oocitária, qualidade do cultivo embrionário, habilidade no manuseio de gametas e embriões e também à receptividade endometrial (Mahadevan, 1998). Os meios de cultivo sem dúvida tiveram alterações intensas, com mudanças e incremento de sais e componentes químicos (Gardner, 1998). Estas alterações possibilitaram a manutenção de embriões por mais tempo em incubadora, possibilitando o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (Gardner e Lane, 1998; Murakami et al., 2004). Recentemente há relatos de não haver diferença na taxa de gestação nas pacientes com idade inferior a 35 anos que recebem um ou dois blastocistos. Porém, a taxa de gemelaridade nestas pacientes aumenta substancialmente. Estes mesmos autores preconizam a transferência de somente um blastocisto para este grupo de pacientes e dois blastocistos para aquelas com idade superior a 35 anos (Kalu et al., 2008; Beesley et al., 2008).
A grande maioria dos embriões humanos concebidos através de fertilização in-vitro são rotineiramente transferidos para o útero no dia 2 ou 3, no estágio de desenvolvimento de 4 a 8 células, com taxas de implantação de 10 a 20% normalmente publicadas. Como in-vivo os embriões nessa fase de desenvolvimento residem na tuba uterina, entrando no útero somente após compactação, sendo provável que a exposição prematura de embriões em estágio de clivagem no útero comprometa o desenvolvimento e a viabilidade do mesmo (Bavister, 1995).
O cultivo de embriões até a fase de blastocistos leva a melhor seleção embrionária, com maior probabilidade de implantação e melhor sincronismo endometrial (Toledo et al., 2000; Gardner et al., 2000; Cruz et al., 1999; Dickey e Pyrzak, 1999). A maioria dos autores concorda que a transferência em fase de blastocisto pode diminuir a taxa de gestação múltipla e aumentar a taxa de implantação e gestação (Hernandes, 2001; Plachot et al., 2000).
Estudos prévios confirmam que tanto meios seqüenciais como co-cultivo podem suportar a cultura embrionária até o estágio de blastocisto ((d’Estaing et al., 2001). Os meios seqüenciais satisfazem quanto aos requerimentos nutricionais critério-específico para a formação de blastocistos (Gardner e Lane, 1997). O co-cultivo com células somáticas parece ter efeitos benéficos sobre o desenvolvimento embrionário. O mecanismo de ação pelo qual a co-cultura melhora o desenvolvimento dos embriões é ainda especulativo, mas inclui a possibilidade de remoção de substâncias tóxicas do meio como íons-metais pesados e radicais livres, e a secreção de substâncias embriotróficas como os fatores de crescimento. Apesar da importância dos fatores de crescimento para o embrião ter sido comprovada pela presença de receptores sobre o trofectoderma , não se tem encontrado diferenças nas taxas de gravidez após co-cultivo (Ménézo et al., 1990; Kauma et al., 1995). A utilização de meios seqüenciais sem os possíveis efeitos do co-cultivo tem levado a taxas semelhantes (Sakkas et al., 1994, Cohen et al., 1990; d’Estaing et al., 2001).
Na tentativa de melhorar as condições de cultura até o estágio de blastocisto, foi analisado um sistema que mantém a possível atuação dos fatores de crescimento, sem a utilização do co-cultivo. Pois a gota de 20 a 40ul usada tradicionalmente para cultivo dos embriões é grande demais para ter a manifestação eficiente de fatores autócrinos e parácrinos e volumes menores teriam o acúmulo de substâncias tóxicas. O objetivo desse estudo foi avaliar as taxas de formação de blastocisto e gravidez após cultivo embrionário no sistema WOW, que consiste em um microambiente obtido através de “microfuros” sobre a cavidade de uma placa de cultura. Este sistema de cultivo tem sido utilizado por Vajta e colaboradores no cultivo de embriões bovinos, com grande sucesso (Vajta et al., 2000).
MATERIAL E MÉTODOS
Após aprovação pelo comitê de ética do Núcleo de Reprodução Assistida e Hospital Almodin Ltda e consentimento esclarecido e informado, 14 pacientes foram incluídas aleatoriamente neste estudo. As pacientes tinham entre 22 a 42 anos de idade e as causas de infertilidade observadas enquadrava-se em cinco fatores: infertilidade masculina, infertilidade tubária, múltiplas causas, outras somente femininas e não explicadas.
Após rotina básica de propedêutica as pacientes iniciaram uso de contraceptivo oral contendo 0,15 mg de desogestrel e 0,03 mg de etinilestradiol (Microdiol®, Organon) diariamente no início do ciclo por no mínimo 19 dias. Para realizar o bloqueio hipofisário foi utilizado acetato de leuprolide (Lupron®, Abbot), como agonista de GnRH, através de aplicações subcutânea, a cada 24 (vinte e quatro) horas, iniciada quando faltavam entre 3 (três) a 8 (oito) dias para o término do uso do contraceptivo e era mantido até o dia do HCG. Após suspensão do anticoncepcional e uso contínuo do agonista de GnRH as pacientes realizam ecografia transvaginal entre o segundo e quarto dia do ciclo menstrual. O estímulo ovariano foi iniciado com FSH recombinante (Gonal®, Serono) ou urinário (Merional®, Meizler), em dose que variou de 150 a 300UI/dia, a critério clínico, entre 18 (dezoito) e 20 (vinte) horas por no mínimo 7 (sete) dias. Nova ecografia era realizada no oitavo dia de estímulo e iniciado uso de hMG (Merional®, Meizler) suspendendo, então, o FSH. Novas ecografias foram realizadas a cada 24h ou 48h e quando 1 (um) ou mais folículos apresentavam diâmetro médio maior ou igual a 18mm, administrava-se hCG, 10.000UI (Choriomon®, Meizler) em média 36 h antes da captação dos oócitos.
A captação era realizada com sedação em regime ambulatorial. Três a quatro horas após a captação os oócitos eram desnudados, com pipetas afiladas em diâmetros diferentes, passando primeiramente pela solução de hialuronidase (no máximo 1 minuto), posteriormente por 5 banhos de GV-HEPES (Ingamed-Brasil) com 10% SSS (Substituto de Soro Sintético) e eram colocados em placas de quatro cavidades com meio de cultivo GV (Ingamed-Brasil) com 10% de SSS onde os oócitos permaneciam até a micromanipulação de gametas.
Quatro a cinco horas após a captação era realizada a micromanipulação. A placa era preparada com uma gota central com 5μl PVP acrescentado de 1μl da suspensão com os espermatozóides e várias gotas de 5μl em torno com HTF-HEPES com 10% SSS no grupo 1 ou GV-HEPES com 10% SSS no grupo 2 onde foram colocados os oócitos, sob óleo. Os espermatozóides, na solução de PVP, foram imobilizados pela cauda e aspirados com a pipeta de microinjeção, passando-os para a gota com o oócito, que era então fixado com a pipeta holding de modo que o corpúsculo polar ficava às 12 ou às 6 horas. A pipeta de injeção, introduzida no ovócito às 3 horas e uma pequena sucção do citoplasma, feita de modo a assegurar a injeção do espermatozóide dentro do citoplasma. Depois da micromanipulação foram colocados individualmente em placas WOW (Ingamed-Brasil) em 400 µl de meio GV com 10% de SSS onde permanecia por três dias. No terceiro dia após avaliação era feita a transferência de 2 embriões e o restante era colocado em placas WOW com 400 µl de meio GVblast (Ingamed-Brasil) onde permaneciam por mais dois dias. Quando se tinha blastocistos era feita nova transferência de no máximo dois embriões. Nos casos de haver excedente, estes eram vitrificados pelo método Vitri-Ingá (Ingamed-Brasil).
O suporte de fase lútea foi iniciado na noite da captação, utilizando progesterona micronizada (Utrogestan®, Farmoquímica), 200mg, intravaginal, a cada 8 horas.
A dosagem do β-hCG (gonadotrofina coriônica subunidade Beta) foi realizada no 14º dia após a transferência dos embriões. Foi considerada gravidez as pacientes com hCG acima de 50 mUI/ml. A taxa de implantação foi definida somente após batimento cardíaco presentes ao redor da 13° semana pós-tranferência.
RESULTADOS
Dos 112 embriões obtidos, 28 foram transferidos no dia 3 de desenvolvimento e 84 colocados em cultivo até o dia 5 de desenvolvimento. Dos 112 embriões obtidos, 31 tinham de 6 a 8 células e eram classe I ou II (segundo RedLara). Dos 84 embriões deixados em cultivo até o dia 5, 21 tornaram-se blastocistos (25%) sendo transferidos. Das 14 pacientes, 11 tiveram transferência dos embriões classes I e II no dia 3, permanecendo o restante de seus embriões em cultivo até o dia 5 e as outras 3 pacientes tiveram transferência apenas no dia 5. Das 11 pacientes que tiveram transferência no dia 3, 7 também tiveram blastocistos transferidos no dia 5 (64%). Das 14 pacientes do estudo, 10 tiveram blastocistos para serem transferidos (71%), e um total de 8 pacientes engravidaram (57%) (Tabela 1)
Tabela 1. Desenvolvimento embrionário em placa WOW.
DISCUSSÃO
Já é bem estabelecido que a taxa de embriões por volume de meio de cultura é um fator muito importante durante cultivo in vitro (Larson e Kubisch, 1999; Lane e Gardner, 2000). Essa constatação levou ao desenvolvimento in vitro de embriões humanos em micro-gotas e no caso de embriões bovinos se faz o cultivo com um número grande de embriões, o que é inviável no caso de embriões humanos, pois o número de embriões, por paciente, que se obtêm normalmente é pequeno. Entretanto, a tradicional gota de 20 a 40 µl, usada para cultivo dos embriões humanos parece grande demais para se ter a manifestação eficiente de fatores autócrinos e parácrinos e volumes menores teriam o acúmulo de substâncias tóxicas incluindo amônia e radicais livres. No sistema de gotas, além dos materiais solúveis lipídicos do desenvolvimento embrionário serem diluídos, eles também, podem ser absorvidos pelo óleo mineral sobre as gotas. Em estudos sobre densidade de embriões bovinos foi sugerido que a proporção adequada de embriões para 1 µl de meio de cultura seria de “1:1” ou “2:1”. (Palasz e Thundathil, 1998) e camundongos (Kato e Tsunoda, 1994; Thouas et al., 2003)
A taxa de gravidez obtida no presente estudo demonstra que o sistema WOW parece uma alternativa promissora para o desenvolvimento in vitro de embriões humanos. O efeito pode ser explicado devido à quantidade de meio extremamente baixa em torno do embrião, permitindo uma concentração ideal de fatores embriotróficos circundando o embrião, criando seu próprio microambiente. Fatores embriotróficos têm sido descritos previamente (O`Niel, 1998). Recentes estudos dão evidências que secreção ativa de fatores no meio de cultura por blastocistos de camundongo ocorre e pode influenciar a regulação de desenvolvimento (Diaz-Cueto et al., 2000). Além disso, tem sido sugerido que enzimas proteolíticas secretadas pelo embrião e acumuladas em torno desse teriam um papel importante no afinamento da zona pelúcida de embriões de camundongos (Perona e Wassarman, 1986; Sawada et al., 1990; Lee et al., 1997) e de embriões humanos (Bongso e Fong, 1993).
O sistema WOW já foi testado em embriões bovinos, levando à obtenção de embriões de melhor qualidade. Vajta et al (2000) mostraram que a taxa de blastocistos bovinos foi aumentada pelo sistema WOW. Já, Pereira e colaboradores (2005) não encontraram diferenças no desenvolvimento a blastocisto após cultivaram embriões bovinos em grupos e individualmente, em gotas e no sistema WOW. Entretanto, os embriões cultivados no sistema WOW forneceram embriões de melhor qualidade, isso mensurado pela sobrevida após a vitrificação (Pereira et al., 2005).
Estudo semelhante foi realizado em embriões de porco, avaliando-se 4 diferentes sistemas de cultura (gota, cavidade com 0,5 ml de meio de cultivo e dois tamanhos diferentes de WOW (500 e 1000 µm)). O desenvolvimento a blastocisto usando o sistema WOW com 1000 µm foi significantemente maior que com os outros sistemas de cultura, indicando que o microambiente criado melhorou a produção de blastocistos de ovócitos de porco maturados in vitro após ICSI, mas que a eficiência do sistema depende do diâmetro da placa WOW (Taka et al., 2005). O sistema WOW representa uma mudança nas características físicas do ambiente de cultura. Outros sistemas têm sido sugeridos baseados em métodos de microcultura, levando em conta a densidade de embriões no meio de cultura. Thouas et al. (2003) cultivaram zigotos de camundongos em pares até o estágio de blastocisto em 1 ul na abertura final de capilares de vidro. Eles verificaram que os blastocistos cultivados nesse sistema continham mais células que os blastocistos cultivados nas microgotas padrão. Este estudo, portanto, demonstra que um volume de 1 ul é suficiente para suportar o desenvolvimento de zigoto a blastocisto. Entretanto, existem autores que sugerem que o desenvolvimento em volumes menores que 10 ul de meio seria comprometido pelo acúmulo de substâncias tóxicas incluindo amônia e radicais livres ( Carolan et al., 1996; Sinclair et al., 1997; Johnson e Nasr-Esfahani, 1994). O sistema WOW foi sugerido tentando evitar esse tipo de problema, pois permite, através de sua condição de abertura, a diluição de substâncias tóxicas originárias do metabolismo do embrião.
Com a melhoria recente dos meios de cultivos tem havido relatos de taxas de 50% de obtenção de blastocistos expandidos (Shapiro et al., 2007). Entretanto, como uma grande parte dos embriões humanos fazem bloqueio espécie-específico em 8 células, a maioria dos serviços tem receio de manter os embriões em cultivo até o quinto dia pós-fertilização. Acontece com freqüência que grande parte das pacientes que tem seus embriões cultivados até o dia 5 de desenvolvimento podem não ter blastocistos a serem transferidos mesmo com o uso de meios seqüenciais ou co-cultivo (Almodin et al., 2001). Neste estudo houve transferência de embriões tanto no dia 3 como no dia 5 de desenvolvimento, com o intuito de não comprometer o tratamento das pacientes. Setenta e um por cento das pacientes tiveram blastocistos a serem transferidos no dia 5, o que leva a acreditar na eficiência do sistema.
Apesar da taxa de gravidez bastante satisfatória (57%), a taxa de formação de blastocisto não pareceu muito significante. Entretanto deve-se levar em consideração que os embriões classes I e II foram transferidos no dia 3 de desenvolvimento. Além disso, os embriões foram cultivados mesmo até o dia 3 também nas placas WOW, o que pode ter influído na grande quantidade de embriões classe I e II obtidas no estudo. Os resultados, portanto estão em acordo com os excelentes resultados obtidos com modelos animais com o uso do sistema WOW, demonstrando que o sistema pode melhorar o desenvolvimento embrionário in-vitro. Porém, faz-se necessário estudo multicêntrico com maior número de pacientes para melhor avaliação.
Referências bibliográficas
Almodin C.G., Câmara V.C.M., Pereira L.A.C. Cultura de embriões até o estágio de blastocisto: Comparação entre o uso de meios seqüenciais e de co-cultura. JBRS, 23(9):589-595, 2001.
Hernandez E.R. Avoiding multiple pregnancies: sailing uncharted seas. Hum. Reprod. 16:615-616, 2001.