JBRA Assist. Reprod. 2008;12(3):20-23
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.3.04
Vitrificação em modelos bovinos: modelo de treinamento
Cattle oocytes vitrification: a training model
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RESUMO
A técnica de vitrificação tem sido bastante utilizada na criopreservação de embriões e também ovócitos humanos, com boas taxas de sucesso. Apesar de bastante simples, a técnica necessita de certa habilidade para ser realizada. Assim, esse estudo tem como objetivo propor o treinamento com ovócitos bovinos, mostrando ser possível avaliar os resultados de criopreservação após degelo desses ovócitos.
Palavras-chave: embriões bovinos, oócitos humanos, vitrificação
ABSTRACT
Vitrification method has been used for human embryos and oocytes cryopreservation with successful rates. Although it looks simple, this method requires some skills to be done. Therefore, the aim of this study is to propose some training with cattle oocites to show how is possible to assess the results of cryopreservation after oocites thawing.
Key words: cattle embryos, human oocytes, vitrification
INTRODUÇÃO
A criopreservação de embriões humanos tem sido realizada por algumas décadas e traz várias vantagens para as pacientes em tratamento por fertilização in-vitro (Trouson & Mohr, 1983). A criopreservação de embriões leva à oportunidade de limitar o número de embriões transferidos, evitando gravidez mutigemelar, além de levar a uma nova tentativa de gravidez sem a necessidade de um novo ciclo de estimulação ovariana. Fato esse que gera alto custo e pode, ainda, gerar riscos potenciais para a paciente, dentre eles, o risco devido à exposição anestesia ou o de desenvolvimento da síndrome de hiperestimulação ovariana. Apesar disso, a criopreservação de embriões continua gerando discussões devido aos problemas legais, éticos, sociais e práticos quanto à sua utilização.
A técnica padrão de criopreservação de embriões humanos utilizada até o momento consiste no método do resfriamento lento, que apresenta algumas desvantagens. Dentre elas está a necessidade de um equipamento de resfriamento programável de alto custo e o desenvolvimento do procedimento, que é bastante demorado. Apesar de alcançar com sucesso seu objetivo com embriões, esse modelo não tem sido utilizado na criopreservação de ovócitos, pois, ao contrário do que se observa com os embriões, as taxas de sobrevida de ovócitos são baixas. Porém, sabe-se que a criopreservação de ovócitos, ao invés de embriões humanos, resolveria os problemas éticos e sociais quanto à criopreservação, além de preservar a possibilidade de reprodução de mulheres jovens com câncer que são submetidas a tratamentos quimioterápicos, por exemplo.
A vitrificação parece ser a solução para muitos dos problemas da criopreservação, pois tem sido utilizada com sucesso na criopreservação de embriões e também ovócitos, tanto em animais quanto em humanos (Chen et al., 2000; Ptak et al., 1999). O processo de vitrificação utiliza altas taxas de crio-protetores conseguindo a solidificação da solução sem formação de cristais de gelo a baixas temperaturas ( Kuleshova et al., 1999; Rieger, 1998), o que é extremamente benéfico para a sobrevida das células.
O primeiro sucesso com vitrificação foi conseguido em 1998, quando Vatja e col. relataram a técnica de vitrificação com “Open Pulled Straw (OPS)” com bons resultados em embriões bovinos e Kuleshova e col. um ano mais tarde relataram uma gravidez usando o mesmo método. Desde então, a técnica parece não variar muito entre os diferentes pesquisadores, o que tem variado bastante são os aparatos usados durante o procedimento. A maioria desses aparatos são modificações do OPS (Hamawaki, 1999; Kuwayama, 2005; Lane, 1999; Mukaida, 2001; 2003). Estes têm que levar em consideração o princípio do método, ou seja, manter o embrião em quantidades mínimas de solução e permitir rápido resfriamento e aquecimento. Para utilização desses aparatos e bom desenvolvimento da técnica de vitrificação, necessita-se de treinamento. Para que esta técnica seja realizada com rapidez e eficiência, faz-se necessária a aquisição de um modelo animal para treinamento. Diante disso, o objetivo desse estudo é demonstrar a qualidade do processo de vitrificação de ovócitos bovinos, já que relatos recentes demonstram excelentes taxas de sobrevida destas células (Vajta et al., 1996; Otoi et al., 1998; Fuku et al., 1995; Downey et al., 1995; Keskintepe & Brackett, 1996).
MATERIAIS E MÉTODOS
Os ovários de vacas foram obtidos em abatedouro local. Imediatamente após a abertura do abdômen, os ovários eram retirados assepticamente, sendo colocados em uma cuba previamente esterilizada pelo calor. Os ovários eram retirados aleatoriamente, independente de raça, idade, prenhez ou ciclo, sendo transportados rapidamente para o laboratório em solução salina tamponada (D-PBS; GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA). No laboratório, os ovários eram colocados sobre um campo estéril, sob o fluxo laminar e os folículos de 2-8 mm de diâmetro, aspirados com seringa descartável de 10 mL, conectada a agulha 25X8 (21G). O líquido folicular obtido era, então, transferido para tubos de centrífuga, que permaneciam alguns minutos à temperatura ambiente para que os ovócitos envoltos por células cumulares sedimentassem. Posteriormente, o sedimento era depositado em placa de Petri com 2 a 3 mL de PBS e examinado sob microscópio esteroscópico para identificação dos ovócitos. Uma vez identificados os ovócitos, estes eram lavados em PBS. Esperava-se encontrar os ovócitos com cumulus ooforus bastante compactados, sugerindo que estivessem no estágio de prófase I da meiose I, sendo necessário, portanto, a maturação dos mesmos antes da vitrificação. Para a maturação, os ovócitos eram transferidos do PBS, com o auxílio de pipetas de Pasteur, para placas múltiplas Ingámed (Ingámed, Perobal-Brasil) contendo 0,5 mL de Meio 199 (sal de Earle’s, Sigma M-2154). O meio era, então, suplementado com 20% de soro de vaca no cio e FSH (10 μg mL-1). No máximo 30 ovócitos eram colocados em cada 0,5 mL distribuídos nas placas. A maturação era realizada em incubadora (Forma modelo 3159) a 38,5 °C, com atmosfera contendo 5% de CO2 e umidade máxima por um período de 24 a 26 horas.
Vitrificação
Cem ovócitos foram desnudados de suas células cumulares e da corona após maturação, para a vitrificação, com a utilização de hialuronidase. A vitrificação foi realizada com a utilização do Vitri-Equip (Ingámed, Perobal-Brasil - Figura 1) que consiste em uma caixa de foam contendo duas caixas de aço. Uma maior que recebe as capas das hastes de vitrificação em vapor de nitrogênio para resfriamento prévio e outra contendo nitrogênio para o processo de vitrificação em si e para receber as capas momentos antes de serem preenchidas com as hastes Vitri-Ingá (Ingámed, Perobal-Brasil - Figura 2). Após serem desnudados, os ovócitos eram colocados em solução de equilíbrio VI-1 (Ingámed, Maringá-Brasil) que contém etilenoglicol e dimetilsulfóxido. Os ovócitos foram equilibrados nessa solução por 5-15 minutos, e então transferidos para 3 gotas sucessivamente de 20µl de solução de vitrificação VI-2 (Ingámed, Maringá-Brasil) constituída de etilenoglicol, dimetilsulfóxido e sacarose, permanecendo 15 segundos em cada gota. Os ovócitos eram então colocados sobre as hastes Vitri-Ingá (Ingámed, Perobal-Brasil), aparato confeccionado que consiste em uma haste de plástico com uma parte muito fina (filme plástico) conectada a uma parte mais grossa. Os ovócitos eram depositados um ou dois sobre a parte mais fina de cada haste, com o mínimo volume de solução de vitrificação, e então imediatamente imersos em nitrogênio líquido. Quando uma quantidade maior que 1 µl de solução era depositada com os ovócitos sobre a haste, o excesso de líquido era aspirado de volta para a pipeta. O tempo máximo de permanência nas gotas até a imersão no nitrogênio nunca foi superior a 60 segundos, à temperatura ambiente.
Figura 1. Vitri-Equip
Figura 2. Hastes Vitri-Ingá
Para estocagem segura, a haste foi coberta com o protetor plástico previamente resfriado em vapor de nitrogênio e o conjunto era colocado em tambor de estocagem.
Degelo
Imediatamente após a retirada do tubo plástico protetor da haste Vitri-Ingá (Ingámed, Perobal-Brasil), A parte mais fina desta era totalmente imersa na solução de aquecimento DV-I (Ingámed, Maringá-Brasil) contendo sacarose a 37°C por 1 minuto. Os ovócitos coletados foram transferidos para solução diluente de sacarose DV-II (Ingámed, Maringá-Brasil) por 3 minutos à temperatura ambiente, e então lavado em solução tampão DV-III, (Ingámed, Maringá-Brasil) por 2 vezes, 5 minutos cada. Após o degelo, a avaliação da sobrevida foi realizada através do critério morfológico. A sobrevida dos ovócitos foi definida pela reexpansão do mesmo, tendo mantido membrana celular intacta, ooplasma normal e zona pelúcida, bem como o espaço perivitelínico de tamanho normal (Figura 3). Os ovócitos que não sobreviveram morfologicamente se encontravam escuros, sem expansão do ooplasma e ou zona pelúcida fragmentada (Figura 4).
Figura 3. Antes da MIV (0 horas)
Figura 4. Após a MIV (24 horas)
RESULTADOS
Dos cem ovócitos vitrificados, 86 sobreviveram e 14 mostraram-se morfologicamente alterados. A figura 3 representa um ovócito bovino antes de sofrer maturação. A figura 4, representa um ovócito já maturado após 24 horas. A figura 5 apresenta exemplos de ovócitos saudáveis, enquanto a figura 6, apresenta um exemplo de ovócito não saudável.
Figura 5. Representação de variáveis que podem ser encontradas em ovócitos saudáveis. (a) ovócito aparentemente saudável com ausência de alterações citoplasmáticas ou membranosas; (b) presença de pequenas pigmentações e depressões no interior, mas pode ser saudável; (c) presença de grande quantidade de grânulos corticais na periferia, porém, aparentemente saudável.
Figura 6. representação de ovócito com grande vacúolo e fragmentação do citoesqueleto e citoplasma, parecendo não estar saudável.
DISCUSSÃO
O aprimoramento técnico e a curva de aprendizado dos embriologistas têm sido árdua devido à falta de cursos específicos e material suficiente para tal. Alguns autores têm relatado experiência com a utilização de gametas de macacos para este fim e relatando, inclusive, o risco de dano gênico quando pessoas sem adequado treinamento utilizam técnica de fertilização in-vitro (Santalo et al., 1992). Cientes desta necessidade, autores têm relatado a utilização de gametas e embriões de primatas com êxito no treinamento de técnicos (Hewitson et al., 2004). Porém, nas ultimas décadas tem havido utilização, em larga escala, de gametas e embriões de camundongos (Huang et al., 2007). A utilização do desenvolvimento embrionário de camundongos tem sido utilizada também para avaliação de toxidade, eficiência de materiais e meios de cultivo, sendo essencial no controle de qualidade destes (Perin et al., 2008). Naturalmente, a utilização de gametas e embriões de camundongos tem sido eficiente. Entretanto, em nosso meio, sua utilização tem sido pouco utilizada devido à dificuldade em se obter os gametas e/ ou embriões, além do alto custo para sua viabilização. Há relatos da possibilidade do controle de qualidade do laboratório de FIV com a utilização de gametas e embriões bovinos (Almodin et al., 1993). O protocolo bovino tem sido de preço acessível e ao alcance de qualquer centro que tenha por perto um abatedouro em atividade e que disponibilize os ovários de vacas durante o abate. Esse modelo animal é utilizado rotineiramente, auxiliando, assim, o aprendizado dos profissionais.
O congelamento e preservação de embriões têm trazido grandes problemas éticos e morais em vários países. Devido a isso, diversos serviços de Reprodução Humana, que apresentam um estoque de embriões criopreservados, não sabem como proceder com eles. Afinal, além do problema social, sua manutenção resulta em alto custo para as clínicas. Independente da legislação do país, sempre haverá uma discussão quanto à moral, pois cada pessoa possui sua opinião própria, que varia com sua formação ética, moral e religiosa. Logo, independe do destino destes embriões, dificilmente haverá concordância entre médicos, pacientes e religiosos. A vitrificação tem se apresentado como método extremamente eficiente e oferece a possibilidade de criopreservação de ovócitos com extrema eficiência. Dessa forma, torna-se possível a criação de banco de ovócitos, até então inexistente. Naturalmente, haverá um acréscimo de trabalho nos serviços de reprodução, já que, após o degelo desses ovócitos, haverá necessidade de se realizar uma nova ICSI, enquanto que, com os embriões congelados, isto não seria necessário. Porém, a simplicidade do método e a não necessidade de equipamentos sofisticados para a conclusão da vitrificação, diminui, de maneira sensível, o custo de todo procedimento, além de resolver os problemas morais e éticos gerados anteriormente pelo congelamento de embriões.
Referências bibliográficas
Almodin C.G., Minguetti-Câmara V.C., Storti S. Controle de qualidade e treinamento técnico com embriões bovinos para laboratório de FIV. Ver. Bras. Ginec. Obst., 6:293-297, 1993.
Hewitson L. Primate models for assisted reproductive technologies. Reproduction, 128:293-299, 2004.