JBRA Assist. Reprod. 2008;12(4):11-15
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.4.02
Polimorfismo do receptor de FSH em mulheres inférteis com endometriose
FSH receptor polimorphysm in infertile women with endometriosis
1Médico Ginecologista e Obstetra. Mestrando do Programa de Ciências Médicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2Unidade de Pesquisa de Terapia Gênica. Centro de Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3Doutoranda do Programa de Ciências Médicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Estágio doutoral na Universidade de Paris XI
4Médico Ginecologista e Obstetra do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
5Professor de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Insemine Centro de Reprodução Humana, Porto Alegre, Rio Grande do Sul
Instituição: Hospital de Clínicas de Porto Alegre - Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre - Rio Grande do Sul, Brasil.Agência Financiadora: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Apresentação em congresso: XII Congresso Brasileiro de Reprodução Assistida - Congresso Regional da Rede Latino Americana de Reprodução Assistida
RESUMO
Objetivo: A endometriose atinge 10-15% das mulheres. Portadoras dessa patologia têm 20 vezes mais chances de serem inférteis e 30-60% das pacientes com endometriose apresentam infertilidade associada. Nesse estudo, estudaremos a prevalência do polimorfismo do gene do receptor do hormônio folículo estimulante (FSH) em pacientes com endometriose e infertilidade. Esse polimorfismo, que altera a transdução do sinal do receptor, seria o responsável por uma resposta ovariana inadequada ao FSH em pacientes inférteis.
Métodos: Resultados preliminares de um estudo casocontrole. Os casos são pacientes com infertilidade e endometriose. Os controles, pacientes sem endometriose e férteis. Determinaremos a prevalência alélica da substituição da aspargina (N) pela serina (S) no códon 680 do éxon 10 em ambos os alelos do gene que sintetiza o receptor do FSH.
Resultados: Foram analisadas 49 pacientes, sendo 31 casos e 18 controles. Os dois grupos não diferiram em sua avaliação demográfica. No grupo de pacientes com endometriose e infertilidade foram encontradas 5 pacientes homozigotas (S/S), 14 pacientes heterozigotas (N/S) e 12 pacientes genotipicamente normais (N/N). No grupo controle, houve uma com homozigose (S/S), 9 heterozigotas (N/S) e 8 pacientes com genótipo normal (N/N). Não obtivemos diferença significativa entre os grupos (P>0,05).
Conclusão: O polimorfismo do receptor do FSH está relacionado com alteração da resposta ovariana, mas essa alteração não havia sido estudada em mulheres com endometriose. Nosso estudo, pela primeira vez na literatura mundial, testa essa hipótese e refuta a associação da endometriose com essa alteração genética do receptor do FSH.
Palavras-Chave: endometriose, infertilidade, receptor do FSH.
ABSTRACT
Objective: Endometriosis affects between 10 and 15% of women of reproductive age. These patients have a 20 greater chance of being infertile and 30-60% of these patients are actually infertile. In this study, the prevalence of the foliculle stimulating hormone (FSH) gene receptor polimorfism will be studied in infertile patients with endometriosis. This polimorfism, witch modify the signal receptor transduction, could probably be responsible for the poor ovarian response towards FSH stimulation.
Material And Methods: Preliminary results of a casecontrol study. The study group is infertile women with endometriosis. The control group is fertile patients without endometriosis. We will study the genotypic prevalence of the substitution of a aspargine (N) for a serine (S) in the 680 codon of exon 10 in both alleles of the FSH receptor gene synthesizer.
Results: It was analyzed 49 patients, 31 in the study group and 18 in the control group. Both groups had nonstatistical differences regarding demographic characteristics. Among infertile patients with endometriosis, we found 5 homozygotic (S/S), 14 heterozygotic (N/S) and 12 genotipically normal (N/N). In the control group, we found 1 homozygotic (S/S), 9 heterozygotic (N/S) and 8 patients with normal genotype (N/N). There was no statistical difference between the groups (P>0,05).
CONCLUSION: The FSH receptor polimorfism is related to abnormal ovarian response, and it has not been studied in women with endometriosis. This article is a worldwide pioneer study on this subject and rejects the hypothetical association between endometriosis and this genetic abnormality of the FSH receptor.
Key Words: endometriosis, infertility, FSH receptor.
INTRODUÇÃO
A endometriose, tecido glandular e estroma endometriais fora da cavidade uterina, pode associar-se à infertilidade devido a alterações imunológicas, anatômicas, uterinas, endometriais, entre outras. (Olive and Schwartz 1993; Koninckx 1994; Nisolle and Donnez 1997)
Estima-se que 10% a 15% da população feminina apresentam endometriose. (Muse and Wilson 1982; Bancroft, Vaughan Williams et al. 1989; Olive and Schwartz 1993; Leyendecker, Kunz et al. 1998) A associação entre endometriose e infertilidade é bem estabelecida, sendo que mulheres com endometriose têm 20 vezes mais chances de serem inférteis. (Muse and Wilson 1982; Koninckx 1994; Baracat 1995) Trinta a sessenta por cento das pacientes com endometriose apresentam infertilidade associada. (Kistner 1975; Bancroft, Vaughan Williams et al. 1989; Olive and Schwartz 1993; Koninckx 1994) Em 1995, Cahill & Hull apontaram a endometriose como fator de infertilidade em 80% dos casos. (Cahill and Hull 2000) O prognóstico reprodutivo das pacientes inférteis com endometriose não é relacionado ao grau de endometriose, e sim a características da patologia. (Cahill and Hull 2000) Al-Azemi et al. concluíram que o grupo com endometriose exigiu mais ampolas de FSH por ciclo, com uma diferença ainda maior quando realizados ciclos subseqüentes. (Al-Azemi, Bernal et al. 2000) Uma meta-análise demonstrou que pacientes com endometriose têm uma diminuição de 50% na chance de ficarem grávidas após fertilização in vitro se comparadas ao grupo de mulheres sem esta doença. Os autores concluem que diminuição da fertilidade é decorrente de alterações oocitárias e de desenvolvimento embrionário. Se entendêssemos melhor estas alterações do ponto de vista fisiológico, poderíamos propor esquemas de indução da ovulação mais racionais e buscar otimizar os resultados nestas pacientes inférteis com endometriose. (Barnhart, Dunsmoor-Su et al. 2002) O gene do receptor do FSH está localizado no cromossomo 2p21-16, sendo pertencente à família dos receptores acoplados a uma proteína G. (Fan and Hendrickson 2005) Os polimorfismos no gene do receptor do FSH podem alterar a sua função através da alteração de propriedades bioquímicas do produto do gene ou alterando a atividade do promoter, a nível transcripcional. O polimorfismo promove alteração em um domínio intracelular do receptor não interferindo, desse modo, no acoplamento hormonal. (Gromoll and Simoni 2005)
Nosso grupo de pesquisa já demonstrou que pacientes com endometriose e infertilidade têm secreção e controle da prolactina alterada (Cunha-Filho 2001; Cunha-Filho, Gross et al. 2002), assim como anormalidades da fase lútea (Cunha-Filho, Gross et al. 2003) evidenciada pela disfunção na secreção de esteróides ovarianos (estrogênio e progesterona) e concentração folicular de fatores de crescimento modulada de forma anômala. (Cunha-Filho, Lemos et al. 2003) Recentemente, foi demonstrado que mulheres com endometriose mínima e leve apresentam uma alteração da coorte folicular com uma diminuição da reserva ovariana medida pelos níveis séricos do hormônio anti-Mulleriano no 3º dia do ciclo menstrual. (Lemos, Arbo et al. 2008)
No banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI), estão descritos mais de 700 polimorfismos no gene do receptor do FSH, sendo que apenas 5 deles são nas regiões codificadoras do gene (éxon). Um polimorfismo bastante comum na população caucasiana ocorre no éxon 10 do gene do receptor do FSH, nos códons 307 e 680 do domínio intracelular do receptor, e correspondem à substituição do nucleotídeo treonina pela alanina e do nucleotídeo aspargina pela serina, respectivamente. Os polimorfismos destes dois códons são completamente ligados, sendo a mutação apenas do códon 680 avaliada. (Simoni, Gromoll et al. 1999; Sudo, Kudo et al. 2002; Daelemans, Smits et al. 2004) A literatura não possui dados sobre os polimorfismos do receptor do FSH em mulheres com endometriose. O estabelecimento da prevalência gênica do polimorfismo no códon 680 do gene que sintetiza o receptor do FSH é o objetivo deste estudo. Assim, com o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na infertilidade das mulheres com endometriose, poderão ser propostos tratamentos mais racionais e baratos, aperfeiçoando os resultados reprodutivos dessas pacientes.
MÉTODOS
Delineamento
Será realizado um estudo caso-controle para o estabelecimento da prevalência alélica e genotípica do polimorfismo N680S (substituição do nucleotídeo aspargina pela serina) no éxon 10 do gene do receptor do FSH na população de mulheres inférteis com endometriose em comparação com um grupo controle de mulheres férteis sem endometriose.
Pacientes
As pacientes do grupo em estudo compreendem mulheres com endometriose e infertilidade em que os exames da investigação do casal não evidenciem nenhum fator masculino (espermograma normal segundo critérios da Organização Mundial da Saúde de 1992) ou seqüela de doença inflamatória pélvica a videolaparoscopia. Nesse estudo utilizamos a definição de infertilidade da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva como sendo a ausência de concepção por período de pelo menos um ano com manutenção de relações sexuais regulares. Para o diagnóstico de endometriose, utilizamos a videolaparoscopia com visualização direta de lesões características. Os demais critérios de inclusão são: idade até 38 anos completos, ciclos menstruais regulares com duração de 25-35 dias, presença de ambos os ovários, ausência de distúrbio endocrinológico e/ou ovariano clínico, índice de massa corporal entre 18-30 kg/m2 e disponibilidade em participar do estudo com assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido.As pacientes do grupo controle são pacientes com fertilidade comprovada que internaram para realização de ligadura tubária. Após serem orientadas sobre o objetivo e os procedimentos do estudo, as pacientes, caso concordem em participar, assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Os demais critérios de inclusão são: idade até 38 anos completos, ciclos menstruais regulares com duração de 25-35 dias, presença de ambos os ovários, ausência de distúrbio endocrinológico e/ou ovariano clínico, índice de massa corporal entre 18-30 kg/m2 e que engravidaram espontaneamente.
MÉTODOS
Para a detecção do polimorfismo N680S, será feita extração de DNA a partir de 10mL de sangue periférico coletado em EDTA utilizando a técnica de precipitação por sais. (Miller and Costa 1988) A seguir, serão amplificadas as regiões correspondentes ao polimorfismo N680S utilizando os primers e condições descritos por Sudo et al, 2002. (Sudo, Kudo et al. 2002) O produto de PCR será visualizado em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. A detecção dos polimorfismos será feita por digestão com as enzimas de restrição BseNI BsrI ER0881 1000u e Eco81I SauI ER0371 500u, respectivamente, segundo instruções do fabricante. Os fragmentos serão visualizados em gel de agarose 2,5% corado com brometo de etídio.
ESTATÍSTICA
As variáveis categóricas serão comparadas utilizando-se os testes de Qui-quadrado ou exato de Fisher. Variáveis contínuas serão analisadas utilizando-se os testes teste t de Student se tiverem distribuição normal, para comparação de médias entre dois grupos independentes ou o teste U de Wilcoxon-Mann-Withney se não paramétricas. As diferenças entre os grupos serão consideradas significativas quando P<0,05 em um teste unilateral. Foi calculado também o odds ratio (OR) com seu respectivo intervalo de confiança de 95%. Será utilizado o programa estatístico SPSS versão 12.0 para tabulação e análise dos dados.
RESULTADOS
Foram arroladas inicialmente 49 pacientes, sendo 31 pacientes no grupo de casos e 18 no grupo controle. Os dois grupos não diferiram em sua avaliação demográfica. Seguindo os critérios de inclusão, a diferença de idade nos dois grupos não foi estatisticamente significativa, assim como o índice de massa corporal, ciclos regulares e espermograma do marido. Todas as pacientes apresentavam ambos os ovários, não apresentavam distúrbios endocrinológicos clínicos e assinaram termo de consentimento livre e esclarecido.
A substituição do nucleotídeo aspargina (N) pela serina (S) no éxon 10 no cromossomo 2p21-16 foi pesquisada nos dois grupos (Figura I). No grupo de pacientes com endometriose e infertilidade foram encontrados 5 pacientes com homozigose para a mutação (S/S), 14 pacientes heterozigotas (N/S) e 12 pacientes genotipicamente normais (N/N). Nas pacientes férteis que realizaram ligadura tubária, houve 1 com homozigose para a mutação (S/S), 9 heterozigotas (N/S) e 8 pacientes com genótipo normal (N/N). (Fig1). Foram agrupados as pacientes com N/S e N/N nos casos e controles e comparadas com as homozogóticas para a mutação (S/S). Foram agrupadas as pacientes com N/S e N/N nos casos e nos controles e comparadas com as homozogóticas para a mutação (S/S) nesses mesmos grupos. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os casos e os controles, sendo P= 0,27. (Tabela I) As pacientes inférteis com endometriose tiveram chance 3,27 (odds ratio com intervalo de confiança 95% de 0,35-30,47) vezes maior do que as pacientes férteis de apresentarem homozigose para mutação no gene que codifica o receptor do FSH, estatisticamente não significativo com P= 0,52.
Tabela 1.
Figura I. Detecção do polimorfismo do gene do receptor do FSH em pacientes genotipicamente normais (N/N) e homozigotas para a mutação (S/S).
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Diferentes estudos buscam estimar as freqüências dos polimorfismos do gene do FSH, especialmente na população infértil. No entanto, as freqüências gênicas são bastante variadas conforme o local e o estudo realizado. Conway et al. não encontraram diferenças na freqüência gênica do polimorfismo na posição 680 do éxon 10 em mulheres com diferenças patologias ovarianas, como síndrome dos ovários policísticos (PCOS), resistência ovariana ou falência ovariana precoce, sendo que a freqüência do genótipo S/S ficou em torno de 40%. (Conway, Conway et al. 1999)
Greb et al. verificaram que mulheres com o polimorfismo S/S na posição 680 do éxon 10 apresentaram níveis mais elevados de FSH na transição lúteo-folicular e na fase folicular inicial que as com o genótipo N/N, embora o nível máximo de FSH fosse observado no mesmo dia em relação ao dia do pico do LH. A dinâmica hormonal durante a luteólise foi semelhante nos dois grupos, o que sugere que a duração maior do ciclo nas pacientes do grupo S/S é devido a uma fase folicular mais arrastada. Os níveis máximos de estradiol foram semelhantes entre os dois grupos, sugerindo que níveis mais elevados de FSH são necessários para adquirir os mesmos níveis de estradiol e atingir a ovulação nas pacientes com genótipo S/S. Estes autores não encontram explicação para os níveis mais elevados de FSH neste grupo, supondo que exista uma resistência aumentada dos folículos ovarianos destas pacientes ao FSH. Talvez essa explicação esteja relacionada com o polimorfismo genético encontrado. As pacientes do grupo S/S apresentaram um número de folículos antrais no início da fase folicular aproximadamente 20% maior. Estes autores encontraram níveis semelhantes de fator anti-mulleriano nos dois grupos, conotando uma reserva folicular semelhante entre eles. (Greb, Grieshaber et al. 2005)
A associação dos níveis basais de FSH com o genótipo não está bem estabelecida. Quando medido no terceiro dia do ciclo, alguns autores não encontraram diferenças entre os níveis de FSH entre as paciente com genótipo S/S e N/N (Behre, Greb et al. 2005; Falconer, Andersson et al. 2005; Greb, Grieshaber et al. 2005) enquanto outros as encontraram. (Perez Mayorga, Gromoll et al. 2000; Sudo, Kudo et al. 2002)
Estudos retrospectivos em mulheres que se submetem a procedimentos de reprodução assistida demonstraram uma sensibilidade diferenciada à gonadotrofina exógena dependendo do genótipo apresentado. Mayorga et al. encontraram que as pacientes homozigóticas para o aminoácido serina (S/S) na posição 680 do gene do receptor necessitaram de dose maiores de FSH que as homozigóticas para aspargina (N/N) ou que as heterozigóticas (S/N). Embora todos os grupos apresentassem níveis basais de FSH dentro da faixa considerada normal, as pacientes do grupo S/S apresentaram níveis basais mais altos que os outros grupos, indicando uma sensibilidade diminuída deste grupo ao FSH. (Perez Mayorga, Gromoll et al. 2000) De Castro et al. mostraram uma freqüência aumentada do alelo S/S entre as pacientes com má resposta à indução da ovulação, que também apresentaram uma maior tendência de cancelamento do ciclo por ausência de resposta. (de Castro, Ruiz et al. 2003) Sudo et al. encontraram que as pacientes com genótipo S/S necessitaram de doses maiores de HMG (gonadotrofina de mulher menopausada) e o nível máximo de estradiol foi menor que nos outros grupos. (Sudo, Kudo et al. 2002) Daelemans et al. em pacientes submetidas a estimulação ovariana para fertilização in vitro, mostraram dados conflitantes em relação à associação de hiperestímulo ovariano iatrogêncio. Estes autores encontraram uma freqüência alélica maior do aminoácido serina na posição 680 nas pacientes que desenvolveram hiperestímulo em relação aos controles, porém ocorreu um aumento da freqüência alélica S/S nas pacientes com sintomas mais severos. (Daelemans, Smits et al. 2004) Em estudo prospectivo, Behre et al. demonstraram que as pacientes com genótipo S/S quando estimuladas com as mesmas doses de FSH que as pacientes com genótipo N/N apresentavam pico de estradiol menor, mas que este desfecho se tornava igual se a dose de FSH era aumentada, embora o estudo não tivesse poder para detectar diferenças nos desfechos reprodutivos (número de oócitos, gestação, etc). (Behre, Greb et al. 2005)
Fica evidente a associação da endometriose com infertilidade e uma relação desta doença com anormalidades ovulatórias. Esse estudo é pioneiro na avaliação genotípica dessa população. Sabendo que 14% da população feminina brasileira é infértil e necessitaríamos de aproximadamente 140 mil ciclos de fertilização in vitro para tratar esta população (dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) o custo para o sistema de saúde com o tratamento de mulheres com endometriose, que acomete 30% dos 140 mil ciclos é muito elevado. Contudo, se soubermos manejá-las de forma mais racional e menos onerosa com os mesmos resultados, o sistema de saúde teria um benefício direto muito significativo.
Referências bibliográficas
Al-Azemi, M., A. L. Bernal, et al. (2000). ”Ovarian response to repeated controlled stimulation in in-vitro fertilization cycles in patients with ovarian endometriosis.” Hum Reprod 15(1): 72-5.
Baracat, E. C. L., G.R. (1995). Ginecologia Endócrina, Atheneu.
Olive, D. L. and L. B. Schwartz (1993). “Endometriosis.” N Engl J Med 328(24): 1759-69.