JBRA Assist. Reprod. 2008;12(4):16-19
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.4.03
Vitri-Ingá: Um Novo Protocolo De Vitrificação
Vitri-Inga: A New Vitrification Protocol
aMaterbaby - Reprodução Humana e Genética, Maringá, Paraná
bDepartamento de Obstetrícia, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, São Paulo
cFerticlin - São Paulo, São Paulo
Local do Trabalho:
Fertilclin e Materbaby - Reprodução Humana e Genética
Trabalho apresentado de forma oral no XII Congresso Brasileiro de Reprodução Assistida-Congresso Regional da Rede Latino Americana de Reprodução Assistida.
RESUMO
Objetivo: Propor a avaliação de um novo método de vitrificação através das taxas de sobrevida, fertilização e gravidez após vitrificação-aquecimento de oócitos.
Material e métodos: Das 54 pacientes incluídas neste estudo, 258 oócitos foram vitrificados-aquecidos pelo método de vitrificação Vitri-Ingá. No protocolo de vitrificação foram utilizadas duas soluções de vitrificação em concentrações diferentes e no protocolo de aquecimento foram utilizadas três soluções. Três horas após o aquecimento, foi realizado a injeção intra-citoplasmática de espermatozóides (ICSI). Após 72 horas a qualidade embrionária foi avaliada, e os embriões selecionados foram transferidos.
Resultados: Após aquecimento, 215 oócitos sobreviveram (83,3%). O ICSI foi realizado em 214 destes oócitos. Após 72 horas, o número de embriões clivados foi de 164 (76,6%), sendo que 99 embriões eram graus I e II (63,5%). A taxa de gravidez on-going foi de 24,5% , resultando em 13 pacientes grávidas.
Conclusões: O método de vitrificação proposto e estudado parece ser uma boa opção devido às altas taxas de sobrevida e fertilização após ICSI. Além disso, este método é uma alternativa eficiente, rápida e econômica.
Key words: oócitos, vitrificação, sobrevida.
ABSTRACT
Objective: The objective of this study was to propose the assessment of a new vitrification protocol through survival, fertilization and pregnancy rates after vitrification / thawing of oocytes.
Material and methods: Among 54 patients included in this study, 258 oocytes were vitrified, using Vitri-Ingá protocol. The vitrification protocol was performed using two different vitrification solution concentrations and the thawing protocol was performed in three steps. Three hours after thawing the oocytes was submitted to ICSI and 72 hours later the embryos was transferred.
Results: After thawing, 215 oocytes (83.3%) survived. ICSI was performed in 214 oocytes. After 72 hours, we have 164 (76.6%) embryos, 99 (63.5%) were top embryos. The pregnancy rate was 24.5%, resulting in 13 patients pregnant.
Conclusion: The vitrification protocol used same to be a good option due to the high survival and fertilization rates after ICSI. Despite that, this protocol is an efficient alternative, fast and economical.
Key words: oocytes, vitrification, survival.
INTRODUÇÃO
Com o surgimento da Reprodução Assistida em 1979, nasceu também a necessidade de criopreservar gametas e embriões. A criopreservação de espermatozóides teve sucesso rapidamente, devido ao pequeno tamanho da célula, entretanto, o mesmo não ocorreu com oócitos e embriões. Na década de 80, haviam pesquisadores desenvolvendo metodologias de criopreservação com a utilização de substâncias crioprotetoras. O uso de tais substâncias permitiu que protocolos de congelamento lento fossem utilizados com sucesso na última década em embriões humanos e têm sido utilizados até agora. Porém, o mesmo protocolo não tem trazido resultados positivos quando aplicado aos oócitos.
Alguns autores começaram a analisar os danos causados nos oócitos por este processo. Chen e colaboradores (2003) relataram que as diferenças entre os embriões e oócitos estavam na permeabilidade da membrana plasmática, na presença de grânulos corticais e no fuso na metáfase II nos oócitos. Ruffing e colaboradores (1993) relataram que o baixo coeficiente de permeabilidade da membrana plasmática dificulta a entrada das substâncias crioprotetoras ao mesmo tempo em que altas taxas de lipídeos intra-citoplasmáticos incrementam os cristais de gelo tornando os oócitos mais sensíveis ao congelamento que os embriões. Após a fecundação o aumento do cálcio livre no citoplasma aumenta a permeabilidade da membrana plasmática melhorando o trânsito do crioprotetor e diminuindo a formação de cristais de gelo nos embriões (Gook et al., 1993; Fabri et al., 2000). Na metáfase II os fusos estão em forma de barril, e os microtúbulos de dímeros de tubulina alfa e beta são facilmente afetados pelos cristais de gelo diminuindo sensivelmente a viabilidade dos oócitos (Zhou et al. (2002). Alguns pesquisadores preconizaram a criopreservação dos oócitos com vesícula germinal acreditando que os resultados fossem melhores, porém foram similares (Agca & Peter, 1997).
No final da década de 90 vários autores concordaram que as necessidades dos oócitos se resumiam em um protocolo que fosse com grande velocidade de resfriamento e aquecimento em reduzido tempo de exposição e pequeno volume de crioprotetor. (Bos-Mikich et al., 1995; Fuku & Downey, 1995; Saha et al., 1994; Vajta et al, 1996).
A partir do modelo desenvolvido por Vatja com open pulled straw (OPS) relatando sucesso com embriões bovinos no processo de vitrificação, vários pesquisadores desenvolveram novos métodos que tem sido aplicado com sucesso (Vajta et al., 1998). O processo de vitrificação que compreende a exposição em altas taxas de concentrações de crioprotetores por muito pouco tempo tem sido relatado com sucesso por vários autores tanto em animais como em humanos (Fuku et al., 1995; Vajta & Nagy, 2006). A partir destas pesquisas desenvolvemos um método prático de baixo custo e com altas taxas de recuperação de oócitos e embriões.
MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo envolveu pacientes com idade entre 23 a 45 anos, que se submeteram ao tratamento pela fertilização in-vitro, e tiveram mais que seis oócitos após punção folicular. A inclusão das pacientes no estudo ocorreu após avaliação propedêutica de rotina e com consentimento informado prévio.
As pacientes foram submetidas à hiperestimulação ovariana pelo protocolo longo. Na fase lútea média foi iniciado o uso de acetato de leuprolide (Lupron Abbott - Brasil) com aplicações subcutâneas de 0.15 ml. No segundo dia da menstruação foi reduzida a dose de acetato de leuprolide para 0.05 ml/d e iniciado estimulo com FSH recombinante (Gonal - Serono - Brasil). O crescimento folicular foi monitorado somente por ultra-som endovaginal. Gonadotrofina coriônica humana (HCG 10.000 IU, Choriomom - Meisler - Brasil) foi administrada quando 3 folículos com 20 mm de diâmetro eram observados.
A punção folicular foi realizada 36 horas após a administração do HCG usando ultra-som transvaginal. Depois da captação os oócitos foram cultivados em meio GV (Ingamed, Maringá-Brasil) suplementado com 10% de soro sintético substituto (SSS; Irvine Scientific, Santa Ana-CA-USA) em 5% de CO2 e 37ºC. Uma a duas horas após a punção folicular, os oócitos foram colocados em hialuronidase (Irvine Scientific, Santa Ana-Califórnia) para retirada das células do cumullus. Seis oócitos maturos (metáfase II) eram separados para a fertilização in-vitro ou ICSI e o restante dos oócitos era vitrificado. Foram vitrificados somente oócitos em metáfase II.
Duas horas após a coleta era avaliada a maturidade oocitária e começava-se o procedimento de vitrificação. Inicialmente os oocitos eram transferidos para a solução de equilíbrio VI-1 (Ingámed, Maringá-Brasil) que contém 7,5% de etilenoglicol e 7,5% de dimetilsulfóxido. Os oócitos eram equilibrados nessa solução por 5-15 minutos. Após este tempo, cada oócito era colocado em três gotas de 20µl de solução de vitrificação permanecendo por 15 segundos em cada gota. O tempo que o oócito permanecia na solução VII até a imersão da haste no nitrogênio não excedia 60 segundos. A solução de vitrificação VI-2 (Ingámed, Maringá-Brasil) era constituída de 15% de etilenoglicol e 15% de dimetilsulfóxido e sacarose 0,5M. Os oócitos foram então colocados na haste de vitrificação Vitri-Ingá (Ingámed, Maringá-Brasil), aparato que consiste em uma haste de polipropileno com uma extremidade muito fina (0.7 mm de espessura) conectada a outra extremidade mais grossa (Figura 1). Os oócitos foram depositados na haste, com o mínimo volume de solução de vitrificação, e então imediatamente imersos em nitrogênio líquido. Quando uma quantidade maior que 1 µl de solução era depositada com os oócitos sobre a haste, o excesso de líquido era aspirado.
Para estocagem segura a haste foi coberta com um protetor plástico. Os protetores plásticos eram primeiramente resfriados no equipamento Vitri-Equip (Ingámed, Maringá-Brasil). Posteriormente eram colocados verticalmente nesse mesmo equipamento, totalmente mergulhados no nitrogênio líquido para receber as hastes contendo os oócitos.
Para o aquecimento dos oócitos, imediatamente após a retirada do tubo plástico protetor da haste Vitri-Ingá, a parte mais fina desta era totalmente imersa na solução de aquecimento contendo sacarose 1M (DV-I, Ingámed, Maringá-Brasil) a 37°C por 1 minuto. Os oócitos coletados foram transferidos para solução diluente de sacarose 0,5M (DV-II, Ingámed, Maringá-Brasil) por 3 minutos à temperatura ambiente, e então lavados em solução tampão (DV-III, Ingámed, Maringá-Brasil) por 2 vezes, 5 minutos cada.
Após o aquecimento dos oócitos, a avaliação da sobrevida foi realizada através do critério morfológico. A sobrevida dos oócitos foi definida pela re-expansão do mesmo, tendo mantido membrana celular intacta, ooplasma normal e zona pelúcida, bem como o espaço perivitelínico de tamanho normal.
Nos oócitos que sobreviveram, 3 horas após o aquecimento era realizada o ICSI. A fertilização foi avaliada aproximadamente 17-19 horas após ICSI, e os préembriões mantidos em meio de cultura GV ( ingámed, Maringá-Brasil) suplementado com 10% de SSS, sob mistura gasosa (5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2). O desenvolvimento embrionário foi avaliado no dia 3, quando a transferência foi realizada guiada pelo ultra-som. A gravidez foi observada pela presença de gestação viável e batimento cardíaco presentes após a 13° semana póstranferência.
RESULTADOS
No presente estudo, 54 pacientes tiveram oócitos vitrificados, excedentes do ciclo de fertilização in-vitro, ao qual foram submetidas. Todas as pacientes tiveram transferência de embriões no ciclo de fertilização in-vitro com oócitos frescos, mas não engravidaram. Os oócitos excedentes vitrificados somaram um total de 258 oócitos que posteriormente foram aquecidos para nova tentativa de fertilização in-vitro e transferência embrionária.
Dos oócitos aquecidos, 215 sobreviveram (83%) e destes 214 foram submetidos ao ICSI. Um oócito não teve qualidade suficiente para ser injetado. Dos oócitos injetados, 164 fertilizaram (76,6%) e desenvolveram embriões. Destes, 99 eram graus I e II (63,5%) segundo a classificação da Rede Latino Americana de Reprodução Assistida. Treze pacientes tornaram-se grávidas após a transferência embrionária (24,5%) e não houve nenhum caso de aborto (tabela I).
Tabela I. Resultados após vitrificação e aquecimento de oócitos em metáfase II
DISCUSSÃO
Pesquisas com vitrificação de embriões e principalmente oócitos animais têm levado à formulação de novas idéias e a resultados bastante promissores em relação a taxas de gravidez. Muitos problemas biológicos e principalmente técnicos quanto à vitrificação têm sido eliminados e estão sendo resolvidos. Os protocolos de vitrificação são potencialmente nocivos devido à elevada concentração de crioprotetores. Melhorias nos protocolos de vitrificação têm introduzido misturas de dois ou mais crioprotetores tentando diminuir os efeitos tóxicos, além de reduzir o tempo e temperatura de exposição a esses crioprotetores.
Tem sido sugerido que a sobrevida de oócitos vitrificados não depende somente da concentração dos crioprotetores em solução, mas também da velocidade na qual eles são criopreservados e aquecidos. Este cuidado tem como objetivo evitar a formação de cristais de gelo. Para aumentar a velocidade do resfriamento tem-se tentado diminuir o volume de solução de congelamento a qual os oócitos ou embriões seriam vitrificados utilizando-se vários tipos de aparatos.
O ponto principal na obtenção de bons resultados com a vitrificação é o aparato usado, que forneça a possibilidade de vitrificar o embrião em um volume de líquido muito pequeno e permita que o procedimento seja realizado com bastante rapidez. As primeiras tentativas de vitrificação utilizando palhetas de 0,25 ml, as mesmas utilizadas em congelamento lento de embriões, não obtiveram sucesso. A primeira gravidez obtida por Kuleshova et al. (1999) pela vitrificação utilizou uma palheta plástica puxada até ficar bem fina (OPS), técnica utilizada anteriormente por Vajta et al. (1998) em embriões bovinos. Atualmente, os princípios do OPS são usados em muitas versões, super-finos OPS (Isachenko et al., 2000), micropipetas de vidro (Kong et al., 2000), pipetas de denudação flexíveis (Liebermann et al., 2002), micropipetas plásticas de diâmetro fino (Cremades et al., 2004, Hredzak et al., 2005). As versões mais recentes do OPS não conseguem reproduzir bons resultados devido à dificuldade de manipulação deste principalmente durante o aquecimento.
Os primeiros aparatos utilizados com sucesso na vitrificação foram sistemas fechados a exemplo do que era feito no congelamento lento, sem contato direto com o líquido nitrogênio.
Uma abordagem mais recente quanto ao uso de volume mínimo é o “cryotop”, onde se utiliza uma pequena haste de prolipropileno composta de um filme fino soldado a um cabo plástico com capa protetora (Kuwayama and Kato, 2000; Kuwayama et al., 2005 a; b). Neste método os oócitos devem ser mantidos sobre o filme, a solução excedente deve ser removida por aspiração, e a amostra imersa diretamente no nitrogênio líquido. O método é fácil de ser realizado e as taxas de sobrevida são maiores que aquelas encontradas com OPS. Kuwayama et al. (2005) relataram 41 % de gravidez, 12 pacientes grávidas após a transferência de 29 embriões originados de oócitos vitrificados-aquecidos, com taxas de sobrevida em torno de 90%. Os resultados parecem demonstrar que a técnica é mais eficiente que outros métodos apresentados até o momento.
A utilização do Cryotop levanta o problema quanto à possível contaminação com o líquido nitrogênio, que é provavelmente o mais forte argumento quanto ao seu uso especialmente em humanos. O risco de o nitrogênio transmitir doenças existe, entretanto, não há casos documentados de transmissão de doenças relacionada a transferência de embriões (frescos ou congelados). Os poucos casos publicados aconteceram com amostras de sangue congeladas, que tem volumes 103 a 104 vezes maiores que amostras congeladas para embriologia. Para minimizar o risco de contaminação tem-se utilizado nitrogênio “virgem” nos procedimentos de vitrificação, entretanto, uma outra opção, na tentativa eliminar o risco de transmissão de doenças seria o uso de nitrogênio filtrado com filtro de 0,22 um.
Acreditando que a técnica com o “Cryotop” leve a melhores resultados, mas com dificuldade da obtenção de aparatos comerciais desse tipo, foi criado o Vitri-Ingá, o qual foi utilizado nos procedimentos de vitrificação relatados nesse estudo. Na realidade este aparato utiliza um pouco do princípio de uma outra abordagem, “o Cryoloop”, que consiste em uma pequena alça de nylon preso a um suporte e equipado com um protetor. O filme de solução que se forma em torno do orifício da alça é forte o suficiente para manter o oócito ou embrião e com esse volume mínimo de solução as taxas de resfriamento podem ser extremante maiores (Isachenko et al., 2003). No Vitri-Ingá há um pequeno orifício onde o oócito ou embrião fica suspenso com um volume muito pequeno de líquido. O aparato usado é importante principalmente durante o aquecimento.
O método de vitrificação proposto e estudado parece ser uma boa opção devido às altas taxas de sobrevida e fertilização após ICSI (Gráfico I). Os resultados obtidos neste estudo demonstram o potencial da vitrificação no sucesso da criopreservação de oócitos. O sucesso dessa técnica além de resolver os problemas legais e éticos associados às técnicas de congelamento de embriões, oferece uma oportunidade para estender a capacidade reprodutiva.
Gráfico I. Avaliação dos resultados da técnica de vitrificação
Referências Bibliográficas
Agca Y, Liu J, Peter AT. Cryoprotectant and water permeability of immature and in vitro matured bovine oocytes. Theriogenology. 1997;40:340.