JBRA Assist. Reprod. 2008;12(4):25-29
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.4.05
Comparação dos resultados entre embriões descongelados provenientes de injeção intracitoplasmática de espermatozóides com espermatozóides ejaculados frescos ou criopreservados
A comparison of post-thaw results between embryos Arising from intracytoplasmic sperm injection with fresh or cryopreserved ejaculated spermatozoa
1Fertility - Centro de Fertilização Assistida Av. Brigadeiro Luis Antônio, 4545 - São Paulo - SP, Brasil. Cep: 01402-001
2Instituto Sapientiae- Centro de Educação e Pesquisa em Reprodução Assitida, Rua. Vieira Maciel, 62 - São Paulo - SP, Brasil. Cep: 04503-040
RESUMO
Objetivo: Avaliar a sobrevivência após descongelamento, taxas de implantação e gestação de embriões derivados de Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI) utilizando espermatozóides ejaculados frescos ou criopreservados.
Métodos: Taxas de sobrevivência, implantação e gestação após descongelamento foram avaliadas em 190 ciclos de transferência de embriões descongelados. Os ciclos foram divididos em dois grupos: ciclos com injeção de espermatozóides frescos (n=150) e ciclos com injeção de espermatozóides criopreservados (n=40).
Resultados: Entre os embriões descongelados 355 eram derivados de ciclos de ICSI utilizando espermatozóides frescos e 81 espermatozóides criopreservados. As médias de idade materna (33,34 ± 3,85 anos e 34,03±6,09 anos, P = 0,502), taxa de fertilização normal (77,1% e 76,7%, P = 0,911), número de embriões transferidos pré congelamento (1,58±0,77 e 1,64±0,78; P = 0,716) ou número de embriões criopreservados (3,47±2,89 and 2,73±2,91, P = 0,173) foi igual para os ciclos que utilizaram espermatozóides frescos ou criopreservados, respectivamente. Não foi observada nenhuma influência no uso de espermatozóides descongelados para ICSI no que diz respeito a qualidade embrionária pré congelamento (CR=6,090. P=0,779), sobrevivência embrionária (CR=2,584, P=0,635), taxas de implantação (CR=2,314, P=0,779), gestação (OR = 1,32; IC 95% = 0,55 - 2,67; P = 0,538) ou aborto (OR = 0,85; IC 95% = 0,17 - 4,13; P = 0,837).
Conclusão: Nossos achados indicam que o processo de criopreservação seminal não apresenta impacto nas taxas de sobrevivência embrionária, e, além disso, os resultados clínicos em ciclos de descongelamento embrionário não diferem quando são utilizados espermatozóides frescos ou criopreservados.
Palavras Chave: Sêmen, embrião, criopreservação, ICSI, espermatozóide
ABSTRACT
Objective: To assess post-thaw survival, implantation, and pregnancy rates of embryos derived from Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) using fresh or cryopreserved ejaculated sperm.
Methods: Post-thaw survival, implantation, and pregnancy rates were evaluated in 190 frozen-thawed embryo transfer cycles. The cycles were split into two groups: cycles in which fresh sperm were injected (n=150) and cycles in which cryopreserved sperm were used (n=40).
Result(s): Among the frozen thawed embryos 355 were derived from ICSI cycles using fresh sperm and 81 embryos derived from ICSI cycles using cryopreserved sperm. The mean maternal age (33.34 ± 3.85 y-old and 34.03±6.09 y-old, P = 0.502), normal fertilization rate (77.1% and 76.7%, P = 0.911), mean number of embryos transferred pre-freezing (1.58±0.77 and 1.64±0.78; P = 0.716) or mean number of cryopreserved embryos (3.47±2.89 and 2.73±2.91, P = 0.173) were equal for cycles that used fresh or cryopreserved sperm respectively. It was not observed any influence of the use of frozen/thawed sperm for ICSI on the embryo quality prior freezing (RC=6.090. P=0.779), embryo survival (RC=2,584, P=0,635), implantation (RC=2.314, P=0.779), pregnancy (OR = 1.32; IC 95% = 0.55 - 2.67; P = 0.538) or miscarriage rates (OR = 0.85; IC 95% = 0.17 - 4.13; P = 0.837).
Conclusion: Our findings indicate that the semen cryopreservation process does not impact in embryo survival rate and moreover, the clinical outcomes in embryo thaw cycles do not differ when fresh or thawed sperm are used.
Key Words: Semen, embryo, cryopreservation, ICSI, spermatozoa
INTRODUÇÃO
Atualmente a criopreservação de espermatozóides e tecido testicular vem se tornando cada vez mais importante devido às técnicas de reprodução humana assistida (TRA), proporcionando a preservação da fertilidade masculina, independente da causa de infertilidade (Sanger, Olson et al. 1992; Rofeim and Gilbert 2005). Através da criopreservação espermática, pacientes portadores de neoplasias submetidos à quimio/radioterapia, pacientes que serão submetidos à vasectomia ou que tenham profissões de alto risco e aqueles que possam vir a sofrer danos a espermatogênese, encontram a possibilidade de concepção, através ou devido ao armazenando amostras seminais previamente ao tratamento (Sanger, Olson et al. 1992).
Diversos estudos foram realizados a fim de avaliar a influência da criopreservação na qualidade seminal (Rofeim and Gilbert 2005; Desrosiers, Legare et al. 2006). Alguns autores relatam que a inseminação intra-uterina com amostras de sêmen ejaculado criopreservado resulta em baixas taxas de gestação quando comparadas ao uso de espermatozóides frescos (Kuczynski, Dhont et al. 2001), embora outros autores tenham demonstrado que a injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) utilizando espermatozóides criopreservados apresenta taxas de fertilização e gestação similares àquelas utilizando espermatozóides frescos (Perraguin-Jayot, Audebert et al. 1997; Kuczynski, Dhont et al. 2001; Marcus-Braun, Braun et al. 2004). Entretanto, mesmo não havendo dúvidas de que a utilização de espermatozóides criopreservados possa resultar em altas taxas de fertilização de oócitos submetidos à ICSI, mais estudos comparativos da eficácia desta técnica com espermatozóides frescos e criopreservados provenientes de pacientes inférteis devem ser realizados (Gil-Salom, Romero et al. 1998; Madgar, Hourvitz et al. 1998; Palermo, Schlegel et al. 1999).
As TRA normalmente produzem grande número de embriões, dessa forma, a criopreservação embrionária tornouse um complemento importante, visto que possibilita a redução do número de embriões transferidos por ciclo. Além disso, a criopreservação fornece muitos outros benefícios clínicos como o aumento da taxa de gestação cumulativa, a redução do risco de gestações múltiplas e da síndrome de hiperestimulação ovariana. Entretanto, sabe-se que vários fatores estão relacionados ao sucesso do congelamento e descongelamento embrionário, tais como o estágio de clivagem no momento da criopreservação, a aparência morfológica embrionária pré congelamento, a suplementação hormonal durante o ciclo de transferência pós descongelamento, o estímulo ovariano utilizado previamente a punção oocitária e o resultado do ciclo de transferência dos embriões a fresco [18-20]. Estudos a respeito da sobrevivência embrionária após criopreservação e seu potencial de produzir gestação após transferência permanecem em discordância, visto que alguns autores relataram não haver nenhuma influência [19], enquanto outros relatam efeitos deletérios da criopreservação no embrião diminuindo o seu potencial de implantação [29].
Dessa forma, este estudo tem como objetivo comparar as taxas de sobrevivência, implantação e gestação de embriões descongelados provenientes de ciclos de ICSI onde foram utilizados espermatozóides ejaculados frescos ou criopreservados.
METODOS
Desenho do Experimento
Este estudo foi realizado em pacientes submetidas à transferência de embriões descongelados provenientes de ICSI com espermatozóides ejaculados frescos (n = 150) ou criopreservados (n = 40). Foram excluídos deste estudo pacientes com amostra seminal de concentração inferior a 5,0 x 106/ml. Com o objetivo de avaliar exclusivamente a contribuição da condição espermática nas taxas de fertilização, implantação e gestação e descartar o fator oocitário de infertilidade, foram excluídas pacientes com idade maior que 37 anos ou que obtiveram menos de quatro oócitos em metáfase II (MII) após a punção. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa local e para a realização do mesmo, foi obtido consentimento informado, onde os pacientes concordaram em compartilhar os resultados do tratamento para fins de pesquisa.
Estímulo ovariano controlado
A estimulação ovariana controlada foi realizada através de bloqueio com agonista GnRH (GnRHa, Lupron Kit™, Abbott S.A Societé Française des Laboratoires, Paris, France) seguida de estimulação ovariana com FSH recombinante (Gonal-F®, Serono, Geneve, Switzerland). A dinâmica folicular foi acompanhada por ultra-sonografia iniciada no quarto dia de administração da gonadotrofina. Quando foram observados crescimento folicular e níveis de estradiol adequados, foi administrado Gonadotrofina Corionica Humana - hCG (r-hCG, Ovidrel™, Serono, Geneve, Switzerland) para ativar a da maturação folicular final. A punção folicular foi realizada 35-36 h após a administração do hCG sob anestesia geral guiada por ultra-sonografia transvaginal.
Preparação dos oócitos
Após a recuperação, os oócitos foram incubados em meio de cultura (G-MOPS™-V1, Vitrolife, Kungsbacka, Sweden) e cobertos com óleo mineral (Ovoil™, Vitrolife, Kungsbacka, Sweden) a 37ºC e 6% CO2 por 5 horas. Foram removidas as células do complexo cumulus-corona após exposição dos oócitos a 30 segundos em meio de cultura Hepes-buffered contendo 80 IU/mL de hyaluronidase (Irvine Scientific, Santa Ana, USA), seguida de retirada manual destas células através do uso de pipetas Pasteur de vidro afiladas (Humagen Fertility Diagnostics, Charlottesville, Virginia, USA).
Tabela I. Características dos ciclos onde foi realizado ICSI com espermatozóides ejaculados frescos ou criopreservados
Os oócitos denudados foram classificados de acordo com seu grau de maturação nuclear e aqueles que extrusaram o primeiro corpúsculo polar foram considerados para utilização na ICSI.
Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides
Para o procedimento de ICSI, os oócitos foram incubados em gotas individuais de 4µL de meio tamponado (G-Mops™, Vitrolife, Kungsbacka, Sweden). A amostra seminal processada foi colocada em uma gota central de 4µL de solução de polyvinylpyrrolidone (PVP, Irvine Scientific, Santa Ana, USA) em uma placa de cultura de 60X15mm (Corning®, New York, USA) coberta de óleo mineral aquecido (Ovoil™, Vitrolife, Kungsbacka, Sweden). A injeção espermática foi realizada em placa aquecida à temperatura de 37ºC em microscópio invertido (Eclipse TE 300; Nikon®, Tokyo, Japan) 40 horas após a aplicação do hCG.
Avaliação da fertilização, qualidade embrionária e transferência embrionária
A fertilização oocitária foi avaliada 16-20 horas após a ICSI e foi considerada fertilização normal a presença de dois pronucleos claramente distintos. A qualidade embrionária foi avaliada sob microscópio invertido (Eclipse TE 300; Nikon®, Tokyo, Japan). Os seguintes parâmetros foram avaliados: (i) número de blastômeros, (ii) porcentagem de fragmentação, (iii) simetria dos blastômeros, (iv) presença de multinucleação e (v) defeitos na zona pelúcida e citoplasma.A transferência embrionária foi realizada no segundo ou terceiro dia de desenvolvimento. Foram considerados bons embriões aqueles que apresentaram as seguintes características: de 3 a 5 células no segundo dia e 6 a 10 células no terceiro dia de desenvolvimento, porcentagem de fragmentação inferior a 15%, blastômeros simétricos, ausência de multinucleação, citoplasma claro com granulação moderada e sem inclusões, ausência de granulações no espaço perivitelínico e ausência de dismorfismo da zona pelúcida. Para cada casal, foi transferido de um a quatro embriões, de acordo com a idade da mulher. Os embriões excedentes e de boa qualidade foram selecionados para congelamento no terceiro dia após a injeção.
Congelamento embrionário e procedimento de descongelamento
A criopreservação foi realizada através de protocolo lento de congelamento com uso de propanediol (PROH) como crioprotetor. O congelamento e descongelamento foram realizados utilizando-se os kits comerciais como recomendado pelo fabricante (Irvine Scientific, Santa Ana, USA).Após o procedimento de descongelamento os embriões foram transferidos para meio de cultura, e o estágio de desenvolvimento embrionário foi cuidadosamente avaliado sob o microscópio invertido. A sobrevivência e integridade dos embriões descongelados foram consideradas quando os blastômeros apresentavam ≥ 50% de membranas morfologicamente normais e citoplasma claro. Os embriões foram cultivados em incubadora com 5% CO2, a 37ºC, por 2-4 horas antes da transferência. A técnica de assisted hatching foi realizada através do uso do laser OCTAX (OCTAX PolarAIDE™, Herborn, Germany).
Análise Estatística
Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão (DP) para variáveis numéricas e proporções (%) para variáveis categóricas. A média dos valores foi comparada pelo test t de Student’s.Para avaliar a influência do uso de espermatozóides descongelados para ICSI na (i) qualidade embrionária pré congelamento, (ii) sobrevivência embrionária pós descongelamento, (iii) taxas de implantação, (iv) gestação e (v) aborto pós descongelamento, foi realizada análise de regressão multivariada. Para análise de regressão linear, os resultados foram expressos como coeficiente de regressão (CR) e valor de P, e para análise de regressão logística binária os resultados foram expressos em odds ratios (OR), e valor de P.Todas as análises de regressão realizadas foram ajustadas para idade materna, número de embriões transferidos e taxa de fertilização, sendo essas consideradas possíveis variáveis conflitantes para as análises. Foram considerados resultados significativos quando P < 0,05. Para a análise dos dados foi utilizado o programa estatístico Minitab (versão 14).
RESULTADOS
Entres os embriões descongelados, 355 eram provenientes de ciclos de ICSI utilizando espermatozóides frescos e 81 eram embriões de ciclos de ICSI utilizando espermatozóides criopreservados. Os grupos eram semelhantes em relação à idade materna, taxa de fertilização normal, média de embriões transferidos pré congelamento e média de embriões criopreservados.
Não foi observado nenhuma influência do uso de espermatozóides criopreservados para ICSI no que diz respeito à qualidade embrionária pré congelamento (CR=6,090. P=0,779), sobrevivência embrionária (CR=2,584, P=0,635), implantação (CR=2,314, P=0,860), gestação (OR = 1,32; IC 95% = 0,55 - 2,67; P = 0,538) ou aborto (OR = 0,85; IC 95% = 0,17 - 4,13; P = 0,837).
Entre os embriões que sobreviveram ao procedimento de congelamento/descongelamento, 21.5% apresentaram todos os blastômeros intactos, 20.6% derivados de ICSI com espermatozóides ejaculados criopreservados e 21.8 % derivados de ICSI com espermatozóides ejaculados frescos.
DISCUSSÃO
O objetivo deste estudo foi investigar a existência de alguma diferença na sobrevivência embrionária pós descongelamento, taxas de implantação e gestação em pacientes submetidas a ciclos de descongelamento embrionário após ICSI utilizando espermatozóides frescos ou criopreservados. Sabe-se que a qualidade espermática exerce um importante papel durante a fertilização (Swann, Saunders et al. 2006; Saunders, Swann et al. 2007). Além disso, a viabilidade de cada embrião transferido depende da qualidade biológica do espermatozóide e do oócito. Os efeitos paternos na pré-implantação embrionária tem sido apontados como responsáveis pelas falhas repetidas nas tentativas de reprodução assistida, e o desenvolvimento embrionário pré-implantacional pode ser comprometido por deficiências no genoma nuclear espermático ou por fatores citoplasmáticos derivados dos espermatozóides (Benchaib, Braun et al. 2003; Tesarik 2005).
A criopreservação de amostras seminais é parte integral dos programas de concepção assistida e apresenta aplicação em diversas circunstâncias, tais como em situações onde existe algum dano a fertilidade masculina, assegurando a fertilidade de homens que serão submetidos à vasectomia, quimio/radioterapia e banco de sêmen de doador. Entretanto, durante a criopreservação os espermatozóides são submetidos a mudanças dramáticas em seu ambiente extra e intracelular devida exposição à crioprotetores, refrigeração, congelamento e descongelamento. Os efeitos físicos e químicos desses processos e o uso desses reagentes são conhecidos por prejudicarem a estrutura espermática e suas capacidades funcionais (Critser, Arneson et al. 1987; Check, Check et al. 1991; Cross and Hanks 1991).
Diversos estudos descreveram que o congelamento e descongelamento dos espermatozóides resultam na redução do metabolismo espermático o qual limita o número de espermatozóides funcionais viáveis para as técnicas de concepção assistida (Hammerstedt, Graham et al. 1990; Plachot, Antoine et al. 1996; Hammadeh, Askari et al. 1999). O efeito predominante da criopreservação no sêmen é a perda da viabilidade, redução da motilidade, transformações morfológicas e alterações na estrutura da cromatina (Critser, Arneson et al. 1987; Check, Check et al. 1991; Cross and Hanks 1991). As mudanças na estrutura do DNA após a criopreservação seminal têm sido estudadas por muitos grupos, apresentando resultados contraditórios. Alguns autores relataram a destruição do DNA, enquanto outros grupos relataram apenas a ocorrência de algumas mudanças em homens com fertilidade diminuída (Hammadeh, Askari et al. 1999; de Paula, Bertolla et al. 2006).
Entretanto, nossos resultados demonstraram que o uso de espermatozóides ejaculados criopreservados não afeta o desenvolvimento embrionário tanto a fresco, quanto após o descongelamento do embrião. Além disso, foi observado que a sobrevivência embrionária, taxas de implantação e gestação não foram afetadas pela criopreservação espermática.
A criopreservação embrionária também exerce um papel significante na reprodução humana assistida, proporcionando aos pacientes a possibilidade de mais de uma tentativa de gestação após o ciclo de estimulação ovariana, diminuindo a exposição dessas pacientes a gonadotrofinas exógenas e melhorando as taxas de gestação cumulativa (Veeck 2003; Anderson, Wilkinson et al. 2005). O principal problema durante a criopreservação embrionária é a formação de cristais de gelo no ambiente intracelular, o que pode levar a danos celulares e retardo no desenvolvimento do embrião (Shaw and Jones 2003). Uma variedade de fatores são citados na literatura como sendo interferentes no impacto da sobrevivência embrionária pós descongelamento, incluindo as características do estímulo utilizado durante o ciclo, tipo de crioprotetor utilizado, e adição de sucrose ao agente crioprotetor (Lassalle, Testart et al. 1985; Testart, Lassalle et al. 1987; Frydman, Parneix et al. 1988; Tesarik, Kopecny et al. 1988; Oehninger, Toner et al. 1992; Van der Elst, Van den Abbeel et al. 1996).
Além disso, a implantação e desenvolvimento pós-implantacional podem ser negativamente influenciadas pela técnica de transferência embrionária e por um complexo de fatores de ativação local responsáveis pela receptividade uterina. Um estudo recente demonstrou que a ICSI realizada com espermatozóides ejaculados frescos ou criopreservados apresenta resultados comparáveis em termos de fertilização e qualidade embrionária (Kuczynski, Dhont et al. 2001). De fato, uma vez que a ativação do genoma embrionário tem início a partir do segundo ciclo celular, a manifestação de genes derivados dos espermatozóides antes desse estágio é pouco provável (Tesarik, Kopecny et al. 1986; Tesarik, Kopecny et al. 1988).
Concluindo, nós sugerimos que a criopreservação espermática associada ao congelamento embrionário pode ser uma importante ferramenta para preservar a fertilidade masculina e aumentar os níveis de gestação cumulativa sem impacto no sucesso da técnica de ICSI.