JBRA Assist. Reprod. 2008;12(4):30-33
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.4.06
Presença de espermatozóides no ejaculado em pacientes com azoospermia não-obstrutiva
Presence of spermatozoa in the ejaculate of non-obstructive azoospermic patients
1-Alunas de Iniciação Científica
2-Grupo de Pesquisa Anatomia Funcional do Aparelho Urogenital PUC Minas/CNPq
RESUMO
Objetivo: Pesquisar e para identificar espermatozóides, presentes no ejaculado de pacientes com azoospermia não-obstrutiva. Analisar o nível sérico do hormônio foliculo-estimulante (FSH) e a histologia testicular como fatores preditivos para a recuperação espermática
Material e Métodos: 60 pacientes, com idades compreendidas entre os 20 e os 50 anos, com diagnóstico inicial compatível com azoospermia não-obstrutiva, coletaram duas 2 amostras seminais, para análise macroscópica e microscópica dos parâmetros diferenciados para cada amostra. Na ausência de espermatozóides, toda a amostra foi transferida para um tubo cônico e após centrifugação o sedimento foi analisado prontamente. As biópsias testiculares foram classificadas como hipoespermatogênese, parada de maturação e Sertoli cell-only syndrome.
Resultados: Os resultados mostraram que em 13 indivíduos com diagnóstico de azoospermia não-obstrutiva foram encontrados espermatozóides no ejaculado. O achado histológico mais freqüente foi na parada de maturação (46,16%), seguido por hipoespermatogênese (23,08%).
Conclusão: Em situações clínicas em que o diagnóstico inicial é azoospermia não-obstrutiva, uma análise seminal simples de rotina, não é suficiente para confirmar este diagnóstico e análise dos sedimentos centrifugados pode ter conseqüências clínicas relevantes. A histologia testicular não pode ser usada como o mais viável preditor de recuperação bem sucedida de espermatozóides no ejaculado. O nível de FSH sérico não teve relação significativa para o sucesso de recuperação de espermatozóides.
Palavras-chave: sêmen, azoospermia, infertilidade masculina.
ABSTRACT
Objective: To search and to identify spermatozoa, present in the ejaculate of non-obstructive azoospermic patients. Serum folicle stimulating hormone (FSH) level and testicular histology were examined as positive predictive factors for sperm recovery.
Materials and Methods: 60 patients, aged between 20 and 50 years, with initial diagnosis compatible with non-obstructive azoospermia, underwent up to 2 seminal samples, with assessment of macroscopic and microscopic parameters differentiated for each sample.In the absence of spermatozoa, the entire sample was transferred to a conic tube and following centrifugation the sediment was freshly analyzed. Testis biopsis were categorized as hypospermatogenesis, maturation arrest and Sertoli cell-only syndrome.
Results: The results showed that in 13 individuals diagnosed with non-obstructive azoospermia were found sperm in ejaculate. The most frequent testicular histological finding was maturation arrest (46,16%), followed by hypospermatogenesis (23,08%).
Conclusion: In clinical situations where the initial diagnosis is non-obstructive azoospermia, one single routine seminal analysis is not enough to confirm this diagnosis and the analysis of the centrifuged sediment can have relevant clinical consequences. Testicular histology can not be used as the most reliable predictor of successful sperm recovery. Serum FSH level has no significant relationship to successful sperm retrival.
Key-words: semen, azoospermia, male infertility.
INTRODUÇÃO
O fator masculino é responsável por um terço dos casos de infertilidade, enquanto 20% das causam são imputadas conjuntamente à mulher e ao homem. Antes de 1992 a infertilidade masculina era considerada quase que intratável em muitos casos. Com o aparecimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) foi possível solucionar de forma eficaz grande parte destes casos, através da utilização de um número reduzido de espermatozóides obtidos do ejaculado (Jaffe & Jewelewicz, 1991; Palermo et al., 1992).
A azoospermia não-obstrutiva é a ausência de espermatozóides no ejaculado seminal devido à deficiência de produção de espermatozóides, sendo identificada em 12% dos homens inférteis. Nestes pacientes as principais alterações histológicas detectadas na biópsia testicular são a esclerose tubular e a Sertoli cell-only syndrome (11-20%), parada de maturação da espermatogênese (4 a 40%) e hipoespermatogênese (50%), sendo que nos casos de aplasia de células germinativas ou parada de maturação, espermatogênese focal pode estar presente (Ubaldi et al., 1999; Arent et al., 2006).
Inicialmente espermatozóides do ejaculado eram utilizados e após espermatozóides do epidídimo e, finalmente, em 1993 foi demonstrado que com espermatozóides extraídos do parênquima testicular era possível à fertilização de óvulos e obtenção de gestação em pacientes com azoospermia obstrutiva e posteriormente este achado foi confirmado também em pacientes com azoospermia não-obstrutiva (Schoysman et al., 1993).
Antigamente, a biópsia testicular era usada particularmente, como meio de diagnóstico diferencial entre as azoospermias não-obstrutiva e a obstrutiva, mas passou a ter papel importante na recuperação de espermatozóides baseada no conhecimento, descrito por Levin em 1979, da presença de áreas de espermatogênese em pacientes com aplasia de células germinativas, parada de maturação e hipoespermatogênese, ou seja, existência de espermatozóides nos testículos dos pacientes azoospérmicos (Tournaye et al., 1997).
Entretanto, sabemos ainda muito pouco em quais homens com azoospermia não-obstrutiva iremos encontrar espermatozóides pelas técnicas de recuperação existentes. A literatura mundial procura buscar qual seria o melhor e mais fidedigno fator preditivo para o encontro de espermatozóides nestes pacientes. Em muitos indivíduos ocorre um quadro de espermatogênese focal e não disseminada por todo o testículo. Existem casos de espermatozóides serem encontrados em um testículo, mas não no contralateral (Turek et al., 1997).
MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi realizado no período de janeiro de 2007 a junho de 2008. Para tal, 60 pacientes com idade de 20 a 50 anos, com diagnóstico inicial de azoospermia foram avaliados. A histologia foi classificada em quatro categorias: hipoespermatogênse, Sertoli Cell-Only Syndrome, parada de maturação espermática e esclerose tubular. Os patologistas não possuíam qualquer informação quanto às características do caso ou quanto ao resultado do achado de espermatozóides no laboratório de biologia da reprodução.O critério para enquadramento funcional foi realizado via biópsia testicular. A dosagem de FSH (hormônio folículo-estimulante) foi realizada em todos os indivíduos. Todos os indivíduos participantes deste estudo realizaram duas análises seminais com intervalo médio de 15 dias. A abstinência sexual variou de 2 a 3 dias. O sêmen foi coletado em frasco de propileno de 10,0 mL (J. LAB®). Os critérios de análise seminal obedeceram ao manual de laboratório para análise de sêmen da Organização Mundial de Saúde (OMS, 1999). Os seguintes parâmetros foram analisados: coagulação, cor, tempo de liquefação, volume, viscosidade e pH.
As amostras foram submetidas à liquefação a 37°C por 30 minutos, sendo avaliados os seguintes parâmetros seminais: volume seminal, percentual de motilidade espermática e concentração total de espermatozóides móveis. O volume do ejaculado foi medido por aspiração de toda a amostra com o auxílio de uma pipeta graduada acoplada a um pipetador eletrônico. Após misturar cuidadosamente a amostra seminal por completo, com o auxílio de um aparelho misturador de amostras, as mesmas foram avaliadas manualmente pelo pesquisador. Para cada mensuração, uma alíquota liquefeita de 5 µL foi inserida em uma câmara de contagem Microcell®, descartável, com 20 µm de profundidade até seu preenchimento integral, com o auxílio de uma pipeta de pressão positiva para determinação da concentração e motilidade espermáticas. Estas foram analisadas manualmente, com o uso de um microscópio óptico equipado com uma objetiva de contraste de fase.
Dois esfregaços de cada amostra foram preparados em lâminas de microscopia para serem utilizados em técnica de coloração. Para a realização do presente estudo, utilizou-se apenas um método de coloração, o Diff-Quick® (Baxter Healthcare Corporation, Inc.). Após a lâmina ter secado ao ar ambiente, a mesma foi identificada e catalogada. Esta lâmina, então, foi imersa (1,8 mg/L de corante triarylmetano, 100% PDC [corante puro] em álcool metílico) cinco vezes, por um segundo a cada vez, com um intervalo de um segundo entre cada imersão. Após aproximadamente 15 minutos, a lâmina já estava seca, para dar início à próxima etapa da coloração, e ser imersa na solução I (1 g/L de corante xanthene 100% PDC, tampão e ácido de sódio (0,01%)) por três vezes, por um segundo a cada vez, com intervalo de um segundo. O excesso do corante foi retirado e, imediatamente, a lâmina imersa na solução II (1,25 g/L corante de tiazina, 100% PDC (0,625g/L azure A e 0,625 g/L azul de metileno)) por cinco vezes, por um segundo a cada vez, com intervalo de um segundo. A lâmina foi lavada em água deionizada para remover qualquer excesso de corante; deixou-se a lâmina corada em local apropriado para secar (suporte de lâminas).
RESULTADOS
Os resultados mostraram que em 13 (21,6%) indivíduos com diagnóstico de azoospermia não-obstrutiva foram encontrados espermatozóides no ejaculado (Tabela 1).O quadro de parada de maturação correspondeu a 46,16% dos achados, seguido da hipoespermatogênese com 23,08% e esclerose tubular e Sertoli cellonly syndrome com 15,38% cada. Não ocorreu correlação entre o achado anátomo-patológico e o número de espermatozóides encontrados no ejaculado, bem como em relação aos níveis de FSH.
Tabela 1. Achados de espermatozóides em indivíduos com diagnóstico de azoospermia não-obstrutiva (pm (parada de maturação), sc-os (Sertoli cellonly syndrome), he (hipoespermatogênese), et (esclerose tubular)).
DISCUSSÃO
Estes resultados trazem a questão de por que espermatozóides podem ser encontrados em pacientes com azoospermia nãoobstrutiva em que previamente uma biópsia testicular havia declarado ausência de espermatozóides ( aplasia germinativa, parada de maturação). Na realidade, espermatogênese focal pode ocorrer nestes indivíduos. Além disso, durante os procedimentos de fertilização in vitro se procura minuciosamente por espermatozóides, usando, algumas vezes, microscópio com campos de aumento superiores aos utilizados na avaliação histopatológica. Também se deve considerar que na biópsia testicular diagnóstica muitas vezes apenas um fragmento de testículo é retirado enquanto nos procedimentos de fertilização se retiram amostras de tecido até que espermatozóides sejam encontrados ou até que toda superfície testicular tenha sido avaliada (Silber et al., 1995; Houwen et al., 2008).
Tournaye et al., 1996 sugerem que esta diferença na fertilização ocorra porque nos pacientes com parada de maturação e com aplasia germinativa menos espermatozóides móveis são obtidos para a inseminação. No estudo de Nagy et al., 1998 a taxa de fertilização foi significativamente inferior quando foram utilizados espermatozóides imóveis para inseminação (p = 0,006).
Os procedimentos de obtenção de espermatozóides podem não apresentar sucesso, principalmente nos pacientes portadores de azoospermia não-obstrutiva ocorrendo falha em obter espermatozóides em até 50% dos casos (Mulhall et al., 1997; Ezeh et al., 1998).
Testes de rastreamento devem possuir alta sensibilidade para incluir todos os casos da doença e baixos níveis de falso-negativos, evitando a perda de casos. Autores recomendavam que o FSH fosse utilizado como marcador da presença de espermatogênese, sendo utilizado como fator de triagem.Outros autores não conseguiram identificar o FSH como um fator preditivo adequado do achado de espermatozóides. Recentes relatos procuram associar a inibina - B como um útil marcador da espermatogênese e demonstram que a produção de inibina-B somente estaria presente quando houvesse atividade espermatogênica. Outros autores revelaram que apesar da melhor sensibilidade, a inibina B não possuiria capacidade de predizer o achado de espermatozóides em casos de azoospermia nãoobstrutiva (Von Eckardstein et al., 1999; Ballescá et al., 2000).
Apesar da avaliação histológica possuir uma boa correlação com o achado de espermatozóides como demonstrado em alguns trabalhos, não possui nenhuma das outras características aventadas. Além disso, não possui valor para os pacientes em início de avaliação, que não foram submetidos a nenhum procedimento cirúrgico testicular e, portanto, não possui o resultado da avaliação histológica previamente a realização de um procedimento de obtenção de espermatozóides. Os parâmetros histológicos muitas vezes falham em predizer o resultado da biópsia, pois mesmo a ausência de espermatozóides em uma biópsia prévia não garante que múltiplas biópsias sejam capazes de obter espermatozóides. Muitas vezes, focos de espermatogênese podem estar presentes, independente e parâmetros histológicos e clínicos (Mulhall et al., 1997).
Parâmetros convencionalmente associados à espermatogênese, como o hormônio folículo estimulante (FSH) e o volume testicular, individualmente têm falhado em discriminar os pacientes que terão sucesso ou falha na recuperação espermática (Tournaye et al. 1996, 1997, Mulhall et al. 1997). Quando avaliados em conjunto por Ezeh et al. em dois trabalhos (1998, 1999) e por Seo & Ko (2001) também não se observa diferença estatística entre os dois grupos de pacientes. Hauser et al. (2002) avaliaram a correlação entre volume e consistência testicular, dosagens de FSH, LH, prolactina e testosterona com a presença de espermatozóides e não encontraram diferença estatística entre os grupos, concluindo que nenhum destes parâmetros servem como fatores preditivos.
Uma abordagem interessante da histologia testicular foi preconizada por Johnsen em 1970, o chamado escore Johnsen. Este escore pontua de 1-10 a presença ou ausência de células germinativas em cada túbulo avaliado na anatomia patológica, organizando-os por ordem de maturidade. Escore 10, 9 ou 8 - presença de espermatozóides, 7 ou 6 - presença de espermátides, 5, 4 ou 3 - presença de espermatócitos ou espermatogônia e 2 ou 1 - presença de apenas células de Sertolli. Tornou-se o método clínico mais popular de quantificação da espermatogênese. Alguns estudos demonstraram a excelente correlação entre o número de espermátides maduras por túbulo seminífero e a concentração espermática do ejaculado ( Silber e Rodriguez-Rigau 1981 ou a recuperação de espermatozóides testiculares ( Silber et al. 1996a; Silber et al., 1996b; Ezeh et al. 1998). Silber et al. (1997) demonstraram que a presença de espermátide no fragmento da biópsia prévia ao emprego da ICSI correlaciona-se com achado de espermatozóides, em 85% dos casos, e que, por outro lado, a ausência é associada a 95% de ausência de espermatozóides, quando da TESE/ICSI. Ezeh et al. (1999) demonstraram que a visualização de espermátides prediz corretamente a extração de espermatozóides em 77% e o escore de Johnsen em 71%, considerando-os como as variáveis mais objetivas na análise preditiva. Contudo, a falha em visualizar as espermátides na análise histológica não exclui a espermatogênese em outro foco testicular não retirado ou incluído no espécime histopatológico.
O padrão da histologia é o fator preditivo mais aceito e comprovado na literatura quanto à recuperação de espermatozóides testiculares nos pacientes com azoospermia não-obstrutiva. Quando o padrão histológico é comparado aos demais fatores já citados, demonstra ser superior na predição (Ezeh et al. 1998, 1999). Entre os padrões histológicos, o de melhor prognóstico é a hipoespermatogênese com 89,2% de encontro dos espermatozóides, seguido da parada de maturação com 62,5% e síndrome de células de Sertolli com 16,3% (Seo & Ko 2001). Com valores diferentes, mas demonstrando mesma tendência, Jow et al. (1993) mostraram 54% de encontro de espermatozóides na hipoespermatogênese, 33% na parada de maturação e nenhum espermatozóide encontrado nos nove pacientes com síndrome de células de Sertoli.
Em nosso estudo não se observou correlação entre o número de espermatozóides no ejaculado e o achado da histologia testicular. Isso mostra a dificuldade de se estabelecer um padrão para encontrar espermatozóides no ejaculado e mesmo na biópsia testicular em indivíduos azoospérmicos não-obstrutivos.
Marcadores teciduais são proteínas celulares que ganharam grande importância em várias áreas da ciência médica. Em infertilidade não podia ser diferente, começou-se a estudar marcadores como forma de predizer o encontro de espermatozóides nos testículos de homens com azoospermia não-obstrutiva. Dentre estes, a inibina B, foi um dos mais estudados até o momento. A inibina B é um produto direto das células de Sertolli e serve como marcador da espermatogênese, por isto acreditava-se ser um excelente fator preditivo para o encontro de espermatozóides. Entretanto, Vernaeve et al. (2002) demonstraram que este marcador falha em predizer a presença de espermatozóides nos testículos de pacientes com este tipo de azoospermia. Neste estudo, os autores demonstraram que em 50% dos pacientes onde não foram encontrados espermatozóides, o nível de inibina B, era maior do que naqueles onde foram encontrados espermatozóides.
Neste campo, foi publicado, recentemente, o resumo de um trabalho que parece uma nova perspectiva em relação à predição do encontro de espermatozóides. Fujita et al. (2005) estudaram dois marcadores chamados de stem cell factor (SCF) e glial cell line-derived neutrophic factor (GDNF). Relataram que nos pacientes que possuíam intensa expressão imunohistoquímica de SCF, com expressão negativa de GDNF, foram encontrados espermatozóides em 100% deles.
Este dado, no momento, parece ser um excelente fator preditivo para se encontrar espermatozóides nos pacientes com azoospermia não obstrutiva. Porém, há a necessidade de mais investigações para que haja confirmação. Este artigo mostra que encontrar espermatozóides em pacientes com azoospermia não obstrutiva ainda é um tema que necessita de alguns esclarecimentos, pois existem muitas controvérsias e, até o momento, não há um fator preditivo que possa ser considerado como padrão ouro.
Jaffe SB, Jewelewicz R. The basic infertility investigation. Fertil Steril 1991; 56:599-613.