JBRA Assist. Reprod. 2009;13(1):11-15
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.1.02
Estudo comparativo entre meio GV e IVFTM no cultivo de embriões
Comparative study between GV and IVF media for embryo culture
1Materbaby Reprodução Humana - Maringá - PR
2Nucleo de Reprodução Humana - Santos - SP
3Ferticlin - São Paulo - SP
4Feliccita- Reprodução Humana - Curitiba - PR
Trabalho realizado na Materbaby Reprodução Humana - Maringá - PR.
RESUMO
Objetivo: Comparar a taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, gestação e implantação na utilização de meios de cultivo GV e IVF.
Pacientes e métodos: Dos 46 ciclos iniciados, 32 tiveram ovócitos cultivados tanto em meio IVFTM quanto em meio GV com 10% de SSS (Grupo I). Os outros 14 ciclos utilizaram apenas o meio IVFTM (Grupo II). No grupo I, dos 190 ovócitos fertilizados, 96 foram colocados em IVFTM e 94 em meio GV com 10% de SSS.
Resultados: A taxa de fertilização no grupo I foi de 81%, sendo que 83% dos embriões tinham mais de 6 células e 56% destes tinham menos de 20% de fragmentação no terceiro dia pós-fertilização. No grupo II a taxa de fertilização foi de 81%, sendo que 82% dos embriões tinham mais de 6 células e 62% tinham menos de 20% de fragmentação no terceiro dia pós-fertilização. A taxa de implantação e gestação foi similar em ambos os grupos.
Conclusão: Não houve diferença estatística entre a utilização dos meios IVF ou GV no cultivo de embriões.
Palavras-chave: fertilização in-vitro, cultura, meios de cultivo
ABSTRACT
Objective: The aim of this paper was to compare fertilization, embryo development, pregnancy and implantation rates when embryo culture with GV or IVF media is used.
Patients and methods: From 46 initiated cycles, 32 had oocytes cultured either with IVFTM or GV medium with SSS 10% (Group I). The other 14 cycles were cultured with IVFTM medium (Group II). In Group I, 190 oocytes were obtained, among which 96 were cultured in IVFTM and 94 in GV medium with SSS 10%. In Group II, 56 oocytes obtained that were culture in IVFTM medium.
Results: Among 190 oocytes from Group I, 154 developed into embryos (81%), and in Group II, from 56 oocytes, 45 developed into embryos (80%). In Group I 128 embryos (83%) had more than 6 cells on day three after fertilization, and 86 embryos (56%) had less than 20% of fragmentation. In Group II, 37 embryos (82%) had more than 6 cells on day three after fertilization and 28 embryos (62%) had less than 20% of fragmentation. The pregnancy and implantation rates were similar for both groups.
Conclusion: There were no statistically significant differences in the use of IVF or GV media for embryo culture.
Keywords: In vitro-fertilization, culture, culture media
INTRODUÇÃO
A insatisfação dos serviços de Reprodução Humana com relação às taxas de gestação obtidas tem mantido pesquisas entre as várias etapas da fertilização in-vitro. Os meios de cultivos têm sido avaliados e modificados exaustivamente com o intuito de melhorar estas taxas. Nos primórdios deste tipo de tratamento o interesse inicial foi identificar as substâncias na composição dos meios que pudessem ter algum efeito deletério (Nagata et al. 1993; Bastias et al. 1993) e, ao mesmo tempo avaliar possíveis componentes que poderiam melhorar o cultivo (Adler et al. 1993; Pool and Martin 1994). A manutenção dos embriões em laboratório que a princípio era de dois dias tem sido estendida para três e até cinco dias na tentativa de que os meios pudessem ajudar a selecionar os melhores embriões e melhorar o sincronismo com o endométrio (Tucker et al. 1996; Desai et al. 1996; Yeung et al. 1992). A fonte protéica que era obtida de soro de cordão umbilical, passou a ser obtida do soro de sangue periférico da mãe, depois optou-se pelo uso do soro sintético e atualmente, pela soro albumina humana (Hargreaves et al. 1995; Weathersbee et al. 1995; Yeung et al. 1992; Zhang et al. 2007; Check et al. 1995; Jee et al. 2008; Check et al. 1995). A mensuração de substâncias produzidas pelo embrião tem sido utilizada também com intuito de entender melhor as necessidades metabólicas destes (Check et al. 1995; Best et al. 1994; Yeung et al. 1992; Vergouw et al. 2008; Check et al. 1995). O cultivo dos embriões com outro tipo celular tem sido aplicado por vários centros na busca de melhoria nas condições de cultura (Johnson et al. 2007; Koivisto et al. 2004; Spandorfer et al. 2004; Fabbri et al. 2000; Check et al. 1995). Entretanto, a avaliação comparativa entre os vários meios (Lane and Gardner 2007; Aoki et al. 2005; Oatway et al. 2004; Gardner 2000; Ben Yosef et al. 2001; Van Langendonckt et al. 2001; Schoolcraft and Gardner 2001; Check et al. 1995) não tem levado à consenso quanto à melhor formulação. Apesar de todas as modificações nenhum meio de cultivo tem oferecido taxas de gestação significantemente diferentes. No entanto, há consenso de que as condições de armazenagem, transporte e ambiente de cultivo são essenciais para termos bons resultados. (Lane et al. 2008; Lane and Gardner 2007; Gardner et al. 2005; Aoki et al. 2005; Mikkelsen 2005; Gardner 2000; Van Langendonckt et al. 2001; Check et al. 1995). O objetivo deste trabalho é comparar os resultados obtidos no cultivo de embriões com meio desenvolvido no Brasil e meio importado já consagrado no mercado.
MATERIAIS E MÉTODO
Pacientes
Este estudo envolveu pacientes com idade entre 25 a 41 anos, durante o período de abril a setembro de 2008, que procuraram o serviço de reprodução assistida da Materbaby-Reprodução Humana, e após avaliação tiveram indicação de tratamento com fertilização in-vitro. As pacientes que concordaram em participar do estudo receberam consentimento esclarecido e informado, e foram randomizadas em dois grupos: aquelas que tiveram metade de seus embriões cultivados em meio GV (Ingamed, Maringá, Brasil), e a outra metade no meio IVFTM (Vitrolife, Kungsbacka, Sweden), escolhidos aleatoriamente - Grupo I, e aquelas cujos embriões foram cultivados somente no meio IVFTM - Grupo II.A hiperestimulação ovariana das pacientes foi iniciada com o bloqueio hipofisário com acetato de leuprolide (Lupron; TAP Pharmaceutical, Abbot Laboratories, Chicago, U.S.A.), como agonista de GnRH (0,15 ml/ dia), iniciado entre o vigésimo primeiro ao vigésimo terceiro dia do ciclo menstrual até o início da mestruação seguinte. No segundo dia da menstruação o acetato de leuprolide era reduzido para 0,05 ml/dia, e iniciava-se o FSH recombinante (Gonal®, Serono) em dose que variou de 150 a 300UI/dia, a critério clínico, por no mínimo sete dias. O crescimento folicular foi monitorado pelo ultrasom endovaginal e gonadotrofina coriônica humana (HCG; 10.000 IU; Choriomon; Meizler-São Paulo) foi administrada quando pelo menos três folículos com pelo menos 20 mm de diâmetro foram observados.
Fertilização in-vitro e cultivo embrionário
Os ovócitos foram aspirados 34-36 horas após a injeção de HCG usando punção ovariana transvaginal guiada por ultra-som. Os ovócitos colhidos foram lavados em D-PBS (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, U.S.A.) e transferidos para placas contendo meio de cultura destinados a cada grupo e mantidos em incubadora (Forma modelo 3159) a 37°C, com atmosfera contendo 5,5% de CO2 e umidade de 97%.O sêmen foi preparado através de gradiente descontínuo “SpermGradTM” (55 / 90%; Vitrolife, Kungsbacka, Sweden). Nos casos de infertilidade por fator masculino os ovócitos foram submetidos à injeção intra-citoplasmática de espermatozóides (ICSI). Tal procedimento foi realizado 3 a 6 horas após a coleta dos ovócitos, quando estes eram desnudados com o auxílio de hialuronidase (Irvine Scientific, USA). Nos casos onde os parâmetros do sêmen eram considerados normais, de acordo com a Organização Mundial de Saúde, foi realizada a inseminação dos ovócitos com 100.000 espermatozóides/ml.Foi utilizado microscópio invertido Diaphot 300 (Nikon, Japan) para ICSI, com contraste de fase Hoffman, sob aumento de 400X. O microscópio foi equipado com micromanipuladores hidráulicos MMO-204D e injetores IM6 (Narishige, Tokyo, Japan). O procedimento iniciava-se com a identificação, imobilização e aspiração de um único espermatozóide de uma gota de polivinilpirrolidona a 10% (Irvine Scientific, U.S.A.). O espermatozóide era, então, injetado no oócito, mantido preso por uma pipeta de sustentação.No grupo I, depois da micro-manipulação os oócitos injetados foram colocados em gotas de 50 µl de meio de cultivo sob óleo mineral. A metade dos oócitos injetados foi colocada em meio IVFTM e a outra metade em meio GV com 10% de soro sintético (SSS, Irvine Scientific, U.S.A.). Quando havia número ímpar de oócitos injetados, o meio IVFTM ficava com um oócito a mais. A escolha dos pré-embriões colocados em cada meio foi aleatória, resultando em número diferente de embriões em cada meio após observação da fertilização com 24 horas. No grupo II, as pacientes tiveram todos os oócitos colocados em meio IVFTM.Quando se optou pela inseminação dos oócitos, no grupo I, tal procedimento foi realizado em metade dos oócitos no meio IVFTM e metade no meio GV aleatoriamente. Quando havia número ímpar de oócitos, o meio IVFTM ficava com um oócito a mais. Após 18 a 22 horas, quando a fertilização era verificada, os embriões em pró-núcleo foram transferidos para os mesmos meios frescos em micro-gota. Nas pacientes do grupo II, a fertilização de todos os oócitos foi realizada em meio IVFTM e os pré-embriões transferidos para o mesmo meio fresco quando era checada a fertilização.Em todos os ciclos onde mais que seis oócitos foram obtidos, apenas seis foram fertilizados, sendo o restante criopreservado pelo método de vitrificação (Kuwayama, 2005).A fase lútea foi suplementada com 50 mg/dia de progesterona injetável, iniciando no dia da captação oocitária. A dosagem do β-hCG (gonadotrofina coriônica subunidade beta) foi realizada no 14º dia após a transferência dos embriões. A taxa de implantação foi definida somente após batimento cardíaco presentes após a 13° semana pós-transferência.A significância estatística foi estimada usando o teste do χ2. Adotou-se o nível de significância de 0,05% (α = 5%). Níveis descritivos (P) inferiores a esse valor foram considerados significantes.
RESULTADOS
Dos 46 ciclos iniciados, 32 tiveram ovócitos cultivados tanto em meio IVFTM quanto em meio GV com 10% de SSS (Grupo I). Os outros 14 ciclos utilizaram apenas o meio IVFTM na fertilização in-vitro (Grupo II). Os resultados de taxas de fertilização, clivagem, qualidade embrionária, implantação e gravidez clínica encontram-se na Tabela I, não tendo sido encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os 2 grupos, em nenhuma das variáveis avaliadas. Dos 190 ovócitos fertilizados no grupo I, 154 apresentavam 2 pró-núcleos 18 a 22 hs após a fertilização (81% de fertilização) e no grupo II dos 56 ovócitos fertilizados, 45 tinham 2 pró-núcleos (80% de fertilização). No grupo I foram cultivados 154 embriões, destes 128 tinham 6 ou mais células (83%) e 86 tinham 20% ou menos de fragmentação (56%). No grupo II foram cultivados 45 embriões, sendo que 37 tinham 6 ou mais células (82%) e 28 tinham 20% ou menos de fragmentação (62%). O número médio de células dos embriões no dia 3 de desenvolvimento do grupo I foi 6,95 e no grupo II 6,71. Dos 32 ciclos iniciados no grupo I, 16 engravidaram (50%). Destas 16, 1 abortou (6,2%). Dos 130 embriões transferidos, 21 implantaram (16% de implantação), e no grupo II dos 40 embriões transferidos, 10 implantaram (24%) de implantação.
Tabela I.
No grupo I, dos 190 oócitos fertilizados, 96 foram colocados em IVFTM e 94 em meio GV com 10% de SSS. Dos 96 ovócitos colocados em IVFTM para fertilização, 83 tinham pró-núcleo 18 a 22 hs após (86% de fertilização) e do 94 colocados em GV, em 71 foi observado 2 pró-núcleos (76% de fertilização). Apesar de não significante, a comparação entre os meios quanto à fertilização mostrou resultado marginalmente significante (p = 0,0055), indicando uma tendência de a taxa de fertilização do meio IVF ser maior do que a do meio GV. Os embriões também foram avaliados quanto ao número de células e fragmentação, não sendo evidenciada diferença estatisticamente significante na qualidade embrionária (tabela II). No meio IVFTM foram cultivados 83 embriões, destes 70 tinham 6 ou mais células (84%) e 46 tinham 20% ou menos de fragmentação (55%). Dos 71 embriões cultivados em GV, 58 tinham 6 ou mais células (82%) e 40 tinham 20% ou menos de fragmentação (56%). O número médio de células dos embriões no dia 3 de desenvolvimento do IVFTM foi 7,05 e no GV 6,83.
Tabela II.
DISCUSSÃO
Há poucas publicações recentes comparando os diferentes tipos de meios de cultivo embrionário disponíveis, e ainda não há consenso quanto às melhores condições de cultura quanto aos nutrientes para o embrião. Este estudo comparou os resultados da utilização de 2 meios de cultivo até o dia 3 de desenvolvimento embrionário, pois, apesar de a transferência em estágio de blastocisto ainda ser uma boa alternativa para selecionar o melhor embrião a ser transferido, hoje já não é uma boa alternativa para diminuir o número de embriões a serem transferidos. Com os avanços nas técnicas de criopreservação, atualmente é uma boa opção a vitrificação de ovócitos, pois evita os problemas éticos relacionados ao congelamento de embriões, além de diminuir o número de embriões a serem transferidos.
O embrião, após o terceiro dia de desenvolvimento, já no período pós-compactação aumenta as taxas de biossíntese, assim como a capacidade respiratória. Durante a compactação ocorre a formação do primeiro epitélio de transporte do concepto, quando o embrião é capaz de controlar o gradiente iônico ativamente e regular seu meio interno. Assim, como o metabolismo torna-se mais complexo a partir desse estágio, supõe-se que também as exigências em termos de nutrientes o sejam. Muito se tem estudado em relação às exigências metabólicas dos embriões após esse período, mas, infelizmente os meios de cultura disponíveis até o momento para tal finalidade, conseguem que menos da metade dos embriões acabem chegando ao estágio de blastocisto, inclusive em muitos casos a paciente não tem nenhum embrião a ser transferido nesse estágio. (Gardner and Lane 2005)
Uma das mais polêmicas discussões com relação aos meios de cultura até o momento é quanto à concentração de glicose e, ao tipo de suplementação protéica, com albumina ou soro sintético. Foi utilizado nesse estudo o meio GV com soro sintético e altas taxas de glicose (5,5 mM), enquanto o meio IVFTM tem soro albumina humana (HSA) e baixa taxa de glicose em sua composição. Não observamos diferenças na qualidade embrionária, entre os dois meios, nem na taxa de gravidez ou implantação. O efeito deletério da glicose não foi observado, já que as taxas de gravidez e implantação não foram diferentes entre os grupos.
Houve uma menor taxa de fertilização, porém não significante, quando se usou o meio GV. Nos casos de FIV com IVFTM a taxa de fertilização foi 82% e nos casos com GV a taxa foi 74%. Isso leva a acreditar que a diminuição da glicose no meio não afeta a fertilização, mesmo através da inseminação, pois houve menor fertilização no meio com alta concentração de glicose (GV).
Na década passada vários autores concluíram que o uso de soro sintético era mais eficiente que o uso de albumina em promover o desenvolvimento embrionário e implantação (Hargreaves et al. 1995; Weathersbee et al. 1995), entretanto, poucos estudos recentes comparando a utilização de HSA ou soro sintético no cultivo de embriões in-vitro tem sido relatados. Gómez; Diez (2000), concluíram que o efeito da glicose sobre o desenvolvimento in-vitro, depende da fonte de proteína. Não houve diferença entre o uso dos dois suplementos, mas nenhuma conclusão pode-se ter, devido ao fato de terem sido usados em meio diferentes. Mais estudos serão necessários, trocando o suplemento dos dois meios.
Em conclusão, não foi observado diferença entre os dois meios de cultivo embrionário em estudo, porém, o fato de termos um meio fabricado no Brasil, deve ser levado em consideração quando pensamos na facilidade de se adquirir e armazenar o produto. É necessário que outros estudos sejam realizados, principalmente para verificar a possibilidade de haver maior estabilidade nos resultados, já que os problemas inerentes á importação não existirão.
Referências bibliográficas:
Adler A, Reing AM, Bedford JM, Alikani M, Cohen J (1993) Plasmanate as a medium supplement for in vitro fertilization. J.Assist.Reprod.Genet.10, 67-71.
Gardner DK (2000) Blastocyst culture: toward single embryo transfers. Hum.Fertil.(Camb.)3, 229-237.