JBRA Assist. Reprod. 2009;13(1):16-20
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.1.03
Comparação de resultados obtidos com uma nova técnica de vitrificação de blastocistos e com o congelamento lento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo
Comparing the results obtained with a new blastocysts vitrification technique and with slow freezing of day 2 and day 3 embryos
Clínica Pró-Criar / Mater Dei - Belo Horizonte, Brasil
Estudo realizado na Clínica Pró-Criar / Mater Dei (www.pro-criar.com.br)Estudo apresentado no 33º Congresso Mineiro de Ginecologia e Obstetrícia / 14º Congresso de Ginecologia e Obstetrícia da Região Sudeste da FEBRASGO. Juiz de Fora, MG - 3 a 5 de setembro de 2008
RESUMO
Objetivo: comparar os resultados obtidos através de uma nova técnica de vitrificação de blastocistos com utilização de palhetas convencionais aos resultados obtidos com o congelamento lento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo.
Métodos: cinqüenta e dois ciclos de vitrificação e desvitrificação de blastocistos, os quais resultaram em 43 transferências (grupo 1), e 60 ciclos de congelamento lento e descongelamento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo, os quais resultaram em 51 transferências (grupo 2), foram realizados na Clínica Pró-Criar / Mater Dei no período de janeiro de 2005 a dezembro de 2007. As 94 transferências resultantes de blastocistos vitrificados ou de embriões congelados foram analisadas retrospectivamente.
Resultados: as taxas de implantação e gravidez foram significativamente superiores no grupo 1 (34,7% e 48,8%) em relação ao grupo 2 (10,7% e 17,6%). Não houve diferença estatisticamente significativa com relação às taxas de implantação e gravidez de blastocistos vitrificados no quinto ou sexto dia de cultivo. Também não houve diferença entre as taxas de implantação e gravidez de embriões congelados no segundo ou terceiro dia de desenvolvimento.
Conclusão: esta nova técnica de vitrificação de blastocistos descrita no presente estudo apresentou bons resultados de sobrevida, implantação e gestação quando comparada à técnica de congelamento lento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo. Estudos prospectivos se fazem necessários para se confirmar a superioridade dessa nova técnica.
Palavras-chave: vitrificação, blastocisto, fertilização in vitro, criopreservação, congelamento lento.
ABSTRACT
Objective: compare the results of a new blastocysts vitrification technique using conventional straws with the results of day 2 and day 3 embryos slow freezing.
Methods: fifty-two cycles of blastocysts vitrification and warming, which resulted in 43 transfers (group 1), and 60 cycles of day 2 and day 3 embryos slow freezing and thawing, which resulted in 51 transfers (group 2), were done at Pró-Criar / Mater Dei Clinic in the period of January 2005 to December 2007. These 94 transfers of vitrified blastocysts or frozen embryos had been analyzed retrospectively.
Results: the implantation and pregnancy rates were significantly higher in group 1 (34.7% and 48.8%) compared to group 2 (10.7% and 17.6%). There was no statistically significant difference of pregnancy and implantation rates between blastocysts vitrified in the fifth or sixth day. Also there was no difference of pregnancy and implantation rates between frozen embryos in the second or third day of development.
Conclusion: this new blastocysts vitrification technique decribed in this study showed good results of survive, implantation and pregnancy compared to the technique of slow freezing of embryos in the second and third days of culture. Prospective studies are needed to confirm the superiority of this new technique.
Keywords: vitrification, blastocyst, in vitro fertilization, cryopreservation, slow freezing
INTRODUÇÃO
O congelamento de embriões é um procedimento amplamente utilizado por clínicas de reprodução assistida em todo o mundo. A principal indicação consiste no armazenamento dos embriões excedentes obtidos através de um ciclo de fertilização in vitro (FIV) que não foram transferidos, possibilitando uma nova tentativa de gravidez. Por outro lado, o congelamento de todos os embriões produzidos em um ciclo de FIV estaria indicado quando a paciente desenvolve a síndrome de hiperestímulo ovariano (SHO) ou nos casos de risco de perda da função reprodutiva como, por exemplo, antes de um tratamento quimioterápico.
Entretanto, apesar de ser utilizado há mais de duas décadas (Trounson & Mohr, 1983), o congelamento de embriões ainda não apresenta os mesmos resultados obtidos com a transferência de embriões a fresco. O principal problema se refere à formação de cristais de gelo intracelulares, os quais podem levar ao rompimento de blastômeros e comprometimento da viabilidade embrionária.
A técnica mais utilizada é a de congelamento lento, mas estudos recentes vêm demonstrando bons resultados obtidos através da vitrificação de embriões, particularmente em estágio de blastocisto (Choi et al., 2000; Yokota et al., 2001; Reed et al., 2002; Mukaida et al., 2003; Son et al., 2003; Hiraoka et al., 2004; Takahashi et al., 2005; Liebermann & Tucker, 2006). A técnica de vitrificação é bem mais simples e rápida em comparação ao congelamento lento, pois os embriões são imersos diretamente no nitrogênio líqüido após curto período de exposição aos crioprotetores. Nesse caso, são utilizadas concentrações mais altas de crioprotetores, com intuito de evitar a formação de cristais de gelo intracelulares.
Entretanto, blastocistos humanos apresentam baixa permeabilidade aos crioprotetores e à água (Mukaida et al., 2003), fato que aumenta a incidência de injúrias decorrentes do processo de vitrificação. Uma forma de prevenir essas injúrias é através do aumento das velocidades de resfriamento e aquecimento, alcançado com a redução do volume da solução crioprotetora (Mukaida et al., 2003). Por isso, atualmente a grande maioria dos estudos reportados na literatura utiliza “cryoloops” (Reed et al., 2002; Mukaida et al., 2003; Takahashi et al., 2005) ou “cryotops” (Hiraoka et al., 2004; Liebermann & Tucker, 2006) para realização da vitrificação de blastocistos, pois esses sistemas permitem a utilização de volume bastante reduzido da solução crioprotetora.
Por outro lado, palhetas convencionais também podem ser empregadas na técnica de vitrificação de blastocistos, mas os resultados obtidos são inconsistentes. Yokota et al. (2001) relataram bons resultados com a utilização de palhetas de 0,25mL, enquanto outros autores relataram resultados inferiores (Vanderzwalmen et al., 2002). O objetivo do presente estudo é comparar os resultados obtidos através de uma nova técnica de vitrificação de blastocistos com utilização de palhetas convencionais aos resultados obtidos com o congelamento lento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo.
PACIENTES E MÉTODOS
O estudo foi realizado na Clínica Pró-Criar / Mater Dei, em Belo Horizonte (MG), entre janeiro de 2005 e dezembro de 2007. Todas as pacientes foram submetidas à estimulação ovariana com gonadotrofina menopáusica humana (hMG - Merional®, Meizler), após bloqueio hipofisário com agonista do GnRH. A coleta oocitária foi realizada por via vaginal, 34 a 36 horas após a administração de gonadotrofina coriônica (hCG - Choriomon®, Meizler). O cultivo embrionário foi realizado em microgotas de meio Global (LifeGlobal) suplementado com albumina sérica humana (HSA, Irvine), na concentração de 5mg/mL, a 37ºC e 5,5% de CO2.
Os embriões viáveis não transferidos foram vitrificados em estágio de blastocisto, no quinto ou sexto dia de cultivo, ou criopreservados no segundo ou terceiro dia de cultivo, utilizando protocolo lento. A técnica de vitrificação de blastocistos começou a ser utilizada em abril de 2006 e, a partir de agosto de 2007, optou-se exclusivamente por essa técnica. Apenas blastocistos expandidos (blastocele representando mais de 50% do volume total) foram selecionados para vitrificação. Embriões apresentando multinucleação, parada de clivagem ou mais de 50% de fragmentação não foram criopreservados.
Durante o período do estudo, foram realizados 52 ciclos de vitrificação e desvitrificação de blastocistos, os quais resultaram em 43 transferências (grupo 1), e 60 ciclos de congelamento e descongelamento de embriões, os quais resultaram em 51 transferências (grupo 2). As 94 transferências de embriões vitrificados ou congelados foram analisadas retrospectivamente.
O processo de vitrificação de blastocistos foi realizado à temperatura ambiente, utilizando soluções denominadas V1, V2 e V3 contendo etilenoglicol e glicerol como crioprotetores, conforme protocolo descrito por Stachecki e colaboradores (2008). Os blastocistos foram vitrificados utilizando-se a solução V3, em palhetas de 0,25 mL, a qual era selada dos dois lados. Para realização do processo de desvitrificação dos blastocistos, as palhetas foram expostas à temperatura ambiente por 5 segundos e a 20ºC por mais 10 segundos. Após essa etapa, procedeu-se a remoção dos crioprotetores, conforme protocolo descrito por Stachecki e colaboradores (2008), e incubação dos embriões em meio Global a 37ºC por 0-4 horas até o momento da transferência. A sobrevivência dos blastocistos foi avaliada pela integridade da massa celular interna (ICM), do trofoectoderma e pela reexpansão da blastocele.
No protocolo de congelamento e descongelamento lento, foram utilizados propanodiol (PROH) e sacarose como crioprotetores. O processo também foi realizado à temperatura ambiente, iniciado com a transferência dos embriões para solução base contendo PBS e soro sintético substitutivo (SSS, Irvine). Posteriormente, os embriões foram transferidos para solução contendo 1,5M de PROH, na qual permaneceram por 10 minutos. O processo de congelamento lento foi realizado em solução contendo 0,1M de sacarose e 1,5M de PROH, utilizandose palhetas de 0,25mL. Para realização desse processo, foi utilizado o equipamento Freeze Control (Cryologic). A curva de temperatura iniciou-se a 20ºC, com queda de 2ºC por minuto até -7ºC, quando foi realizado o seeding. A temperatura de -7ºC se manteve por 10 minutos e, posteriormente, baixou 0,3ºC por minuto até -35ºC e 2ºC por minuto até -43ºC, quando então as palhetas foram submersas em nitrogênio líqüido. Para o descongelamento dos embriões, as palhetas foram expostas à temperatura ambiente por 40 segundos e submersas em água a 30ºC por mais 40 segundos. Imediatamente, os embriões foram transferidos sucessivamente para soluções contendo 0,2M de sacarose e 1,0M de PROH, 0,2M de sacarose e 0,5M de PROH e 0,2M de sucrose, permanecendo 5 minutos em cada uma das soluções, à temperatura ambiente. Depois, os embriões foram transferidos para meio contendo PBS e SSS e mantidos por 5 minutos em placa aquecida a 37ºC, quando então foram colocados na placa de cultivo contendo meio Global até o momento da transferência para a paciente. Somente embriões com pelo menos 50% dos blastômeros intactos após descongelamento foram selecionados para transferência.
O preparo endometrial para transferência foi realizado através da administração oral de 6mg de estradiol micronizado (Estrofem®, Medley), a partir do primeiro dia da menstruação. A espessura e a morfologia endometriais foram avaliadas após um período de pelo menos 12 dias de administração do estradiol micronizado, sendo considerada adequada espessura endometrial acima de 7mm. A progesterona micronizada (Evocanil®, Zodiac; ou Utrogestan®, Farmoquímica) foi administrada por via vaginal, na dose de 900mg por dia. A transferência embrionária foi realizada no sexto dia de progesterona nos casos de blastocistos vitrificados. Embriões congelados no segundo ou terceiro dia de desenvolvimento foram transferidos no terceiro ou quarto dia de administração de progesterona, respectivamente. Todas as transferências embrionárias foram realizadas sob monitorização ultrassonográfica, utilizando-se cateter de Sydney (Cook). A gestação clínica foi diagnosticada através da presença de embrião com batimento cardíaco ao ultra-som.
A análise estatística foi realizada através do teste t Student para comparação entre médias e do teste exato de Fisher corrigido por Yates para comparação entre freqüências, utilizando-se o programa GraphPad InStat. Foi considerado como significante um P<0,05.
RESULTADOS
Cento e trinta e um blastocistos vitrificados foram submetidos ao processo de desvitrificação e 76 sobreviveram (58,0%). Trezentos e oitenta embriões congelados no segundo e terceiro dias de cultivo foram descongelados e 182 sobreviveram (47,9%). Embora a taxa de sobrevivência de blastocistos vitrificados tenha sido superior à taxa de sobrevivência de embriões congelados no segundo e terceiro dias de cultivo, não houve diferença estatisticamente significativa (P = 0,054).
No grupo 1, foram realizadas 27 transferências de blastocistos vitrificados no quinto dia de cultivo e 16 transferências de blastocistos vitrificados no sexto dia de cultivo e não se observou diferença nas taxas de implantação e gravidez clínica (Tabela 1).
Tabela 1. Resultados obtidos com a transferência de blastocistos vitrificados no quinto ou sexto dia de cultivo (grupo 1)
No grupo 2, foram realizadas 19 transferências de embriões congelados no segundo dia de cultivo e 32 transferências de embriões congelados no terceiro dia de cultivo, não havendo diferença nas taxas de implantação e gravidez clínica (Tabela 2).
Tabela 2. Resultados obtidos com a transferência de embriões congelados no segundo ou terceiro dia de cultivo (grupo 2)
Comparando-se os resultados obtidos através da transferência de blastocistos vitrificados (grupo 1) aos resultados obtidos com a transferência de embriões congelados no segundo e terceiro dias de cultivo (grupo 2), observou-se taxas de implantação e gravidez clínica significativamente superiores no grupo 1 em relação ao grupo 2 (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Taxas de implantação de acordo com o dia do congelamento / vitrificação
Figura 2. Taxas de gravidez clínica de acordo com o dia do congelamento / vitrificação
DISCUSSÃO
A vitrificação de blastocistos traz algumas vantagens em relação ao congelamento lento de embriões em estágios mais precoces de desenvolvimento. Além do processo de vitrificação ser bem mais rápido em comparação ao congelamento lento, demandando menor disponibilidade de tempo pelo embriologista, também não há necessidade de utilizar nenhum tipo de equipamento para o processo de criopreservação, mas somente um termômetro que registre a temperatura à qual os embriões estão submetidos durante a etapa de exposição ao vapor de nitrogênio. Outra vantagem é o menor número de embriões criopreservados, pois muitos embriões considerados viáveis para congelamento no segundo e terceiro dias de desenvolvimento interrompem o processo de clivagem e não atingem o estágio de blastocisto. Além disso, a opção pela transferência de embriões em estágio de blastocisto permite a redução do número de embriões transferidos e contribui para redução da taxa de gemelaridade.
A utilização de palhetas convencionais no processo de vitrificação facilita a execução da técnica, pois não há necessidade de utilizar volume muito reduzido da solução crioprotetora, tal como ocorre com a utilização de “cryoloops” ou “cryotops”. Outra vantagem da utilização de palhetas convencionais é a facilidade de selamento, evitando-se assim o emprego de sistemas abertos, com risco de contaminação de amostras.
No presente estudo, a taxa de sobrevivência após desvitrificação de blastocistos foi de 58,0%, inferior às taxas obtidas com utilização de “cryoloops” (Reed et al., 2002; Mukaida et al., 2003; Takahashi et al., 2005) ou “cryotops” (Hiraoka et al., 2004; Liebermann & Tucker, 2006). Entretanto, se os resultados obtidos nos primeiros ciclos não tivessem sido incluídos, a taxa de sobrevivência teria sido maior. No início do estudo, houve alguns problemas técnicos causados pela utilização de uma palheta que não apresentava resistência suficiente para suportar o processo de vitrificação. Em alguns casos observamos o rompimento do lacre da palheta durante a desvitrificação, fato que prejudicou a sobrevivência dos blastocistos. Esse problema foi totalmente solucionado após troca da marca da palheta.
As taxas de implantação e gravidez de blastocistos vitrificados no quinto ou sexto dia foram similares, fato também observado em outros estudos (Mukaida et al, 2003; Hiraoka et al., 2004). Entretanto, Liebermann & Tucker (2006) relataram taxas superiores de implantação e gravidez com embriões vitrificados no quinto dia em comparação às taxas obtidas com blastocistos vitrificados no sexto dia.
Apesar dos resultados obtidos com transferência a fresco de blastocistos no quinto dia se mostrarem superiores em relação à transferência a fresco de blastocistos no sexto dia de cultivo (Shapiro et al., 2001), a vitrificação de blastocistos no sexto dia de cultivo se mostra também bastante eficaz e demonstra a boa qualidade desses embriões. Uma explicação para esse fato seria a melhor sincronização entre o desenvolvimento embrionário e o endométrio, obtida através do esquema utilizado no preparo endometrial para recepção de embriões criopreservados (Liebermann & Tucker, 2006; Shapiro et al., 2008). Em um ciclo de FIV, o endométrio tende a estar histologicamente avançado em relação ao desenvolvimento embrionário, fato que se acentua quando há formação da blastocele apenas no sexto dia de cultivo. Entretanto, utilizando-se o mesmo número de dias de administração de progesterona antes da transferência de blastocistos vitrificados no quinto e sexto dias, possibilita-se melhor sincronização entre blastocistos com desenvolvimento mais atrasado e o endométrio.
Estudos que também utilizaram palhetas convencionais no processo de vitrificação de blastocistos relataram taxas inferiores de implantação e gravidez (Yokota et al., 2001; Vanderzwalmen et al., 2002), embora o protocolo de vitrificação utilizado em nosso estudo seja diferente dos protocolos reportados na literatura. No presente estudo, as taxas de implantação (34,7%) e gravidez clínica (48,8%) obtidas no grupo de vitrificação de blastocistos foram bastante satisfatórias, similares às obtidas com utilização de “cryotops” (Hiraoka et al., 2004; Liebermann & Tucker, 2006) e superiores às obtidas com utilização de “cryoloops” (Reed et al., 2002; Mukaida et al., 2003; Takahashi et al., 2005).
Alguns estudos reportaram maiores taxas de sobrevivência quando embriões são vitrificados em estágio de mórula ou de blastocisto inicial (Vanderzwalmen et al., 2002; Mukaida et al., 2003). A explicação para esse fato seria a baixa permeabilidade da membrana aos crioprotetores, os quais não atingiriam concentração satisfatória no fluido da blastocele (Vanderzwalmen et al., 2002). Alguns autores recomendam inclusive o esvaziamento da blastocele antes do processo de vitrificação, com intuito de evitar a formação de cristais de gelo e melhorar a taxa de sobrevivência (Vanderzwalmen et al., 2002; Son et al., 2003; Hiraoka et al., 2004). Ao contrário, a técnica descrita no presente estudo se mostra eficaz para vitrificação de blastocistos expandidos (blastocele representando mais de 50% do volume total), pois a utilização de sacarose em alta concentração possibilita a desidratação da blastocele. Isso representa uma grande vantagem, pois blastocistos mais expandidos geralmente correspondem aos de melhor qualidade.
Uma crítica ao presente estudo seria o fato do mesmo ser retrospectivo e comparar taxas obtidas em períodos diferentes (congelamento lento de 2005 a 2007 e vitrificação de blastocistos em 2006 e 2007). Entretanto, as taxas de implantação e gravidez clínica obtidas com a transferência de embriões a fresco durante os anos de 2005 a 2007 se mantiveram constantes (dados não reportados).
Outro ponto a ser considerado é de que muitos embriões criopreservados no segundo e terceiro dias de cultivo não se desenvolveriam até o estágio de blastocisto e, por isso, o potencial de implantação dos embriões criopreservados em estágio de blastocisto é superior ao dos embriões criopreservados em estágios mais precoces de desenvolvimento. Portanto, várias pacientes que tiveram embriões criopreservados após 2 a 3 dias de cultivo não teriam embriões para criopreservação se os mesmos tivessem sido cultivados até o estágio de blastocisto. Entretanto, procuramos analisar nesse estudo exclusivamente a eficácia da técnica, ou seja, as taxas de sobrevivência, implantação e gravidez. As maiores taxas de implantação e gravidez clínica foram observadas com a técnica de vitrificação de blastocistos, provavelmente devido à maior seleção embrionária, mas também a uma técnica de congelamento adequada a estes embriões, levando finalmente à melhor eficácia em comparação à técnica de congelamento lento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo.
O desenvolvimento de técnicas mais eficazes de criopreservação pode ampliar as indicações atualmente existentes. Em ciclos de fertilização assistida, grande parte das falhas de implantação pode ser atribuída ao endométrio, o qual tende estar avançado histologicamente em relação ao desenvolvimento do embrião devido aos altos níveis hormonais alcançados em um ciclo induzido. Uma forma de melhorar a sincronização entre a histologia do endométrio e o desenvolvimento do embrião seria criopreservar todos os embriões produzidos em um ciclo de FIV e transferi-los posteriormente após preparo endometrial adequado. Outra vantagem desse tipo de conduta seria a possibilidade de transferir os embriões um a um, evitando-se assim a ocorrência de gestações gemelares e de suas complicações.
A técnica de vitrificação de blastocistos descrita no presente estudo apresentou bons resultados de sobrevida, implantação e gestação quando comparada à técnica de congelamento lento de embriões no segundo e terceiro dias de cultivo. Entretanto, estudos prospectivos, preferencialmente comparando embriões no mesmo estágio de desenvolvimento, se fazem necessários para se confirmar a superioridade dessa nova técnica de vitrificação em relação ao congelamento lento de embriões.
Referências Bibliográficas:
Choi DH, Chung HM, Lim JM, Ko JJ, Yoon TK, Cha KY. Pregnancy and delivery of healthy infants developed from vitrified blastocysts in an IVF-ET program. Fertil Steril. 2000;74:838-9.