JBRA Assist. Reprod. 2009;13(1):21-24
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.1.04
Relação entre dia de transferência e qualidade embrionária com taxas de gravidez
Correlation of transferency day and embryos quality with pregnancy rate
IGraduanda em Bacharelado em Ciências biológicas - UFPI; Teresina (PI) - Brasil
IIBióloga, Embriologista- Criar- Clínica de Reprodução Humana - Teresina (PI) - Brasil
IIIBióloga, Embriologista- Criar- Clínica de Reprodução Humana - Teresina (PI) - Brasil
IVGraduando em Biomedicina - Faculdade NOVAFAPI; Graduando em Bacharelado em Ciências Biológicas - UFPI; Teresina (PI) - Brasil
VMédico Criar - Clínica de Reprodução Humana, Teresina, Piauí - Fortaleza (CE)
Criar - Reprodução Assistida. Rua Anfrísio Lobão, 2039, Jóquei Clube - Fone: (86) 3232-2400 - Teresina - PI - www.criar.med.br Recebido em 18/11/2008
RESUMO
Objetivos: determinar se o dia da transferência e a qualidade embrionária estão relacionados com a porcentagem de gravidez.
Métodos: Oitocentos e oitenta e três ciclos de ICSI foram analisados retrospectivamente. Pacientes foram divididas em dois grupos, tendo como diferencial o dia de transferência de embriões. GRUPO 01 e 02 para transferência em 48hs (D+2) e em 72hs (D+3), respectivamente. Para os estudos estatísticos utilizouse teste de χ2 a um nível de significância de p<0,05.
Resultados: A taxa de gravidez em pacientes que tiveram seus embriões transferidos no dia 3 é significantemente maior que no dia 2, 45,3% e 27,65%, respectivamente. Houve mais embriões Qualidade A transferidos no dia 3, 51%, que no dia 2, 40%. As taxas de aborto foram maiores para transferências 48hs pós ICSI, 31,3%, quando comparadas com taxas de 72hs, 28,15%.
Conclusão: Confirmando o apresentado em estudos anteriores, a qualidade dos embriões transferidos, bem como as taxas de gravidez são maiores nos casos de transferência realizada 72hs pós ICSI, quando comparadas com 48hs.
Palavras chave: embriões, fertilização in vitro, ICSI, taxa de fertilização.
ABSTRACT
Objective: determinate the relation between transference day and embryo quality and its influence on pregnancy rate.
Methods: eight hundred and three (803) cycles of ICSI were analyzed, retrospectively. Patients were classified into two groups, based on embryos transference day. GROUP 01 and 02 to transferences on 48hs (D+2) and on 72hs (D+3), respectively. Statistical study was done using χ2 test, significance level of p<0,05.
Results: The rate of pregnancy on patients with their embryos transferred on the third Day is significantly higher (45,3%) when compared with patients of the GROUP 01, with embryos transferred on the second day (27,65%). There were more quality A embryos transferred on day 3 (51%) than embryos transferred on Day 2 (40%). Abortion rate was higher on transferences with 48hs after ICSI (31,3%) when compared with 72hs (28,15%).
Conclusion: Confirming presented previous studies, the quality of transferred embryos, as well as pregnancy rate, is higher on transferences made within 72hs after ICSI, when compared within 48 hs.
Key-words: embryos, in vitro fertilization, ICSI, pregnancy rate
INTRODUÇÃO
Atualmente, o número de casais com problemas de infertilidade que recorrem à Reprodução Assistida (RA) tem aumentado significantemente.
Após 1993, com a introdução da ICSI (Intracytoplasmic sperm injection), solucionando problemas de infertilidade masculina e falha de fertilização, novas tecnologias têm surgido, aumentando as taxas de gestação ( Sousa & Tesarik, 1994, Blake et al, 2000).
Outros fatores responsáveis por esse sucesso estão relacionados com o aprimoramento da fisiologia reprodutiva, diversidade de condições de cultura embrionária, melhora das taxas de fertilização e clivagem, seleção criteriosa dos embriões transferidos e a qualidade dos materiais envolvidos no processo ( Serhal et al, 1997).
Na Fertilização in vitro busca-se, ao máximo, submeter o embrião às condições semelhantes ao trato reprodutivo. A qualidade do meio de cultura é fundamental para sustentar o desenvolvimento saudável até o momento da transferência sendo, considerados fatores indispensáveis: pH, taxas de CO2, temperatura, além das características peculiares de cada meio (Takeuchi et al, 2001).
A alta incidência de gravidez múltipla é uma preocupação de casais que recorrem a RA. Segundo dados da Rede Latino-americana de Reprodução Assistida, essa taxa foi de 28.1% em 2005. Estudos apontam que é necessária uma avaliação criteriosa antes da transferência embrionária, prevalecendo qualidade a quantidade (Ebner et al, 1999; Hardarson et al, 2001). Para isso, o cultivo in vitro deve ser, pelo menos, de 72 horas. Essa seleção seria uma solução para as freqüentes gestações gemelares sem comprometer taxas de gestação.
Por outro lado, é possível que características que tornam o embrião de boa qualidade sejam alteradas com o passar de mais vinte e quatro horas em meio de cultura (Ebner et al, 2001), induzindo embriologistas a transferir embriões em dia 2 nos casos de pacientes com baixo número de embriões (menor que 4).
Em nosso centro, o sistema utilizado para classificação e seleção de pré-embriões a serem transferidos analisa parâmetros morfológicos característicos de cada fase do desenvolvimento. Desse modo, a transferência para o útero materno está associada com o fator de infertilidade, idade da paciente, número do ciclo, quantidade e qualidade de embriões.
Este trabalho tem como objetivo comparar a influência das características acima mencionadas com a transferência embrionária nos dias 2 e 3 pós ICSI.
MATERIAIS E MÉTODOS
Um total de 883 ciclos de ICSI foi analisado retrospectivamente entre agosto de 2001 a dezembro de 2007. Foram excluídas do estudo ciclos de pacientes azoospérmicos e de embriões criopreservados. Pacientes foram divididas em dois grupos, tendo como diferencial o dia de transferência de embriões. GRUPO 01 e 02 para transferência em 48hs (D+2) e em 72hs (D+3), respectivamente.
Neste trabalho utilizamos como fator de inclusão pacientes com um nível de FSH <15 UI /ml, no mínimo 2 folículos, com média de 16 - 17 milímetros de diâmetro, medidos por ultra-sonografia transvaginal. Na maioria dos casos, foi utilizado protocolo de estímulo longo (Sonntag et al, 2005), somente em casos excepcionais o ciclo curto foi usado (<1% dos casos). Utilizou-se agonista do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-a) para bloqueio hipofisário (Lupron Depot®, ½ ampola de 3,75 mg; Abbott, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) no 21º dia do ciclo anterior. Foi confirmada a supressão ovariana mediante avaliação ultra-sonográfica transvaginal.
A aspiração dos oócitos ocorreu 34 - 36hs pós hCG em ASP 125, Vitrolife a 37ºC, por ultrassom transvaginal. Após a recuperação o gameta feminino foi lavado em Modified HTF with HEPES Buffer (mHTF), Irvine Scientific, à 10% de Human Serum Albumin (HSA) Irvine Scientific e imediatamente passados em Hialuronidase - (HYASE) Vitrolife, para retirada das células do cúmulos. Placas contendo gotas com 50,0µl de HTF suplementados a 10% de HSA, coberta com 10,0ml de óleo mineral (OVOIL) Vitrolife, previamente equilibradas foram designadas para incubação dos oócitos por 3 a 5hs a 37°C, pH 7,3 - 7,4 e concentração de CO2 a 5,5 - 6.5%.
Denudação dos oócitos foi realizada manualmente com micropipetas de silicone 125µm, em placa de incubação e classificados quanto à maturação.
Apenas gametas maduros, oócitos MII (Metáfase II) foram transferidos para placa com gotas numeradas circularmente, com 5,0µl de mHTF a 10% de HSA e gota central contendo meio viscoso que diminui a motilidade dos espermatozóides (PVP) ICSI 100, Vitrolife, coberta por 10,0ml de OVOIL, submetidos à ICSI.
Amostras seminais foram avaliadas e preparadas de acordo com a concentração e motilidade dos espermatozóides. A técnica Swim up, migração ascendente dos espermatozóides do líquido seminal para mHTF a 10% de HSA por 1 hora foi utilizada para concentrações > 10 milhões/ml. Amostras com concentração inferior a 10,0 milhões/ml foram submetidas a Sperm wash, centrifugação por 10 minutos a 2000 rpm de 1,0ml de líquido seminal em 1,0ml de mHTF a 10% de HSA . Amostras seminais foram avaliadas e preparadas quanto a concentração de espermatozóides pelas técnicas de Swim up, migração ascendente dos espermatozóides do líquido seminal para mHTF a 10% de HSA por 1hora, para concentração de espermatozóide > 10 milhões/ml. Sperm wash, centrifugação por 10 minutos a 2000rpm, de 1,0 ml de liquido seminal em 1,0ml de mHTF a 10% de HSA, para amostras com concentração até 10,0 milhões/ ml. Gradiente descontinuo, ISOLATE Irvine Scientific, foi utilizado em amostras com concentração >10,0 milhões/ ml, motilidade A+B< 50% e celularidade aumentada. Partículas de sílica em concentrações diferentes capacitam e selecionam os gametas masculinos, centrifugados por 20 minutos a 2000rpm. Um pool de espermatozóide em meio de cultura foi utilizado para ICSI.
A verificação da fertilização ocorreu de 16 a 19hs pós ICSI, quanto a presença do segundo corpúsculo polar, pró-núcleos e suas características.
No D+2, a avaliação será feita considerando-se o número de células do embrião, a presença de multinucleação e a porcentagem de fragmentação. Para D+3, serão avaliados ritmo de clivagem, a regularidade e grau de adesão dos blastômeros e quanto à presença e tipo de fragmentação (Tabela 01).
Tabela 01. Critérios de classificação de embriões a serem transferidos
Para a transferência, os embriões selecionados serão colocados em placa de Petri Falcon 3001 com 1,0ml de HTF 10% HSA. O Cateter Soft Cook Sidney IVF® foi lavado com o mesmo meio, e com o auxílio de uma seringa 1CC Normanject, os embriões foram aspirados entre duas colunas de ar. No centro cirúrgico a paciente foi colocada em posição ginecológica e com ajuda do especulo o colo uterino foi exposto e lavado com 10,0ml de PBS Irvine Scientific. Por ultra-sonografia abdominal, visualizou-se a guia do cateter e o Soft passando com os embriões que serão descarregados suavemente 1,0 - 2,0cm do fundo da cavidade uterina.
Gravidez bioquímica foi avaliada entre 11º - 13º dia pós transferência embrionária, e gravidez clínica por ultra-sonografia transvaginal 5 - 6 semanas após, comprovando a presença de saco gestacional com batimentos cardíacos.
Para a análise estatística das diferenças na taxa de gestação entre pacientes que transferiram seus embriões em dia 2 e de transferência no dia 3, utilizou-se o teste de χ2, a um nível de significância de p<0,05.
RESULTADOS
Foram realizadas 358 transferências no D+2, GRUPO 01 com idade média 36 anos (±5,5) e aproximadamente 3,0 embriões por ciclo, sendo, 40% Qualidade A, 44% Qualidade B, 13% Qualidade C e 2% Qualidade D. As taxas de ßhCG positivo nesse grupo foram de 27,65% e aborto 31,3% dos casos.
No GRUPO 02, D+3, foram realizadas 525 transferências embrionárias em pacientes com média de idade de 34 anos (±5,7), e transferência de 3,7 embriões por ciclo, sendo a maioria, de Qualidade A: 51%. Qualidade B, C e D ocorreram com freqüências de 41,5%, 6,2% e 1,3% respectivamente. O resultado de gravidez foi 45,3%, e abortos 28,15% (Tabela 02).
Tabela 02. Efeito do dia de transferência sobre a taxa de gravidez
DISCUSSÃO
Na literatura, estudos que avaliam o período de incubação embrionária sobre as taxas de gravidez não são conclusivas ( ASRM, 2002; Chen et al, 2005). Pesquisas anteriores verificaram que a cada três embriões de qualidade A no D+2, apenas um permanecerá nessa classificação no D+3 (Coskun et al, 2000; Milki et al, 2000). Entretanto, um outro relato sugeriu que seria arriscado manter em cultura embrionária até D+3, casos de pacientes com número de embrião < 4 (Gardner et al, 2000; Desai et al, 2000).
Nesse trabalho foi analisada a taxa de gravidez em relação ao dia da transferência embrionária. Observamos uma diminuição significativa deste índice nas transferências realizadas no D+2 em relação às transferências em D+3 (27,65% e 45,3% respectivamente). Nossos resultados estão de acordo com os dados apresentados em literatura, confirmando a influência do dia de transferência com o valor do ßhCG positivo, que pode também estar associados ao melhor sincronismo do endométrio com os embriões no D+3.
Pacientes que apresentam sucesso no tratamento transferiram maior quantidade de embriões qualidade A (Grupo 01: 41% vs Grupo 02: 53%) o que pode estar relacionado ao aumento de gravidez do D+3 em relação a D+2.
Outro achado em nosso estudo foi a menor média de idade das pacientes do Grupo 02 em relação ao Grupo 01 (34±5,7 e 36±5,5 respectivamente). Assim como a taxa de aborto (28,15% e 31,3%). Embora os valores sejam estatisticamente insignificantes (p>0,05).
Concluímos, portanto, que o D+3 de transferência embrionária apresenta melhores resultados de gravidez nos ciclos de ICSI quando comparados ao D+2.
Referências bibliográficas:
American Society for Reproductive Medicine. Ethics Committee. Donating spare embryos for embryonic stem-cell research. Fertil Steril. 2002;78(5):957-60.