JBRA Assist. Reprod. 2009;13(2):13-17
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.2.03
Influência da retirada de fragmentos de embriões nas taxas de gravidez em pacientes submetidas as técnicas de reprodução assistida
Influence of fragment removal from embryos in pregnancy rates of patients submitted to human assisted reproduction
1Ph.D, Diretor Clínico do Centro de Medicina Reprodutiva -ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
2Embriologista Chefe do Centro de Medicina Reprodutiva- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
3Embriologista do Centro de Medicina Reprodutiva- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
4Embriologista do Centro de Medicina Reprodtiva- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
5Acadêmica de Ciências Biológicas- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
6Ph.D, Diretor Clínico do Centro de Medicina Reprodutiva-ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
ORIGEN, Belo Horizonte, BrasilApresentado no 9º Congresso da Red Latino Americana de Reprodução Assistida 2009, Cancun - México
RESUMO
Introdução: A ocorrência de fragmentação embrionária in vitro é freqüentemente relacionada ao mau prognóstico nos tratamentos de reprodução assistida. Embriões com uma alta porcentagem de fragmentação possuem uma taxa de implantação e gravidez diminuída. Estudos indicam que pode-se reduzir os efeitos indesejados da fragmentação com a retirada dos mesmos.
Objetivo: Avaliar o efeito da retirada de fragmentos em embriões sobre a taxa de gravidez.Material e métodos: O estudo incluiu 50 pacientes cujos embriões possuíam 20-50% de fragmentação e foram submetidos ao processo de retirada de fragmentos. Oitenta e duas pacientes que possuíam embriões com 20-50% de fragmentação e não passaram pelo processo, formaram o grupo controle. Também foi utilizado um grupo controle que passou apenas pelo assisted hatching. O procedimento foi realizado com auxílio de laser diiodo e micropipetas, em PBS sem cálcio e magnésio. A transferência foi realizada após a conclusão do procedimento. Quatorze dias após a punção foi realizado o exame de bhCG.
Resultados: Todos os dados analisados foram semelhantes entre os grupos estudados. A taxa de gravidez do grupo de retirada de fragmentos foi de 44% versus 43% do grupo controle. Quando foram analisadas pacientes maiores que 37 anos a taxa de gravidez do grupo de retirada de fragmentos (52%) mostrou-se significativamente maior quando comparadas ao grupo cujos embriões não passaram pelo processo (29%) (p=0,04), mas similar ao grupo que passou somente pelo processo de assisted hatching (33%).
Conclusão: A retirada de fragmentos é uma técnica que pode auxiliar no incremento das taxas de gravidez, em pacientes com mais de 37 anos, quando os embriões a serem transferidos possuem uma fragmentação maior que 20%.
Palavras-chave: fragmentação, retirada de fragmentos, qualidade embrionária, gravidez
ABSTRACT
Introduction: The fragmentation of embryos is frequently associated with bad prognosis in treatments of assisted reproduction. Embryos with a high percentage of fragmentation have implantation and pregnancy rates reduced. Studies have demonstrated that removal of fragments could minimize the malefic effects of fragmentation.Objective:Evaluate the effect of fragment removal of embryos in pregnancy rates.
Material and methods: The study included 50 patients with embryos that presented 20-50% of fragmentation who were submitted the procedure of fragment removal. The control group was composed by 82 patients who had embryos with 20-50% of fragmentation and were not submitted to procedure of fragment removal. Another control group was submitted only to assisted hatching. A laser diiodo and micropipettes were used in the procedure, which was performed in PBS without calcium and magnesium. Immediately after the procedure the transfer was performed. The pregnancy outcome was evaluated fourteen days after oocyte retrieval.
Results: All evaluated data was similar among the groups. The pregnancy rate of fragment removal group was 44% versus 43% in the control group. In the group of fragment removal, patients with 37 years old or more, have had a pregnancy rate (52%) significantly higher than patients of the same age who were not submitted to the procedure (29%) (p=0,04), but similar to the group submitted only to assisted hatching (33%).
Conclusion: The fragment removal is a useful technique for provide higher pregnancy rates, in patients with 37 years old or more, when embryos about to be transfered have a fragmentation at least 20%.
Keywords: fragmentation, fragment removal, embryo quality, pregnancy
INTRODUÇÃO
A ocorrência de fragmentação embrionária in vitro é freqüentemente relacionada ao mau prognóstico nos tratamentos de reprodução assistida (Erenus et al., 1991; Shulman et al.,1993; Giorgetti et al .,1995). Existem poucos relatos de gravidez após transferência de embriões com alta taxa de fragmentação (Erenus et al., 1991; Shulman et al.,1993; Giorgetti et al .,1995; Veek & Rosenwaks, 1999; Ziebe et al.,1997). Os fragmentos citoplasmáticos surgem após divisão celular podendo ser decorrentes de fatores intrínsecos como, alterações genéticas e idade materna, fatores extrínsecos, como congelamento e ambiente de cultivo inadequado (Giorgetti et al, 1995).
A fragmentação diminui o potencial de desenvolvimento embrionário, visto que o contato dos blastômeros intactos é prejudicado levando a uma falta de compactação e bloqueio do desenvolvimento (Giorgetti et al .,1995; Alikani et al, 1999). Eftekhari-Yazdi et al, (2006) verificaram que a fragmentação influencia no tamanho do blastocisto devido a uma diminuição de células do trofectoderma (TE) e da massa celular interna (ICM). A diminuição de células pode prejudicar o hatching, pois o volume de líquido da blastocele pode estar reduzido (Juriscova et al, 1996) e há possibilidade de uma diminuição das enzimas produzidas pelo TE (Van Blerkom, 1993).
Uma conseqüência da fragmentação é a diminuição de citoplasma (Veek & Rosenwaks, 1999; Eftekhari-Yazdi et al, 2006). Johansson et al (2003), observaram que grandes fragmentos podem privar os blastômeros de organelas essenciais como mitocôndrias, RNA mensageiro e proteínas. Além disso, Juriscova et al (1996) demonstraram que a presença de fragmentos liberam substâncias tóxicas que podem induzir blastômeros intactos ao processo de apoptose.
Vários autores reportam uma redução na taxa de implantação e gravidez para embriões com 10-50% de fragmentação embrionária (Erenus et al, 1991; Shulman et al,1993; Giorgetti et al,1995; Ziebe et al.,1997; Ebner et al, 2001). Alikani et al, (1999), realizou um estudo retrospectivo em que foi analisada a influência dos vários padrões de fragmentação nas taxas de gravidez e implantação. Quando a fragmentação embrionária estava entre 25-35% a taxa de gravidez observada foi de 46,3% e quando era maior que 35% a taxa foi de 14,8%. Ebner et al, (2001), observaram que quando foram transferidos embriões com uma fragmentação de 25-50% a taxa de gravidez foi de 17%.
Buscando melhorar as taxas de implantação e gravidez diversos autores (Alikani et al, 1999; Alegretti et al, 2004; Gurgan et al, 2005; Keltz et al, 2006) retiraram fragmentos dos embriões. Desses, alguns observaram (Alikani et al, 1999; Gurgan et al, 2005) uma redução dos efeitos indesejados da fragmentação. Os demais autores, entretanto não demonstraram diferenças significativas (Alegretti et al, 2004; Keltz et al, 2006).
O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da retirada de fragmentos citoplasmáticos na taxa de gravidez em pacientes de mal prognóstico.
MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 153 casais que se submeteram a tratamento de infertilidade conjugal por técnica de reprodução assistida, no período de julho de 2007 a novembro de 2008, foram incluídos nesse estudo retrospectivo caso-controle. A população do estudo foi composta por 50 casais cujos embriões apresentavam 20% a 50% de fragmentação, no dia da transferência, e foram submetidos à retirada dos fragmentos. A classificação embrionária foi realizada baseada no critério de Veeck, 1990.
Como grupo controle, avaliamos 82 casais que possuíam embriões com as mesmas características, mas não foram submetidos à retirada de fragmentos. Um outro grupo, composto por 21 casais cujas mulheres tinham mais de 37 anos, e que tiveram todos embriões submetidos à técnica de assited hatching, sem retirada de fragmentos, foi posteriormente avaliado como controle.
Indução da ovulação, ICSI, cultivo e transferência embrionária
A indução da superovulação foi feita com FSH recombinante (rFSH, Gonal F, Serono, Brasil) e a dose foi adequada de acordo com a resposta individual, avaliada por ultrasonografia seriada e dosagem sérica de estradiol, conforme descrito previamente (Geber et al, 2002a). A supressão da função hipofisária foi realizada com análogo do GnRH (Lectrum, Sandoz, Brasil) na fase folicular precoce ou lútea tardia (Geber et al, 2002b) ou antagonista do GnRH (Cetrotide, Serono, Brasil), iniciado quando os folículos apresentavam diâmetro médio de 14mm, para mulheres com idade > 40 anos.Quando os folículos atingiam um diâmetro médio de 17 mm com níveis concordantes de estradiol, administrouse hCG recombinante (Ovidrel, Serono, Brasil), e 34 a 36 horas após foi realizada a punção folicular para aspiração dos oocitos, guiada por ultrasonografia endovaginal. Todos oócitos ficaram incubados em meio GIVF (Vitrolife, Suécia) suplementado com 10% albumina sérica humana (HSA, Vitrolife, Suécia) e Earle´s Balanced Salt Solution (EBSS, Sigma, EUA) suplementado com 10% de substituto sintético do soro (Irvine Scientific, EUA) e 0,47 mM de piruvato (Sigma, EUA) por pelo menos duas horas e então denudados com auxílio de pipetas afiladas e hialuronidase (Sigma, EUA) 80UI. Duas horas após a denudação os oócitos em estágio MII foram inseminados pela técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e incubados em meio de cultivo G1 (Vitrolife, Suécia) suplementado com 5% de HSA e EBSS (Geber et al, 2002c), cobertos com óleo mineral (Sigma, EUA) e ambiente de 7% de CO2. A transferência foi realizada no dia 2 ou 3 do desenvolvimento embrionário em meio G2 suplementado com 5% HSA (Vitrolife, Suécia). Foi utilizado o cateter soft (Sidney- IVF, Cook, Austrália) e o suporte de fase lútea foi feito com progesterona por via vaginal (Crinone 8%, Serono, Brasil) (Geber et al, 2007). O exame de ßhCG foi realizado 14 dias após a punção. Quando positivo (>25UI/ ml) procedia-se ultrasonografia endovaginal 10 e 20 dias após. Foi considerado gravidez clínica quando se observou batimento cardíaco fetal.
Retirada dos fragmentos
Os embriões selecionados para retirada dos fragmentos antes da transferência eram aqueles que apresentavam mais de 20% e menos de 50% de fragmentação. Inicialmente foram colocados em placas de petri (Falcon BD, EUA) contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio (Sigma, EUA) suplementado com 20% de HSA e levados ao microscópio invertido (Diaphot 300, Nikon, Japão) acoplado a micromanipuladores (Narishige, Japão) e laser diiodo (Octax Laser Shot, Alemanha). O embrião era mantido por pipeta de holding (Humagen, EUA) e um orifício na zona pelúcida era aberto com dois tiros de 12 milisegundos do laser (Geber et al, 2005). Após a abertura da zona pelúcida, uma micropipeta de aspiração (Humagen, EUA) era inserida no embrião e os fragmentos retirados por sucção (Figura 1). Uma vez terminado o procedimento, o embrião era recolocado em meio de cultura. A retirada dos fragmentos era feita imediatamente antes da transferência.
Figura 1. Processo de retirada de fragmentos. A pipeta holding segura o embrião, enquanto o pipeta de assisted hatching aspira os fragmentos (A). Após a retirada dos fragmentos embrião grau I. Observa-se às 16 horas o tiro feito pelo laser diiodo (B).
Análise estatística
O calculo amostral realizado para um poder de 80% mostrou a necessidade de 44 pacientes em cada grupo. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste t de student para amostras pareadas. Utilizou-se o teste quiquadrado para se comparar a taxa de gravidez entre os grupos. Foi considerado o p < 0,05 como nível de significância estatística.
RESULTADOS
A idade das pacientes do grupo de estudo variou de 26 a 42 anos (média=35,4 anos). Um total de 579 folículos foram aspirados sendo 466 oócitos em estágio de MII. A média de folículos aspirados foi de 11,6; a média de oócitos maduros foi de 9,3 por ciclo. Foram obtidos 342 embriões, sendo transferidos um total de 182 embriões que passaram pelo processo de retirada de fragmentos. A média de embriões transferidos por ciclo foi de 3,6 e a taxa de gravidez foi de 44%.
No grupo controle, a idade das pacientes variou de 24 a 46 anos (média=35,6). Um total de 848 folículos foram aspirados sendo 702 oócitos maduros. A média de folículos aspirados foi de 10,3; a média de oócitos maduros foi de 8,6 por ciclo. Foram obtidos 555 embriões dos quais 303 foram transferidos e 230 (76%) possuíam mais de 20% de fragmentação. A média de embriões transferidos foi de 3,7 e a taxa de gravidez foi de 43% (Tabela 1).
Tabela 1. Comparação entre os resultados dos ciclos de RA cujos embriões foram submetidos à retirada de fragmentos e daqueles cujos embriões fragmentados não foram submetidos à retirada de fragmentos
Quando comparamos os dois grupos, não observamos diferença entre as médias etárias (p=0,773). Não houve diferença com relação ao número médio de folículos aspirados (p=0,239 ), oócitos MII (p=0,406), média de embriões transferidos (p=0,777 ) e taxa de gravidez (p=0,11). Em ambos os grupos a maior causa de infertilidade foi a masculina seguida por causas múltiplas (Figura 2) Quando subdividimos os dois grupos, por faixa etária (até 37 anos ou >37 anos), observamos que as proporções se mantinham semelhantes no grupo de mulheres com idade até 37 anos (Tabela 2). No grupo de mulheres >37 anos, entretanto, observamos uma diferença quando comparamos as taxas de gravidez. Nos ciclos de embriões submetidos à retirada de fragmentos (n=21) a taxa de gravidez (52%) foi significativamente superior (p=0,04) àquela encontrada nos ciclos com embriões fragmentados sem remoção dos fragmentos (29%) (Tabela 3).
Figura 2. Causas de infertilidade nos casais dos grupos com e sem retirada de fragmentos
Tabela 2. Comparação entre os resultados dos ciclos de RA cujos embriões foram submetidos à retirada de fragmentos e daqueles cujos embriões fragmentados não foram submetidos à retirada de fragmentos em pacientes ≤ 37 anos.
Tabela 3. Comparação entre os resultados dos ciclos de RA de pacientes > 37 anos cujos embriões foram submetidos à retirada de fragmentos, embriões fragmentados que não foram submetidos à retirada de fragmentos e embriões submetidos à assisted hatching.
Realizamos também uma comparação desse grupo de estudo com um grupo de casais que tiveram seus embriões submetidos à técnica de assisted hatching, sem retirada de fragmentos e com idade >37 anos. As pacientes deste grupo (n=21) apresentaram uma média de idade 39,7 anos (38 a 42 anos). Foram aspirados 213 folículos, com 205 oócitos MII. A média de folículos por ciclo foi de 10,1 e a média de oócitos maduros foi de 9,7. Foram obtidos 177 embriões sendo transferidos 78. A média de embriões transferidos foi de 3,7 e a taxa de gravidez foi de 33% (Tabela 3).
Quando comparamos os resultados entre os dois grupos, não observamos diferença entre as médias etárias (p=0,911), Não houve diferença com relação ao número médio de folículos aspirados (p=0,336), oócitos em MII (p=0,179), média de embriões transferidos (p=0,110 ) e taxa de gravidez (p=0,7).
DISCUSSÃO
Esse estudo demonstrou que a retirada de fragmentos de embriões, imediatamente antes da transferência, não é prejudicial às taxas de gravidez. Além disso, mulheres com idade maior que 37 anos, cujos embriões passaram por esse procedimento, apresentaram um aumento na taxa de gravidez.
Alikani et al (1999) também não observaram efeitos adversos da retirada de fragmentos quando analisaram 68 embriões com mais de 20% de fragmentação. Alegretti et al (2004) não observaram diferença na taxa de gravidez o que pode ter sido ocasionado pelo pequeno número de pacientes incluídos no estudo e utilização de solução ácida para abertura da zona pelúcida. Keltz et al (2006) também não observaram uma melhora na taxa de gravidez após retirada de fragmentos, provavelmente por ter utilizado embriões com baixa taxa de fragmentação. Além disso, os autores não separaram os pacientes de acordo com a faixa etária. Diferentemente do observado em nosso estudo, Gurgan et al (2005) relata um aumento na taxa de gravidez após retirada de fragmentos em embriões de pacientes com três falhas prévias de ICSI. Este estudo, entretanto foi realizado com apenas 25 pacientes.
O grupo de estudo foi composto por 50 casais sendo suficiente para o cálculo estatístico. Este grupo representa uma parcela de pacientes com mau prognóstico de gravidez, uma vez que apresentaram todos seus embriões disponíveis para transferência com mais de 20% de fragmentação. O grupo controle também era composto por pacientes de mau prognóstico, uma vez que apresentavam 76% dos embriões disponíveis para transferência com mais de 20% de fragmentação.
Alguns autores acreditam que embriões com elevada taxa de fragmentação possuem aumento de anormalidades cromossômicas (Hardy et al, 1993; Jamieson et al, 1994; Harper et al, 1995; Hardy, 1999). Bongo et al, 1991 demonstraram uma maior prevalência de aneuploidia em embriões fragmentados. Keefe et al, 2005 demonstraram um encurtamento dos telômeros em embriões muito fragmentados. A retirada de fragmentos não ajuda a melhorar a qualidade destes embriões geneticamente alterados, por este motivo optamos em não realizar a retirada de fragmentos em embriões que possuíam 50% ou mais de fragmentos.
Não foram observadas diferenças entre os grupos com relação a causa de infertilidade, idade, número de folículos, oócitos e embriões transferidos. Isso demonstra que os grupos foram semelhantes e comparáveis. A taxa de gravidez no grupo de retirada de fragmentos foi igual a do grupo controle de pacientes cujos embriões não passaram pelo processo. Este dado comprova que a micromanipulação não é prejudicial ao tratamento, o que também foi observado anteriormente (Alegretti et al, 2004; Keltz et al, 2006). Além disso, é importante ressaltar que as pacientes do grupo controle apresentavam um melhor prognóstico do que o grupo estudado, pois 24% dos embriões transferidos possuíam fragmentação menor que 20%.
A idade é um dos fatores relacionados ao aumento da fragmentação embrionária (Keltz et al, 2006), assim avaliamos separadamente as pacientes de acordo com a faixa etária. Pacientes com mais de 37 anos que tiveram seus embriões submetidos à retirada de fragmentos apresentaram taxa de gravidez superior ao grupo sem retirada de fragmentos. No nosso entender este é o único estudo, até o momento, que demonstra esse resultado. Para se realizar a retirada de fragmentos é necessário fazer um orifício na zona pelúcida. Assim poder-se-ia inferir que essa melhora no resultado poderia ser decorrente do processo de assisted hatching, visto que vários autores já demonstraram sua eficiência em aumentar a taxa de gravidez em mulheres acima de 37 anos (Hsieh et al, 2002; Edi-Osagie et al, 2003; Ghobara et al, 2006; The Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology and Practice Committee of the American society for Reproductive Medicine, 2008).
A fim de se confirmar se esse resultado foi realmente decorrente da retirada de fragmentos ou apenas da realização do orifício na zona pelúcida, comparamos este subgrupo com pacientes que tiveram seus embriões submetidos ao processo de assisted hatching somente. Observamos uma maior taxa de gravidez no grupo em que houve retirada de fragmentos, entretanto esse resultado não foi significativo. Isso pode ser explicado pelo pequeno número de pacientes em ambos os grupos. Outro fato importante é que o grupo de assisted hatching os embriões não eram de mau prognóstico.
A melhora na taxa de gravidez após a retirada de fragmentos pode ocorrer devido ao restabelecimento do contato entre os blastômeros e conseqüente desenvolvimento embrionário adequado (Van Blerkom, 1993; Juriscova et al, 1996; Alikani et al, 2000). Eftekhari-Yazdi et al, 2006 observaram também que há um amento no número de células do TE e ICM quando realizava-se a retirada de fragmentos. Com um maior número de células o hatching embrionário é facilitado. Outro ponto favorável em relação à retirada dos fragmentos é a possível diminuição de substâncias nocivas capazes de induzir o processo de apoptose(Eftekhari-Yazdi et al, 2006; Juriscova et al, 1996).
Nosso estudo demonstrou que a retirada de fragmentos de embriões com 20-50% de fragmentação não é prejudicial ao tratamento com técnicas de reprodução assistida. Além disso, representa uma ótima alternativa para aumentar as taxas de gravidez em pacientes com idade maior que 37 anos. Mais estudos são necessários para se confirmar se esse efeito foi decorrente da retirada de fragmentos ou do assisted hatching.
Referências bibliográficas
Alegretti, J R; Rocca T; Motta E L; et al (2004) Microsurgical embryonic fragment removal (MsFR) in patients with multiple IVF implantation failures Fert. Steril 82, (Suppl 2), S326-S327.
Hardy K (1999) Apoptosis in the human embryo. Reviews of Reprod. 4, 5-134.