Transferência de embriões cultivados independentemente em meios de cultura essencial e sequencial melhora as taxas de gravidez em tratamentos com técnicas de reprodução assistida.

Selmo Geber; Fábio Nascimento; Renata Bossi; Fernando Guimarães; Marcello Valle; Marcos Sampaio

JBRA Assist. Reprod. 2009;13(2):24-27
ARTIGO ORGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.2.05

Transferência de embriões cultivados independentemente em meios de cultura essencial e sequencial melhora as taxas de gravidez em tratamentos com técnicas de reprodução assistida

Transference of embryos cultivated independently in Essential and Sequential culture medium improves the rates of pregnancy in treatments with techniques of in vitro fertilization

Selmo Geber¹, Fábio Nascimento², Renata Bossi³, Fernando Guimarães⁴, Marcello Valle⁵, Marcos Sampaio⁶

¹Ph.D, Diretor Clínico do Centro de Medicina Reprodutiva -ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
²Embriologista do Centro de Medicina Reprodutiva- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
³Embriologista Chefe do Centro de Medicina Reprodutiva- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil
⁴Embriologista do Centro de Medicina Reprodtiva- ORIGEN, Rio de Janeiro/Brasil
⁵Diretor Clinico do Centro de Medicina Reprodutiva - ORIGEN, Rio de Janeiro /Brasil
⁶Ph.D, Diretor Clínico do Centro de Medicina Reprodutiva- ORIGEN, Belo Horizonte/Brasil

Received June 03, 2009
Accepted June 05, 2009

Apresentações: 2009: 9º Congresso da Rede Latinoamericana de Reprodução Assistida - Cancun / México

RESUMO
Objetivo: Avaliar o impacto da transferência simultânea de embriões cultivados independentemente em dois diferentes meios de cultura.
Metodologia: Finalizada a punção folicular, os oócitos de cada paciente foram separados em dois grupos e incubados por 2 horas conforme o meio de cultivo a ser usado até a transferência, Essencial ou Sequencial (Givf). Em seguida, realizou-se a denudação dos oócitos e após uma hora, a inseminação dos mesmos por ICSI. Logo após a inseminação, os oócitos pré-incubados em Essencial e Givf foram cultivados individualmente nos meios Essencial e Sequencial (G1) respectivamente. A fertilização foi checada 19 horas após a ICSI e no dia seguinte (dia 2) realizou-se a classificação e transferência embrionária. Todas as transferências foram realizadas em meio G2, de forma que pelo menos 1 embrião de cada meio de cultivo foi selecionado.
Resultados: Os resultados de gravidez dos ciclos que realizaram cultivo misto (bhcg = 51,85%) foram superiores, de forma significante (p=0,00230) aos ciclos que cultivaram apenas em G1 (bhcg=36,68%) e superiores (p= 0,09134) aos que cultivaram e transferiram apenas em Essencial (bhcg= 44,2%).
Conclusão: O sistema de cultivo misto apresentou melhores resultados de gravidez em relação ao sistema seqüencial (p<0,05). A diversidade de meios de cultivo demonstrou favorecer o melhor aproveitamento do potencial implantacional de embriões de um mesmo ciclo de Fertilização in vitro.

Palavras-Chave: Cultivo Misto, Meios de Cultura, Desenvolvimento embrionário, Transferencia Simultanea, Taxa de gravidez.

ABSTRACT
Objective: Evaluate the impact of the simultaneous transfer of embryos cultivated independently in two different kinds of culture medium.
Methodology: After follicular aspiration, the oocytes of each patient were divided in two groups and incubated for 2 hours according to the culture medium to be used until the embryo transfer, Essential or Sequential (Givf). After the 2h of incubation, the oocytes denudation were performed and after more 1h the insemination were realized by ICSI. Just after insemination, the oocytes pre-incubated in Essential and Givf were cultured individually in Essential and Sequential (G1) respectively. The fertilization were evaluated 19h after ICSI and one day after (Day2) we realized the classification and embryo transfer. All transfers were realized in G2, and at least 1 embryo from each culture medium was chosen.
Results: The pregnancy outcomes of cycles which realized mixing culture (bhcg = 51,85%) were significantly higher (p=0,00230) than the cycles that were cultivated only in G1 (bhcg = 36,68%) and superior (p = 0,09134) to than that were cultivated and transferred only in Essential (bhcg = 44,2%).
Conclusion: The compound culture system, showed better results in relation to the sequential (p<0,05). The diversity of culture medium showed to privilege a higher income of the embryo implantation potential on a same IVF cycle.

Keywords: Compound Culture, Culture Medium, Embryo Development, Simultaneous Transfer, Pregnant rates.

INTRODUÇÃO
Uma das etapas mais importantes no tratamento com técnicas de reprodução assistida é o cultivo embrionário. Diversos tipos de meios de cultura tem sido propostos nos últimos anos (Biggers, 2002 e 2003; Summers & Biggers, 2003; Jones, 1998; Perin et al., 2008) com objetivo de melhorar o ambiente para o desenvolvimento embrionário in vitro, de forma a mimetizar o ambiente natural, da forma mais aproximada possível.
É fundamental ter cuidados com substrato energético (Whitten, 1956, 1957; Biggers et al., 1967), presença de fontes fixas de nitrogênio como aminoácidos, albumina ou soros (Loutradis et al., 2000), a adição de antioxidantes (Tarin,1995;Vermeiden & Bast, 1995) e antibióticos (Biggers & Summers, 2008). O maior conhecimento sobre as vias metabólicas embrionárias, levaram a mudanças no que se considera ideal para os meios de cultura (Biggers & Summers, 2008).
Os primeiros meios de cultura utilizados foram os essenciais (minimum essential media - MEM) que contem sais, glicose, bicarbonato de sódio e vermelho fenol, devendo ser suplementado com piruvato e albumina (Biggers et al., 1967) suprindo assim as necessidades energéticas e de pH, para todo o período de desenvolvimento préimplantacional.
Posteriormente, foram desenvolvidos os meios chamados de seqüenciais, uma vez que apresentavam diferentes composições de acordo com a fase de desenvolvimento embrionário. Esse meio contem sais, glicose, piruvato, aminoácidos, antibióticos, anti-oxidantes e bicarbonato de sódio, devendo ser suplementado com albumina (Pool, 2002, 2005).
Não existem, ate o momento, estudos que tenham demonstrado a superioridade de um tipo de meio de cultura sobre os demais, com relação ao desenvolvimento embrionário e taxas de gravidez, quando a transferência é realizada até o dia 3 (Biggers & Summers, 2008). Além disso, não se sabe se alguns embriões seriam mais beneficiados por um tipo de meio de cultura do que outro.
Assim, o objetivo de nosso estudo foi avaliar o efeito da exposição de embriões de um mesmo ciclo a dois diferentes meios de cultura, com posterior transferência de pelo menos um embrião cultivado em cada meio de cultura.

MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 652 casais submetidos a tratamento de infertilidade pela técnica de reprodução assistida, no período de janeiro de 2007 a julho de 2008, foi incluído no estudo. Deste total, 243 tiveram os embriões cultivados em dois tipos de meio de cultura, isto é, Essencial e Seqüencial - cultivo misto; 169 casais tiveram os embriões cultivados apenas em meio Sequencial, e 240 casais apenas em meio Essencial.

Indução da ovulação
A indução da superovulação foi feita com FSH recombinante (rFSH - Gonal F - Serono - Brasil) e a dose foi adequada de acordo com a resposta individual, avaliada por ultrasonografia seriada e dosagem sérica de estradiol, conforme descrito previamente (Geber et al., 2002).A supressão da função hipofisária foi realizada com análogo do GnRH (Lectrum - Sandoz - Brasil) na fase folicular precoce ou lútea tardia (Geber et al., 2002b), ou antagonista do GnRH (Cetrotide - Serono - Brasil), iniciado quando os folículos apresentavam diâmetro médio de 14mm, para mulheres com idade >40 anos. Quando os folículos atingiam um diâmetro médio de 17 mm com níveis concordante de estradiol, administrouse hCG recombinante (Ovidrel - Serono - Brasil), e ~34 horas após foi realizada a punção folicular para aspiração dos oócitos, guiada por ultrasonografia endovaginal.

Fertilização in vitro, cultivo e transferência embrionária
Após a identificação e separação dos oócitos do líquido folicular, os mesmos foram transferidos para tubos com 1ml de meio de cultura. No grupo de cultivo misto, os embriões foram alocados igualitariamente para os dois meios de cultura. Nos demais grupos, todos os embriões foram alocados para um tipo de meio de cultura, apenas. Após duas horas de incubação em meio de cultura, os oócitos foram denudados em hialuronidase com pipeta afilada. O preparo do sêmen foi realizado pela técnica de swim up modificado (Geber et al., 2002c).Aproximadamente duas horas depois todos oócitos foram inseminados pela técnica de Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides (ICSI) e a fertilização foi confirmada após 19 horas. Os embriões foram mantidos em meio de cultura cobertos por óleo mineral (Sigma - EUA) a 37⁰C e 7% de CO₂. A transferência embrionária foi realizada no dia 2 ou 3 pós ICSI utilizando-se catéter Soft (Sydney IVF - Cook - Austrália). Foram considerados embriões de boa qualidade aqueles que tinham 2 a 4 células, com blastômeros regulares e fragmentação de até 10% (Veeck, 1999).O suporte de fase lútea foi feito com progesterona por via vaginal (Crinone 8% - Serono - Brasil). O teste de gravidez (ß hCG serico) foi realizado 14 dias após a punção folicular, e uma vez positivo (>25mUI/ml), realizou-se ultrasonografia 10 dias apos, seguida de nova ultrasonografia 10 dias depois. Foram consideradas grávidas as pacientes que apresentaram batimentos cardíaco-fetais ao exame.

Meio de cultura
O meio de cultura Essencial foi o Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS - SIGMA - EUA) suplementado a 10% com soro sintético substituto (SSS - Irvine Scientific - EUA) e 0,47mM de piruvato (Sigma - EUA) (Caro & Trounson, 1986). O meio Seqüencial foi composto por duas partes, G-IVF (Vitrolife - Suécia) para manipulação de gametas, e G1 (Vitrolife - Suécia), para cultivo até dia 3. A suplementação foi feita com 10% de Human Serum Albumin (HSA - Irvine Scientific - EUA) para o G-IVF e 5% de HSA para o G1. O meio de transferência utilizado em todos os casos foi o G2 (Vitrolife - Suécia) suplementado com 5% de HSA. Os suplementos adicionados em cada meio possuíam diferentes concentrações de Albumina, sendo 50mg/ml para SSS e 100mg/ml para HSA.Foram denominados ciclos de cultivo Misto aqueles em que pelo menos um embrião cultivado em cada tipo de meio de cultura tenha sido transferido. Quando os embriões transferidos foram cultivados em meios G-IVF e G1, foram denominados cultivo Seqüencial, e quando os embriões transferidos forma cultivados apenas em EBSS, foram denominado cultivo Essencial.

Análise Estatística
Foi realizado um estudo prospectivo tipo caso controle. O calculo amostral foi realizado considerando-se um poder de 80%, sendo necessários pelo menos 103 pacientes para cada grupo. Foram utilizados os testes de qui-quadrado ou t de student quando adequado. A diferença foi considerada significativa quando p <0,05.

RESULTADOS
A idade das pacientes variou de 21 a 45 anos, com media de 34,4. Nos grupos de cultivo Misto, Sequencial e Essencial as médias de idade foram de 34, 34,2 e 35,1, respectivamente. O grupo de meio Essencial apresentou idade superior aos demais (p=0,024). O tempo de indução da superovulação e dose total de rFSH foi semelhante nos três grupos, com média de 11 dias e 2325 UI. O número de oócitos em metáfase II foi semelhante nos três grupos (Tabela 1).

Tabela 1. Comparação entre o numero de oócitos MII, embriões de boa qualidade, embriões transferidos e taxas de gravidez entre os grupos estudados.

Quando comparamos o número médio de embriões de boa qualidade obtidos nos três grupos, identificamos uma menor proporção no grupo de embriões cultivado em meio Seqüencial, com uma media de 4 embriões, enquanto nos grupos Misto e Essencial a media observada foi de 4,6 embriões ().
Identificamos uma maior taxa de gravidez no grupo de cultivo Misto, quando comparada com o grupo de cultivo Sequencial (p=0,002). Apesar de não significativa, observamos uma maior taxa de gravidez no grupo de cultivo Misto quando comparado ao grupo de cultivo Essencial ().

DISCUSSÃO
Nosso estudo demonstrou que o cultivo de embriões, de um mesmo ciclo de tratamento, em diferentes meios de cultura determinou aumento nas taxas de gravidez, quando comparado aos ciclos cujos embriões foram cultivados em um único meio. Em nosso entender, esse é o primeiro estudo que faz esse tipo de avaliação. Os resultados sugerem também, que diferentes embriões podem ter diferentes necessidades fisiológicas durante o período de desenvolvimento preimplantacional, ainda que provenientes de um mesmo casal.
O aumento nas taxas de gravidez encontrado pode ser explicado pelas diferenças nos dois meios de cultura utilizados simultaneamente para embriões de um mesmo casal. Assim, ampliamos os tipos de oferta, aumentando a chance de atender às principais necessidades metabólicas de cada pool de embriões, pois em todas as transferências havia pelo menos um embrião de cada um dos dois tipos de meio de cultura, ao invés de apenas um meio de cultura.
Nossos resultados confirmam os achados de Trounson & Caro (1986) (Caro & Trounson, 1986) sobre a não essencialidade da presença de um grupo complexo de aminoácidos para o adequado desenvolvimento de todos embriões. Tal afirmação sustenta-se no fato de que apesar do meio Seqüencial possuir suplementação com HSA e aminoácidos como fonte de proteína, o meio Essencial possui apenas o SSS.
Os dois meios de cultura apresentavam fontes de nitrogênio fixado em diferentes proporções tanto nos suplementos (HSA e SSS) quanto na adição direta de aminoácidos. Este fato reafirma as conclusões de Houghton et al (2002) (Franchesca et al., 2002), que descreveram a capacidade de embriões na fase pré-implantacional de selecionar e consumir gradativamente os elementos mais importantes para o próprio desenvolvimento, sem necessariamente que embriões pertencentes a um mesmo ciclo apresentem o mesmo padrão de seletividade. Não há conformidade fisiológica em retirarmos aminoácidos dos meios de cultivo.
Nosso trabalho reafirmou os achados de Barak et al (1998) (Barak et al., 1998) e Macklon et al (2002) (Macklon et al., 2002) demonstrando que em determinados meios a glicose não inibe o desenvolvimento embrionário inicial. Uma vez que ambos os meios utilizados possuem glicose em toda a sua constituição.
Podemos concluir que a transferência de embriões provenientes de meios de cultura diferentes, sendo um Essencial e outro Seqüencial, pode determinar um aumento nas taxas de gravidez em ciclos de reprodução assistida.