JBRA Assist. Reprod. 2009;13(3):9-13
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.3.02
Análise morfológica dos folículos primordiais de ovários de ovino criopreservados em EG, DMSO e sua associação
Morphological analysis of primordial follicles from sheep ovaries cryopreserved in EG, DMSO and their association
1PhD, Embriologista da Clínica Endogin Serh, Bauru - SP
2Professor Assistente Doutor do Departamento de Urologia da Faculdade de Medicina da UNESP, Botucatu - SP
3PhD, Professora Adjunto do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootécnica da UNESP, Botucatu - SP
Local de realização do trabalho:Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootécnica da UNESP, Botucatu - SP.Apresentado no XII Congresso Brasileiro de Reprodução Assistida de 2008 em São Paulo Órgão financiador: FAPESP/Proc.: 02/02705-7
RESUMO
Objetivo: Comparar os crioprotetores Dimetil Sulfoxido (DMSO), Etileno Glicol (EG) e sua associação, para criopreservação do córtex ovariano de ovelha.
Metodologia:Os fragmentos ovarianos foram divididos em 3 partes:
1.Uma parte foi destinada a análise do material fresco.
2.Uma segunda parte foi incubada com as soluções de congelamento contendo 1,5M EG ou 1,5M DMSO ou 1,5M EG + 1,5M DMSO e lavada para diluição dos crioprotetores. 3 . A terceira foi submetida à ação dos crioprotetores (EG 1,5M; DMSO 1,5M e EG+ DMSO 1,5M), e criopreservada. Em todos os grupos, uma parte da amostra foi submetida ao isolamento dos folículos pré-antrais e o restante foi destinado à análise ultra-estrutural.
Resultado:Após o isolamento dos folículos primordiais (controle), a porcentagem de folículos viáveis foi 78,9%. A percentagem de folículos viáveis apenas na exposição dos crioprotetores 1,5M EG, 1,5M DMSO e 1,5M EG + 1,5M DMSO foi de 77,1%, 68,4% e 60,7% respectivamente. Após a criopreservação foi de 75%, 60% e 55,6% respectivamente. Na análise ultra-estrutural os folículos primordiais oriundos de fragmentos ovarianos frescos ou expostos aos crioprotetores apresentaram morfologia semelhante. No entanto, nas amostras congeladas observou-se alteração das mitocôndrias em todos os grupo. Apesar disso a integridade das demais organelas foi preservada nos folículos criopreservados com EG, enquanto que nos outros grupos (DMSO e associação) foi observado excesso de vesiculação no citoplasma dos oócitos e dilatação da membrana nuclear indicando degeneração.
Conclusão: O Etileno Glicol parece ser o crioprotetor mais adequado para criopreservação do tecido ovariano de ovino.
Palavras-chave: Criopreservação, folículo ovariano, Microscopia Eletrônica de Transmissão
ABSTRACT
Objective: Compare the cryoprotectants Dimethyl Sulphoxide (DMSO), Ethylene Glycol (EG) and their association for cryopreservation of sheep ovarian cortex.
Methodology: Fragments collected from ovaries were divided into 3 parts.
1:One part from sample was destined for analysis of fresh material.
2.The second part was incubated with solution of freezing having 1,5M EG or 1,5M DMSO or 1,5MEG + 1,5M DMSO and washed for dilution of the cryoprotectants.3.The third part was submitted to cryopreservation using the same cryoprotectans (EG 1,5M; DMSO 1,5M and EG + DMSO 1,5M) and cryopreserved. In all groups, one part of sample was submitted to pre-antral follicles isolation and the remainder was destined to ultra-structural analysis.
Results: After isolation of fresh primordial follicles (control), the percentage of viable follicles was 78,9%. The percentage of viable follicles only exposed to cryoprotectants 1,5M EG, 1,5M DMSO and 1,5M EG + 1,5M DMSO was 77,1%, 68,4% and 60,7% respectively. After cryopreservation were 75%, 60% and 55,6% respectively. Ultra-structural analysis of the primordial follicles derived from fresh ovarian fragments or from fragments just exposed to the cryoprotectants showed similar morphology. However, in frozen samples, alterations of mitochondria were observed in all groups. Despite this, the integrity of the remained organelles was preserved in follicles cryopreserved with EG, while that in others groups (DMSO and association) an excess of vacuolizaton in cytoplasm of oocytes and swelling of nuclear membrane was observed indicating degeneration.
Conclusion: The Ehilene Glycol seems to be the cryoprotector more adequated for cryopreservation of sheep ovarian tissue.
Key words: Cryopreservation, ovarian follicle, Transmission Electron Microscopy
INTRODUÇÃO
Recentes avanços no tratamento de câncer por quimioterapia e radioterapia tem melhorado consideravelmente a sobrevivência de pacientes jovens portadoras de câncer. No entanto, estes tratamentos têm efeitos altamente deletérios sobre os ovários causando uma redução severa no número de folículos com alta possibilidade de causar esterilidade (Apperley & Reddy 1995; Sanders et al., 1996). O congelamento de fragmentos de tecido do córtex ovariano antes da realização do tratamento representa uma alternativa viável para preservação da fecundidade. A técnica de criopreservação ovariana envolve o congelamento dos folículos primordiais imaturos in situ em pedaços do córtex ovariano. O folículo primordial contém um oócito que constitui 1% do volume da célula madura, possuem poucas organelas e não tem zona pelúcida ou grânulos corticais, assim eles são potencialmente mais tolerantes a congelamento e descongelamento (Oktay et al., 1998). Acima de tudo isso, existe a vantagem quanto ao número, pois centenas de pequenos folículos podem ser obtidas utilizando um procedimento de biópsia simples ou milhares no caso do ovário total.
Um dos grandes desafios para os profissionais da área de reprodução tem sido em produzir oócitos maduros in vitro a partir destes folículos primordiais criopreservados. Estudos animais têm demonstrado que o tecido ovariano congelado e descongelado pode restaurar a secreção cíclica dos esteróides ovarianos após o autoenxerto (Barros et al., 2001; Petroianu et al., 2006) ou transplante (Prates et al.,2005; Lee, 2005). Gravidez após autoenxerto ovariano congelado tem sido relatada em ratos, camundongos e ovelhas ( Guenasena et al., 1997a; Shaw, 2000; Gosden, 1994). Em 2004, foi descrito o primeiro nascimento após a realização de transplante ortotópico de tecido ovariano humano congelado de uma mulher que teve linfoma de Hodgkin (Donnez, 2004).
A fertilidade pode então ser restaurada por enxerto ovariano ou hipoteticamente, por separação dos folículos primordiais do tecido ovariano descongelado e feito a maturação in vitro, seguido de fertilização in vitro com transferência de embriões. Este procedimento tem sido realizado com sucesso no tecido ovariano fresco de camundongo (Cortvrindt, 1996; Eppig, 1979) mas não foi possível ainda em espécies animais.
O crioprotetor mais utilizado para congelamento folicular utilizado na maioria dos estudos foi o Dimetil Sulfóxido (DMSO)(Guenasena et al., 1997b; Baird et al.,1999).No entanto, poucos são os estudos que comparam a utilização de diferentes crioprotetores. Da mesma forma, os efeitos tóxicos dos crioprotetores, sobre os tecidos não submetidos ao congelamento têm sido pouco estudados. O objetivo principal do trabalho foi comparar diferentes crioprotetores na preservação dos folículos primordiais do tecido ovariano criopreservado. Para tanto, comparouse os crioprotetores Dimetil Sulfoxido (DMSO), Etileno Glicol (EG) e sua associação, para criopreservação de fragmentos do córtex ovariano de ovelha.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta do tecido do córtex ovariano
Foram colhidos 50 ovários ovinos cuja idade dos animais variou de 12 meses a 24 meses em matadouro Suin Quality de São Manoel/SP e lavados e armazenados em soro fisiológico a temperatura ambiente e transportado até o laboratório. No laboratório, os ovários foram tratados com álcool 70% por 30 segundos, lavados por 3 vezes em soro fisiológico e sob condições assépticas, foi retirado todo tecido adiposo envolto com uma tesoura. Em seguida, foi retirada a camada mais externa do ovário (camada cortical onde contém maior número de folículos primordiais) com auxílio de uma lâmina de bisturi. Os fragmentos de 2-3mm obtidos de cada ovário foram divididas em 3 partes:
Uma parte da amostra constituída por 2 porções de fragmentos foi destinada a análise do material fresco, sendo 1 porção dos fragmentos submetida ao processo de isolamento folicular por dissociação mecânica e 1 porção dos fragmentos foi fixada em glutaraldeido a 2,5% para MET.
Na segunda amostra foi submetida ao teste de toxicidade, onde os fragmentos ovarianos foram incubados com as soluções de criopreservação contendo 1,5M de EG ou 1,5M de DMSO ou 1,5M de EG + 1,5M de DMSO. Após a lavagem para diluição dos crioprotetores uma parte foi submetido ao isolamento folicular e a outra para MET.
Finalmente, a terceira porção foi submetida à ação dos crioprotetores (EG 1,5M, DMSO 1,5M e EG+DMSO 1,5M), e criopreservada através da curva convencional (0,3°C/min). Após o descongelamento, uma amostra foi submetida ao isolamento dos folículos pré-antrais e o restante foi destinado à análise ultra-estrutural.
Teste de toxicidade
A fim de avaliar o efeito da toxicidade dos crioprotetores sobre os folículos, os fragmentos foram imersos em solução de meio MEM + 10% SFB + 50ug/gentamicina (meio de manutenção) por 5 minutos e em seguida acondicionados em meio de manutenção contendo 1,5M de EG/ DMSO/EG+DMSO por 10 minutos sendo posteriormente transferidos para solução contendo 1,5M de EG/DMSO/ EG+DMSO + 0,25M de sacarose onde permaneceram por mais 10 minutos a 20ºC.Após completar o período de equilíbrio, os crioprotetores (EG, DMSO e EG+DMSO) foram removidos do tecido ovariano transferindo para o meio de manutenção com 1M de EG/DMSO/EG+DMSO + 0,5M de sacarose por 10 minutos, em seguida para a solução com 0,5M de EG/ DMSO/EG+DMSO + 0,5M de sacarose por 10 minutos. Finalmente, para a solução com 0,5M de sacarose por 10 minutos e por último para o meio de manutenção fresco.
Criopreservação
Após a exposição aos crioprotetores (EG, DMSO e EG+DMSO) nas concentrações e período de equilíbrio utilizados no teste de toxicidade descrito acima, fragmentos de tecido ovariano (n = 10/grupo) foram acondicionados em criotubos de 1,8 ml e colocados num freezer biológico programável pré-resfriados a 20oC. Os criotubos foram resfriados a 2,0°C/min até -9°C; em seguida foi induzido manualmente o “seeding” e mantidos nesta temperatura por 10 minutos. Em seguida, utilizou-se curva de resfriamento de 0,3°C/min até -40°C; 10°C/ min até -140°C sendo finalmente os tubos armazenados em nitrogênio líquido a -196o C durante 2 a 20 dias.
Descongelamento
As amostras foram retiradas do LN2 e mantidos a temperatura ambiente por 20 segundos e a 37°C por 25 segundos, sendo então transferidos para o meio de manutenção acrescido de 1M de EG/DMSO/EG+DMSO + 0,5M de sacarose por 10 minutos. Em seguida para a solução com 0,5M de EG/DMSO/EG+DMSO + 0,5M de sacarose por 10 minutos e finalmente, para a solução com 0,5M de sacarose por mais 10 minutos sendo então incubados em meio de manutenção fresco.
Teste de Viabilidade Folicular
Foi realizado o teste de viabilidade folicular em folículos isolados a frescos, submetidos ao teste de toxicidade e criopreservados. Foram utilizadas 40 amostras por grupo experimental. As amostras foram dissociados mecanicamente. A suspensão foi filtrada por filtros de nylon de 500um e 100um e centrifugada a 400g por 5 minutos. O precipitado foi diluído com 2ml de MB e analisado em microscópio invertido para identificação e contagem dos folículos pré-antrais.A coloração folicular foi feita à temperatura ambiente através da incubação dos folículos com Iodeto de Propídio (IP) e Acridina Orange sobre lâmina histológica permitindo a classificação de acordo com a forma e número das células da granulosa em microscópio fluorescente invertido. O iodeto de propídio cora o DNA de células inviáveis com dano de membrana, fluorescendo em vermelho. A Acridina Orange cora em amarelo-esverdeado as células viáveis com fita dupla de DNA.
Análise Ultra-estrutural
Para análise ultra-estrutural foram fixados 5 fragmentos ovarianos por grupo experimental. Cada um dos fragmentos foi fixado em uma solução de glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato (pH=7,2) e mantidos a 4oC por um período mínimo de 24 horas. As amostras foram pós-fixadas em 1% de tetróxido de ósmio, em solução a 0,1M de tampão cacodilato de sódio por 2 horas a 4oC. Em seguida foram desidratadas em séries decrescentes de etanol (30, 50, 70, 90 e 95), seguidos de 3 banhos de 20 minutos cada em etanol absoluto a temperatura ambiente. O tecido foi embebido em resina Epon-812 e a polimerização realizada a 60oC. O material foi seccionado em secções ultrafinas (60 a 70nm) e montado em grades de cobre (malha 200). As grades foram contrastadas com 4% de acetato de uranila e citrato de chumbo e analisadas em MET (Philips CM100).
Análise estatística
O efeito do crioprotetor sobre a percentagem de folículos normais foi analisado através de ANOVA seguida de teste T usando os dados de dez réplicas. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando P<0,05.
RESULTADOS
Recuperação dos folículos primordiais após o isolamento folicular.
Os folículos pré-antrais isolados variaram em tamanho e aparência. Os folículos primordiais foram caracterizados por um oócito granulado, denso envolto por uma camada de células das granulosas achatadas ou achatadas e cuboides (Figura 1).
Figura 1. Comparação entre um folículo primordial (fp) e 2 oócitos (o) oriundos de folículos antrais
O número médio de folículos primordiais isolados após a exposição aos agentes crioprotetores (EG=21,1; DMSO=18,7 e EG+DMSO=17) mostraram não ser significativa com relação ao tecido ovariano a fresco (23,2).
O número médio de folículos primordiais isolados no tecido fresco (n= 23,2) foi estatisticamente superior ao do tecido criopreservado em EG+DMSO (n=5,9) (P<0,05). Após o processo de congelamento, foi observada diferença no número médio de folículos primordiais isolados entre o EG (n=13,3) e DMSO (n=10,1) em relação ao EG+DMSO (n=5,9).
Teste de Viabilidade Folicular
O teste de viabilidade realizado logo após a colheita mostrou folículos primordiais e primários com poucas células da granulosa lesadas (coradas pelo IP em vermelho), sendo a maioria corada em amarelão-esverdeado pela Acridina Orange, indicando integridade.Os resultados obtidos após apenas a exposição aos agentes crioprotetores (EG=77,1%; DMSO=68,4% e EG+DMSO=60,7%) e após a criopreservação do tecido ovariano (EG=75%; DMSO=60% e EG+DMSO=55,6%) mostraram que em todos os tratamentos a viabilidade folicular foi similar àquela observada no tecido ovariano a fresco (78,9%).Não foi observado diferença morfológica identificável a microscopia de luz entre folículos isolados de tecido a fresco, submetidos a ação dos crioprotetores e congelados-descongelados com EG. No entanto, os folículos criopreservados em DMSO e EG+DMSO apresentaram sinais de degeneração mais freqüentemente.
Análise ultra-estrutural
Os folículos pré-antrais observados tanto no material fresco como nos fragmentos ovarianos somente submetidos a ação dos crioprotetores exibiram um oócito de aspecto saudável circundado por uma ou mais camadas de células da granulosa bem organizadas. O ooplasma continha numerosas mitocôndrias arredondadas ou alongadas apresentando cristas pouco desenvolvidas. Em alguns casos foram observadas mitocôndrias em forma de alteres indicando a multiplicação destas organelas. Complexos de Golgi eram raros, mas bem desenvolvidos. Foi observado retículo endoplasmático liso e rugosos, em agregações isoladas ou associações complexas com mitocôndrias e vesículas. Um número variável de vesículas espalhadas pelo ooplasma também foi notado. Foram visíveis algumas microvilosidades na membrana do oócito e, ocasionalmente, pequenas quantias de material da zona pelúcida. As células da granulosa eram pequenas, com alto índice núcleo:citoplasma. Estas células apresentavam muitas mitocôndrias alongadas, retículo endoplasmático liso e rugoso e Complexo de Golgi, além de algumas vesículas elétron-densas (Figura 2).
Figura 2. Aspecto geral dos folículos pré-antrais intactos observados. A - Folículo primordial oriundo de fragmento ovariano não congelado. Notar o oócito (oc) envolto por células da granulosa (cg) de aspecto achatado.
B - Detalhe da região de contato entre o oócito (oc) e uma célula da granulosa (cg). Microvilosidades (mv) e complexos juncionais (cj) puderam ser vistos na superfície do oócito.
C - Folículo primário oriundo de fragmento ovariano exposto ao Etileno-glicol.
D - Detalhe das mitocôndrias (m) observadas nos folículos tratados com Etileno-glicol.
G = complexo de golgi, l = lipídeo, n = nucléolo, v = vacúolos,
Por outro lado o exame dos folículos pré-antral de fragmentos ovarianos congelados mostrou alterações da morfologia celular. No grupo criopreservado com EG, embora o aspecto geral das organelas fosse semelhante ao descrito anteriormente, observou-se aumento da elétrondensidade da matrix mitocondrial (Figura 3). Alguns oócitos apresentaram concomitantemente mitocôndrias alteradas e mitocôndrias com aspecto normal. Estas mitochôndias enegrecidas apresentavam, via de regra, menor tamanho. Nos folículos criopreservados utilizando-se o DMSO e o EG + DMSO esta característica também foi observada. No entanto, nestes oócitos observou-se uma desorganização de outras organelas caracterizada por vesiculação excessiva no citoplasma, com aumento das cisternas do retículo endoplasmático. Além disso, foi observado regiões de dilatação da membrana nuclear, a qual se apresentou rompida em alguns pontos (Figura 4).
Figura 3. Aspecto geral dos folículos pré-antrais congelados com Etileno-Glicol A - Vista geral de um folículo primário. Notar o aspecto enegrecido das mitocondrias (m) tanto no oócito (oc) como nas células da granulosa (cg) B e C - Detalhe das mitocôndrias (m) observadas nos folículos congelados com Etileno-glicol. Note que algumas mitocondrias intactas (setas duplas) foram vistas em conjunto com mitocondrias lesadas n = nucléolo, v = vacúolos,
Figura 4. Aspecto geral dos folículos pré-antrais congelados com DMSO e EG/DMSO
A - Folículo primordial oriundo de fragmento ovariano congelado com DMSO. Notar o oócito (oc) com presença de grande quantidade de vacúolos (va) em seu interior
B - Detalhe da região perinuclear do oócito de um oócito congelado co DMSO. Notar a dilatação da membrana nuclear (mn), com ponto de ruptura (seta) da membrana da face citoplasmática
C - Folículo primordial oriundo de fragmento ovariano congelado com EG/ DMSO. Notar a presença de inúmeros vacúolos (va).
D - Detalhe das mitocôndrias (m) observadas tanto nas células da granulosa (cg) como no oócito (oc), onde também foi observada a dilatação do retículo endoplasmático liso (rel). n = núcleo
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Neste experimento foram coletados em média 23,2 folículos pré-antrais por fragmento ovariano fresco. Este baixo número está relacionado a metodologia manual de maceração do tecido utilizada associada a maior fibrosidade do tecido ovariano dos animais adultos. Foi observada uma diminuição no número de folículos obtidos após a adição dos crioprotetores, a qual se tornou mais acentuada após a criopreservação. Este fato pode estar associado a uma diminuição dos folículos com morfologia normal nos fragmentos ovarianos após a adição dos crioprotetores e congelamento. Possivelmente os folículos com morfologia alterada tenham se rompido com maior facilidade durante o isolamento mecânico, ou não tenham sido identificados. Durante o teste de viabilidade dos folículos isolados, através da coloração com sondas fluorescentes não foi observada diferenças entre os grupos. Este fato também parece estar associado a uma seleção realizada durante a identificação dos folículos, o que fez com que somente folículos com morfologia normal fossem analisados.
As taxas de viabilidade folicular após a exposição aos agentes crioprotetores (EG=77,1%; DMSO=68,4% e EG+DMSO=60,7%) e após a criopreservação do tecido ovariano (EG=75%; DMSO=60% e EG+DMSO=55,6%) indicam similaridade de todos os tratamentos com o observado no tecido ovariano a fresco (78,9%). Estes resultados concordam as dos obtidos por Newton et al., (1998) que utilizaram 4 tipos de crioprotetores e obtiveram melhores taxas de sobrevida folicular com crioprotetores etileno glicol e dimetil sulfóxido (84% e 74% respectivamente) em relação a propileno glicol e glicerol (44% e 10% respectivamente). Também Aubard et al (1998) obtiveram resultados semelhantes utilizando DMSO ou etileno glicol como agentes crioprotetores, sendo que ambos resultaram em nascimentos de ratos vivos.
Na análise ultra-estrutural os folículos primordiais oriundos de fragmentos ovarianos frescos ou expostos aos crioprotetores apresentaram morfologia semelhante. No entanto, quando foram analisadas as amostras congeladas observou-se alteração das mitocôndrias em todos os grupo, as quais se apresentavam com matriz enegrecida. Wilson et al. (1987) demonstraram que a criopreservação resulta em alterações na mitocôndria, incluindo espessamento de cristas, coalescência da membrana interna e escurecimento do espaço inter-membranoso. Alterações semelhantes foram observadas neste trabalho, nas mitocôndrias dos grupos congelados. Estas mudanças na estrutura mitocondrial poderiam certamente interferir na fosforilação oxidativa, resultando em um aumento no metabolismo da glutamina. O metabolismo da glutamina serve como medida da atividade do ciclo de Krebs, e portanto, da integridade funcional das mitocôndrias (Rieger et al., 1991). O aumento no metabolismo da glutamina, após a criopreservação, pode ainda ser causado por um aumento na demanda de grupos amina para síntese de nucleotídeos, glicoproteínas e proteoglicans, associadas aos mecanismos de reparo (Rieger et al., 1991).
Apesar da alteração observada na mitocôndrias a integridade das demais organelas foi preservada nos folículos criopreservados com EG, enquanto que nos outros grupos (DMSO e associação) foi observado excesso de vesiculação no citoplasma dos oócitos e dilatação da membrana nuclear indicando degeneração. A interação entre lipídeos e proteínas desempenha um papel importante em manter a membrana intacta e funcionalmente ativa e a temperatura é um dos fatores que afetam a difusão dos componentes da membrana. O congelamento celular leva a alterações na distribuição dos fosfolipídeos entre as duas camadas da membrana celular. Os rearranjo dos lipídeos e proteínas de membrana que ocorrem durante a criopreservação induzem á exclusão de partículas intra membranosas em certas áreas e inclusão em outras. Esta mudança estrutural parece provocar modificações de fluidez local (Hinkorska- Galcheva et al., 1989). Além disso, podem ocorrer outros efeitos deletérios como perda de ions e redução da função das “bombas” de ions (De Leeuw et al., 1988). No presente experimento, as alterações encontradas nos folículos congelados com DMSO e EG+DMSO parecem estar associadas um aumento da permeabilidade celular, o que levou ao aumento do espaço perinuclear, edema do retículo endoplasmático e expansão das cisternas do Complexo de Golgi, conferindo ao citoplasma um aspecto vacuolizado.
Os agentes crioprotetores são criosolventes que têm um efeito marcante nas células vivas, protegendo-as contra distorções de sua geometria e do ambiente, bem como, interagindo com sua composição química durante os processos de congelamento e descongelamento. De acordo com Fahy et al. (1986) a magnitude do efeito crioprotetor deve ser grande o bastante para que seu efeito seja significante. Devido a natureza homeostática da célula viva, a perda de até 20% da função de uma determinada organela ou enzima talvez tenha pequenas conseqüências, no entanto, quando ocorrem lesões mais extensas, estas são causadas ou pela ausência de crioproteção ou pela toxicidade do crioprotetor. Neste sentido Baxter and Lathe (1971) relatam que os efeitos tóxicos dos crioprotetores são específicos e estão relacionados com a desestabilização de proteínas. Portanto, os dados observados, no presente experimento, nos folículos criopreservados com DMSO e EG+DMSO pode estar associados tanto a lesão de membrana por baixa eficiência crioprotetora, como com o efeito tóxico dos crioprotetores. Baseado nos resultados obtidos concluiu-se que o processo de criopreservação é detrimental aos folículos ovarianos e que embora todos os crioprotetores testados tenham alterado a morfologia folicular, o Etileno Glicol parece ser o crioprotetor menos lesivo e portanto, mais adequado para criopreservação do tecido ovariano de ovino. Apesar disso, a criopreservação de folículos pré-antrais parece ser uma alternativa interessante para a estocagem de um grande número de oócitos imaturos, já que estes possuem várias características que os tornam menos suscetíveis à crioinjúria do que os oócitos maduros tais como menor tamanho do oócito, baixa taxa metabólica, ausência de zona pelúcida, poucas organelas e pequena quantidade de lipídios.
AGRADECIMENTOS
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), ao abatedouro Suin Quality de São Manoel/SP e aos pós-graduandos do departamento de Reprodução animal da UNESP/Botucatu.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Fahy GM. The relevance of cryoprotectant “toxicity” to cryobiology. Cryobiology 1986; 23:1-13.
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