JBRA Assist. Reprod. 2009;13(3):14-17
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.3.03
Resultados del co-cultivo de embriones sobre células endometriales autólogas en pacientes que realizan un primer procedimiento de reproducción asistida
Resultado do co-cultivo de embriões sobre células endometriais autólogas em pacientes no 1º ciclo de reprodução assistida
The use of autologous endometrial co-culture in patients attempting assisted reproduction (AR) techniques for the first time
Centro Médico FERTILAB, Buenos Aires, Argentina
Trabajo subsidiado por El Fondo tecnológico Argentino, FONTAR
Presentado en el 9º Taller General Red latinoamericana de Reproducción Asistida Contacto: Maria Victoria Eyheremendy. victoriae@fertilab.com.ar
RESUMEN
Objetivos: Analizar el efecto del co-cultivo autólogo endometrial sobre la calidad embrionaria, la tasa de embarazo y la tasa de implantación en pacientes que realizan un procedimiento de reproducción asistida por primera vez.
Métodos: Se analizaron 81pacientes: grupo control 41, grupo de estudio (co-cultivo) 40.La biopsia endometrial se obtuvo 7-10 días luego de la ovulación en algun ciclo previo al tratamiento.. Las células endometriales aisladas, fueron criopreservadas. El día en que la paciente presentó el criterio para HCG las células endometriales son descongeladas y cultivadas. Los cigotos obtenidos fueron cultivados sobre la monocapa de células endometriales hasta el día 3 de desarrollo.
Resultados: En ambos grupos se analizó el porcentaje de embarazo según edad; 1) menores de 35 años control y con co-cultivo: 42% vs 67% (P<0.0001); 2) entre 36 y 39 años control y co-cultivo: 33% vs 61.5% (P<0.0001); 3) mayores de 40 años control y co-cultivo: 28.5% vs 55.5% (P<0.0001). También se evaluaron las causas de infertilidad y se observo una diferencia en el porcentaje de embarazo con co-cultivo en los pacientes que presentaban asociación de factor masculino y femenino como causa de infertilidad: 21% vs 63,6% (P<0.0001).Se observó una diferencia estadísticamente significativa al comparar la tasa de embarazo clínico y la tasa de implantación en ambos grupos: 36% vs 62 % (P<0.0001) y 20 % vs 34 % (P=0.02).
Conclusiones: La utilización de co-cultivo mejora las posibilidades de pacientes en su primer ciclo de reproducción asistida.
Palabras claves: Co-cultivo, endometrio, implantación, embarazo, reproducción asistida.
RESUMO
Objetivos: Analisar o efeito do co-cultivo autólogo endometrial sobre a qualidade embrionária, a taxa de gravidez e a taxa de implantação em pacientes que realizam o procedimento de reprodução assistida pela primeira vez.
Métodos: Foram analisadas 81pacientes: grupo controle 41, grupo de estudo (co-cultivo) 40.A biopsia endometrial se deu 7-10 dias antes da la ovulação en algum ciclo prévio ao tratamento. As células endometriais isoladas foram criopreservadas. No dia em que a paciente apresentou o critério clínico para o HCG, as células endometriais foram descongeladas e cultivadas. Os zigotos obtidos foram cultivados sobre a mono-camada de células endometriais até o dia 3 de desenvolvimento.
Resultados: Em ambos os grupos se analizou a porcentagem de gravidez segundo a idade; 1) menores de 35 anos controle e com co-cultivo: 42% vs 67% (P<0.0001); 2) entre 36 e 39 anos controle e co-cultivo: 33% vs 61.5% (P<0.0001); 3) maiores de 40 anos controle e co-cultivo: 28.5% vs 55.5% (P<0.0001). Também se avaliou as causas de infertilidade e se observou diferença na porcentagem de gravidez com co-cultivo nas pacientes que apresentavam associação de fator masculino e femenino como causa da infertilidade: 21% vs 63,6% (P<0.0001). Observou-se diferença estatísticamente significativa al comparar a taxa de gravidez clínica e a taxa de implantação em ambos os grupos: 36% vs 62 % (P<0.0001) e 20 % vs 34 % (P=0.02).
Conclusões: A utilização de co-cultivo melhora as possibilidades de pacientes em seu primeiro ciclo de reprodução assistida.
Palavras chaves: Co-cultivo, endométrio,implantação gravidez, reprodução assistida.
ABSTRACT
Objective: to study the effect of endometrial cell co-culture (ECC) upon embryo quality, implantation and pregnancy rates (PR) in patients undergoing assisted reproduction treatment (ART) for the first time.
Methods: the population was composed of 81 patients. Forty one underwent conventional ART while 40 employed ECC simultaneously. The endometrial sample was obtained 7-10 days after ovulation in a previous cycle, purified, multiplied in culture and cryopreserved. Thawing was performed on the day of HCG and the embryos cultured on a monolayer of these cells until transfer on day 3.
Results: pregnancy rate for the entire population was 36% for control and 62% for ECC (P<0.001) and implantation rate 20% and 34% respectively (P<0.02)When segregated by age group PR were: below 35 yearsold: control 42% and ECC 67% (P< 0.001); 36 to 39 years-old: 33% and 61.5% respectively (P<0.001); 40 years old and older: 28,5% vs 55.5% (P< 0.001). Regarding the cause of infertility, it was observed that in cases presenting both male and female factors, the results were 21% PR for control and 63,6 for ECC (P<0.001).
Conclusion: The use of ECC improves the possibility of obtaining pregnancy or those patients attempting ART for the first time.
Key-words: co-culture, endometrium, implantation, pregnancy, ART
INTRODUCCION
Trabajos anteriores publicados por otros grupos y por nosotros (Spandorfer et al., 2004, Namita Kattal et al., 2008, Eyheremendy et al., 2007) demostraron el efecto beneficioso del co-cultivo sobre la tasa de implantación y embarazo en pacientes que habían realizado varios intentos previos fallidos de Reproducción Asistida.
Dado el éxito obtenido, la baja agresividad del método adicional empleado y su costo razonable fue que comenzamos este estudio piloto en el cual se comparan los resultados de FIV o ICSI en pacientes que lo intentan por primera vez y a quienes se les ofreció realizar el co-cultivo (CCEA).
Uno de los aspectos más importantes para el éxito de los procesos de reproducción asistida es obtener las condiciones adecuadas para el cultivo de embriones in vitro. Los factores tróficos específicos requeridos para que el embrión in vitro adquiera una capacidad de implantación y crecimiento similar a la que tiene in vivo, aún no son conocidos en su totalidad (Bongso et al., 1991, Bongso et al., 1999, Barnat et al., 1998).
Luego de años de experimentación en cultivo con diferentes especies animales y varios tipos celulares, algunos autores han publicado resultados alentadores del co-cultivo de embriones humanos con células somáticas endometriales, sobre el desarrollo de blastocistos y el aumento de las tasas de embarazo (Javot et al ., 1995. Rubio et al., 2000. Mercader et al., 2003).Ciertas publicaciones incluso manifiestan la obtención de embriones con mayor cantidad de blastómeros y menor porcentaje de fragmentación (Barnat et al., 1998. Barnat et al., 1999) utilizando co-cultivo.
El desarrollo de un sistema donde las pacientes utilicen sus propias células endometriales hace que esta técnica de CCEA sea segura y factible para todas las pacientes. El objetivo de este trabajo es analizar el efecto del cultivo de embriones sobre una capa de células endometriales propias, en pacientes en su primer intento de reproducción asistida, midiendo la calidad embrionaria, la tasa de embarazo y la tasa de implantación
MATERIALES Y METODOS
Población del estudio:
Desde junio de 2007 hasta diciembre de 2008, seleccionamos un grupo 81 pacientes con indicación de Tratamiento de Reproducción Asistida (TRA) por primera vez. En este estudio no se utilizaron gametos donados.Del total de pacientes, 40 optaron por realizar el CCEA y los restantes 41 hicieron el procedimiento convencional (grupo control). Los procedimientos de ambos grupos de pacientes fueron realizadas por el mismo cuerpo medico y de laboratorio en el mismo periodo de tiempo.Métodos de reproducción asistidaLas 81 pacientes fueron tratadas con un protocolo de estimulación con FSH recombinante (a partir de Día 2), en distintas dosis según cada caso, y antagonistas de GnRh (a partir de un folículo de 14mm). La maduración final se indujo con HCG 10.000 UI cuando hubo al menos 3 folículos de 17 mm. La punción folicular se realizó a las 36 hs de la inyección de HCG.El soporte de la fase lútea se realizó con progesterona 600 mg por día vía vaginal. Se realizaron métodos convencionales de FIV o ICSI según la patología del paciente. Los embriones obtenidos fueron transferidos a la paciente a las 72hs de la punción y los excedentes se criopreservaron para una futura transferencia.El criterio utilizado para evaluar la calidad embrionaria es el de Bolton (Bolton et al., 1989) que toma en cuenta la presencia de fragmentos citoplasmáticos y el tamaño y cantidad de blastómeros en embriones de día 2 ó 3: el embrión tipo 4 es el de mejor morfología. Consideramos embriones de buena calidad aquellos con morfología 4 ó 3. Se considera embarazo clínico la presencia de un saco gestacional observado mediante ecografía, luego de cuatro semanas post-transferencia embrionaria.Los resultados se analizan sobre embarazos clínicos solamente.
Cultivo de endometrio
Las células se obtuvieron a partir de una biopsia de endometrio realizada entre 7 y 10 días luego de producida la ovulación, en un ciclo previo al procedimiento de reproducción asistida. El tejido se obtuvo por aspiración endometrial con la cánula externa de un Set de Frydman para transferencia de embriones (Short Frydman Set) (Spandorfer et al., 1998). Luego de separar una pequeña porción para su estudio histológico, el tejido se procesó según el método descripto por Spandorfer (Spandorfer et al., 2000) modificado. En resumen: el tejido se colocó en una cápsula con medio Hank’s (Gibco 2402117) suplementado con Penicilina y Estreptomicina, se cortó en pequeños trozos de 1 a 2 mm y estos fueron tratados con colagenasa al 0.2% (GIBCO 171005) a 37ºC durante 5 minutos con agitación. Este procedimento se realizó 4 veces, separándose los tipos celulares por gravitación : en el precipitado, células glandulares y en el sobrenadante, células estromales y pequeñas glándulas intactas, que fueron luego separadas por gravitación, durante 45 minutos para obtener células estromales purificadas. Se determina vitalidad (Azul Tripan) y recuento celular. Las células se cultivan en medio DMEM(Gibco 11995065) suplementado con suero fetal bovino (Gibco 1027006) durante 7 días a 37ºC y 5% CO2. Al final de este período las células se criopreservan, utilizando como crioprotector DMSO- dimetilsulfóxido (Sigma). El día anterior a la administración de HCG, se descongelan las células estromales y glandulares determinando sobrevida postdescongelamiento. Se cultivan ambos tipos celulares hasta llegar a confluencia. Los embriones se colocan sobre el cultivo en el estadio de pronúcleos. El medio utilizado en esta etapa es ECM (Irvine Scientific) suplementado con HSA (SAGE). Se incuban 72hs hasta la transferencia o criopreservación embrionaria.
Análisis estadístico
Los datos presentados como media y su desviación estándar fueron analizados con un test no paramétrico, Wilcoxon Test, y su significancia con Test de Student.Los datos categóricos fueron comparados utilizando el Test de Fisher.
RESULTADOS
Análisis de la población
La edad promedio de las 41 pacientes control fue 35.6±4.1 años en tanto que la edad de las 40 pacientes que realizaron CCEA fue 35.27±4.63 años.Análisis de la calidad embrionaria, las tasas de implantación y embarazo:La Tabla 1 compara la media del número de ovocitos maduros obtenidos por aspiración, el promedio del número de embriones transferidos, el porcentaje de embriones con calidad tipo 4 y tipo 3, la tasa de embarazo clínico y la tasa de implantación.
Tabla 1. Análisis de la población
Observamos que no existe diferencia en ambos grupos en cuanto a la respuesta a la inducción y a la media de embriones transferidos. Sin embargo la calidad embrionaria de las pacientes control fue menor a la de aquellas que efectuaron CCEA. Como consecuencia la tasa de embarazo y la tasa de implantación también fueron significativamente mayores en las pacientes de CCEA.En la tabla 2 se muestran las diferentes causas de esterilidad en ambos grupos de pacientes y su porcentaje de embarazo clínico.
Tabla 2. Causas de esterilidad y su relación con el porcentaje de embarazo.
Dado el bajo nº de pacientes analizadas y que el tipo y número de las causa de esterilidad fueron estadísticamente no significativas en ambos grupos de estudio, agrupamos los diferentes factores femeninos (FF) y los diferentes factores masculinos (FM) para comparar el porcentaje de embarazo.Los resultados de embarazo fueron mayores en todos los casos con co-cultivo. Pero solo el grupo con factores combinados, como causa de esterilidad, presento una diferencia estadística extremadamente significativa, en el porcentaje de embarazos.En el gráfico 1 se analizan los resultados de la tasa de embarazo según la edad de las pacientes. Encontramos un aumento en la tasa de embarazo en todos los grupos de edades cuando los embriones fueron co-cultivados.
Gráfico 1. Porcentaje de embarazo según la edad de las pacientes
CONCLUSIÓN
La gran mayoría de los trabajos de co-cultivo se han realizado en pacientes que han fallado en uno o más procedimientos de RA, o con el objeto de mejorar el medio de crecimiento embrionario para obtener un mayor numero de blastocistos.
Nuestro trabajo explora que ocurre en pacientes que necesitan reproducción asistida, sin experiencias anteriores, transfiriendo embriones de 72 hs de desarrollo.
En el grupo de pacientes analizadas, se ha detectado una mejora en la calidad embrionaria, a diferencia de lo observado en las pacientes repetidoras (Eyheremendy et a.l, 2007). Esto podría tener relación con los controles utilizados en cada estudio: las pacientes de primera vez no se pueden comparar contra si mismas como ocurre con las pacientes repetidoras.
Cuando analizamos los resultados según la indicación medica para efectuar un TRA, encontramos que el co-cultivo beneficia levemente a aquellas causas de esterilidad relacionadas con los factores masculinos, pero el máximo beneficio se da en las parejas que tienen problemas masculinos y femeninos. Aquí el co-cultivo podría tener un efecto potenciador de la reparación del embrión principalmente cuando las gametas se han formado o almacenado en un ambiente inadecuado.
Aparentemente el cultivo de endometrio proporciona un ambiente mejorado para el desarrollo embrionario (Simon et al., 1995). Esto podría ser la explicar por que tanto pacientes jóvenes como añosas aumentan su tasa de embarazo e implantación en forma significativa con el co-cultivo, dado que han utilizando el mismo medio de crecimiento e idénticas condiciones de laboratorio que el grupo control.
Se han postulado diversos mecanismos de acción del cocultivo :a detoxificación del medio de cultivo por las células de la monocapa (Spandorfer et al., 2004),metabolizacion de glucosa por las células somaticas , regulando su concentración de glucosa a niveles tolerables por el embrión, en sus diferentes etapas y la secreción de sustancias embriotróficas, por ejemplo el TGF-a (Transforming Growth Factor), TGF-b1 epidermal growth factor, PDGF-a (Platelet Derived Growth Factor) e IGF-I y II (Insulin Like Growth Factor) y GMC-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor) que tienen un efecto directo sobre el desarrollo embrionario. (Namita Kattal et al., 2008. Spandorfer et al., 2008. Spandorfer et al., 2001).
Es importante destacar la importancia del momento del ciclo de la paciente en que se toma la biopsia endometrial (Barnat et al., 2002). Algunas publicaciones reportan que los cocultivos originados de células endometriales obtenidas entre el día 5 y 12 después de la ovulación producen embriones con mejor tasa de implantación que los obtenidos en otros momentos del ciclo.
Nuestros resultados, si bien preliminares debido al pequeño número de pacientes analizadas, demuestran que la técnica de co-cultivo mejora las posibilidades de embarazo en pacientes que realizan tratamientos de reproducción asistida por primera vez.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Barmat LI, Liu HC, Spandorfer SD, Veek l, Damario M, Rosenwaks Z : Human preembryo development on autologous endometrial coculture versus conventional medium. Fertil Steril 1998; 70: 1109 - 1113.