JBRA Assist. Reprod. 2009;13(3):18-20
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.3.04
Divisão de Reprodução Humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher, Hospital Pérola Byington, São Paulo
RESUMO
Objetivos: Avaliar a eficiência da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) de resgate em oócitos não fertilizados com a técnica de fertilização in vitro (FIV) convencional.
Métodos: Foram avaliadas, de janeiro de 2004 a julho de 2008, 46 pacientes submetidas a FIV convencional que tiveram ausência total de fertilização, no Centro de Referência de Saúde da Mulher. Os oócitos em metáfase II foram submetidos a reinseminação por ICSI, e os resultados foram avaliados.
Resultados: Em 661 ciclos de FIV realizados em casais sem fator masculino, falha completa de fertilização foi observada em 46 pacientes (6,95%). A idade média das pacientes foi de 35,9 anos. Entre 240 oócitos coletados, 204 eram MII (85%), e a ICSI de resgate foi realizada em 176 oócitos, aproximadamente 24 horas após a FIV inicial. Após a ICSI de resgate observou-se taxa de fertilização de 60,23% (n=106) e taxa de clivagem de 62,23% (n=66). A transferência de embriões foi realizada em 24 pacientes (52,17%). Duas gestações clínicas (saco gestacional com batimentos cardíacos) foram obtidas (8,33%), que resultaram em nascidos vivos. A taxa de implantação foi de 3%.
Conclusões: Apesar do limitado sucesso na taxa de implantação (3,0%) observado neste estudo, as taxas de fertilização (60,23%) e de clivagem (62,23%) sugerem que a ICSI de resgate após falha de FIV convencional pode ser um procedimento aceitável para evitar o cancelamento do ciclo. Postula-se que a ICSI de resgate associada ao diagnóstico genético pré-implantacional, que não foi feito neste estudo, possa melhorar os resultados do procedimento.
Palavras chave: ICSI de resgate, FIV, falha de fertilização.
ABSTRACT
Objectives: The aim of this investigation is to evaluate the efficacy of rescue ICSI in mature oocytes after complete fertilization failure in conventional IVF.
Methods: We retrospectively evaluated the outcomes of reinsemination by ICSI in 46 patients who underwent conventional IVF cycles and who showed complete and unexplained fertilization failure, at the Women’s Health Reference Center IVF Unit, São Paulo, Brazil, from January 2004 to July 2008.
Results: Among 661 IVF cycles performed in couples without male factor, complete fertilization failure was observed in 46 patients (6.95%). The mean age of these patients was 35.9 years. Among 240 oocytes retrieved, 204 were MII (85%) and rescue ICSI was performed in 176 oocytes, approximately 24 hours after the initial IVF procedure. After rescue ICSI, the rates of fertilization and cleavage were 60.23% (n = 106) and 62.23% (n = 66), respectively. The embryo transfer was performed in 24 patients (52.17%). Two single clinical pregnancies (gestational sac with heartbeats) were achieved (8.33%), both of which resulted in live births. The implantation rate was 3.0%.
Conclusions: Despite the limited success of rescue ICSI in terms of implantation rate (3.0%) observed in this study, the rates of fertilization (60.23%), cleavage (62.23%) and clinical pregnancy (8.33%) suggest that emergency rescue ICSI after complete failure in conventional IVF can be performed in order to avoid cycle cancellation. It remains to be determined whether rescue ICSI in combination with preimplantation genetic diagnosis, which was not carried out in our study, would furthermore improve the results of this procedure.
Key words: rescue ICSI, IVF, failure of fertilization.
INTRODUÇÃO
A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) foi introduzida inicialmente, em casos de fator masculino grave de infertilidade, que não podiam ser beneficiados pela FIV convencional (Palermo et al.,1992, van Steirteghem et al., 1993, 1998). Atualmente, muitos serviços realizam a ICSI rotineiramente, enquanto outros grupos preferem a fertilização “in vitro” (FIV) convencional para os casos onde o fator masculino não se reveste de gravidade acentuada. A falha total de fertilização após FIV convencional, nos casos em que os espermatozóides apresentam-se com número, motilidade e morfologia adequados para tal técnica, é uma das mais frustrantes experiências para o casal infértil, bem como para a equipe de reprodução assistida. Uma alternativa, ainda mal avaliada, apesar de introduzida há mais de dez anos (Sjogren et al., 1995; Tsirigotis et al., 1995), seria a reinseminação dos oócitos não fertilizados por ICSI, conhecida como ICSI de emergência ou ICSI de resgate. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência da ICSI de resgate nos casos de falha total da FIV convencional, observando-se as taxas de fertilização, clivagem, gravidez e implantação.
MÉTODOS
Foram avaliados, retrospectivamente, os resultados da reinseminação por ICSI em 46 pacientes que apresentaram falha total de fertilização após FIV convencional, no setor de reprodução humana do Centro de Referência de Saúde da Mulher, em São Paulo, entre janeiro de 2004 a julho de 2008.
Estimulação Ovariana e Captação Oocitária
Todas as pacientes foram submetidas a protocolo de estimulação ovariana controlada com bloqueio longo do eixo hipotálamo-hipofisário mediante a administração de análogo agonista do GnRH na forma de depósito (acetato de leuprolide 3,75 mg) entre o 18o e 22o dia do ciclo menstrual. A partir de janeiro de 2008, o protocolo foi modificado, passando-se a utilizar meia ampola de leuprolide para o bloqueio (1,875 mg). Após 14 a 20 dias do bloqueio, iniciou-se a estimulação ovariana, através da administração diária de 150 UI de gonadotropinas urinárias ou recombinantes (Gonal F→ Serono, Brasil; Puregon→, Organon, Brasil; Merional→, Meizler, Brasil) em pacientes com menos de 35 anos, e 225 ou 250 UI de gonadotropinas urinárias ou recombinantes em pacientes com 35 anos ou mais. O desencadeamento da maturação folicular final foi realizado com 5.000 UI de gonadotropina coriônica humana (hCG), na presença de folículos com diâmetro máximo ≥ 17 mm. A aspiração folicular foi realizada por via ultrassonográfica, sob sedação, 35-36 horas após o hCG.
Preparo de sêmen
O sêmen foi coletado por masturbação, após 2 a 5 dias de abstinência sexual, em frascos estéreis. O frasco com ejaculado foi colocado sobre placa aquecida (37°C) e examinado após liquefação de 30 minutos. Foram analisadas através da luz do microscópio (Nikon E200) amostras de 5 μL de sêmen em câmara de Makler, para concentração (≥20 milhões de espermatozóides/mL) e motilidade (≥50% A+B) espermática. O processamento do sêmen foi realizado com a técnica de gradiente descontínuo de densidade, Isolate (Irvine Scientific). Após o preparo do sêmen, a amostra foi utilizada para FIV convencional e posteriormente, para ICSI de urgência, quando houve falha de FIV convencional.
Fertilização in vitro convencional
Os oócitos foram lavados e colocados em placa Nunc (Falcon), com meio de cultivo HTF suplementado com 10% soro sintético substituto (Irvine Scientific) e deixados em incubadora com 5,5% de CO2 e temperatura a 37°C. Após 3-4 horas de incubação, foram inseminados com 150 mil espermatozóides para cada oócito e colocados novamente em incubadora. A fertilização foi avaliada após 18 horas da inseminação, com a remoção das células do complexo cúmulus-corona do oócito com um delicado capilar afilado. A ausência dos dois pró-núcleos e do segundo corpúsculo polar no espaço perivitelíneo, foram provas de que a fertilização não ocorreu. Então a ICSI foi realizada nos oócitos em que houve falha de fertilização, e que se apresentavam em estágio de metáfase II.
ICSI
Os oócitos em metáfase II foram micro injetados imediatamente após a observação da falha de fertilização. A técnica de ICSI foi realizada em microscópio invertido (Nikon) com aumento de 400 vezes equipado com óptica de Hoffman e micro manipulador Narashige (Narashige, Japão) utilizando micropipeta holding e micro agulha injection (Humagen Fertility Diagnostics, USA). Para realizar a ICSI, uma placa de cultura foi preparada com três a quatro gotas centrais de 4μL de polivinilpirrolidone (PVP) (Irvine Scientific) e cinco gotas de 5μL HTF com hepes suplementado com 10% de soro sintético substituto (Irvine Scientific). Toda a placa foi coberta com óleo mineral (Irvine Scientific). Em duas gotas de PVP foram colocados 1μL da amostra de sêmen preparadas no dia da FIV convencional. Os oócitos foram colocados nas gotas de HTF com hepes suplementado com 10% de soro sintético substituto e então foi realizada ICSI. A micropipeta de injeção foi primeiramente introduzida em uma gota limpa de PVP para eliminar o óleo mineral que se introduziu por capilaridade. A seguir, foi colocada na gota de PVP com espermatozóides, selecionando nela um espermatozóide móvel, com aspecto morfológico normal e imobilizando-o mediante pressão e aspirando-o pela cauda. O oócito a ser injetado foi posicionado com uma ligeira sucção através da micropipeta holding, com o corpúsculo polar na posição 6 ou 12 horas, evitando-se desta forma que a pipeta de injeção transpasse a placa metafásica. Com o oócito posicionado corretamente, a micropipeta de injeção com o espermatozóide foi colocada próxima do oócito, atravessando a zona pelúcida e a membrana, até a micropipeta chegar no centro do ooplasma, onde com uma ligeira aspiração foi comprovado o rompimento da membrana, assegurando a presença do espermatozóide no interior do ooplasma. Após depositar o espermatozóide com a menor quantidade de PVP possível, delicadamente a micro agulha foi retirada do oócito e em seguida foi liberado pela micropipeta. A fertilização dos oócitos foi avaliada 18 horas após a ICSI de resgate. As clivagens foram avaliadas 48 e 72 horas após a realização da ICSI.
RESULTADOS
Em 661 ciclos de FIV realizados em casais sem fator masculino grave, falha total de fertilização foi observada em 46 pacientes (6,95%). A média de idade das mulheres foi de 35,9 anos. Em 240 oócitos coletados (média: 5,2 por paciente), 204 (85%) encontravam-se em metáfase II (MII). A ICSI de resgate foi realizada em 176 oócitos, aproximadamente 24 horas após a falha inicial da FIV, obtendo-se fertilização em 106 oócitos (60,23%), e observando-se clivagem em 66 (62,23%). Foram realizadas transferências embrionárias em 24 mulheres (52,17%), com uma média de 2,75 embriões por paciente; o número de embriões transferidos variou de um a quatro. Houve duas gestações clínicas (sacos gestacionais únicos com batimentos cardíacos observados), que resultaram em nascidos vivos. A taxa de gravidez por transferência foi de 8,33%, e a taxa de gravidez entre as 46 pacientes que se submeteram à ICSI de resgate foi de 4,35%. A taxa de implantação foi de 3,0%.
DISCUSSÃO
Dados da literatura referem taxa de falha de FIV convencional entre 10 e 25% (Chen et al., 1995; Kuczynski et al., 2002). Nossos resultados revelam falha total de fertilização em 6,95% dos casos sem fator masculino grave. A falha de fertilização nesses casos pode estar relacionada com fatores hormonais decorrentes do protocolo de estimulação ovariana utilizado (Benadiva et al., 1999), defeitos nos espermatozóides (Kruger et al., 1988; Liu & Baker, 2000), distúrbios na interação espermatozóideoócito e anormalidades oocitárias (Bedford & Kim, 1993; Van Blerkom et al., 1994; Zhivkova, 2003). A ausência de fertilização pressupõe anormalidades nos oócitos ou nos espermatozóides. Quando o sêmen se apresenta dentro dos parâmetros normais segundo o critério de avaliação, um defeito morfológico não observado pode estar presente (Kruger et al., 1988). A zona pelúcida do oócito desempenha um importante papel na barreira fisiológica e seleção dos espermatozóides morfologicamente normais. Liu & Baker (2000) confirmaram que a presença de anormalidade espermática é o fator mais frequente, contribuindo para o defeito na penetração e interação espermatozóide-zona pelúcida. Entretanto, Bedford & Kim (1993) sugerem que anormalidades no oócito podem determinar resistência na zona pelúcida à passagem de espermatozóides, causando um bloqueio que pode ser a principal causa da falha de fertilização. A incapacidade de espermatozóides aparentemente competentes para penetrar na zona pelúcida foi frequentemente associada com anomalias do ooplasma (um ou mais prónucleos, com um ou nenhum corpúsculo polar, e outras anormalidades ocasionais). Observaram, estes autores, que anomalias em 79,4% dos oócitos não fertilizados; por outro lado, 27,4% dos oócitos não fertilizaram devido a defeitos espermáticos.
Dados da literatura referem o sucesso da ICSI de resgate após falha de FIV convencional. As taxas de fertilização e gestação relatadas variam entre 24-48% e 6-20%, respectivamente (Sjogren et al., 1995; Tsirigotis et al., 1995; Morton et al., 1997; Yuzpe et al., 2000). Ressalte-se que Pehlivan et al. (2004) não recomendam a ICSI de resgate, em virtude de terem encontrado alta taxa de anormalidades cromossômicas nos embriões obtidos. DeUgarte et al. (2006) registram que a combinação de ICSI de resgate com diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) poderia contornar esse problema e promover uma gravidez normal. Chen & Kattera (2003), em estudo utilizando a ICSI após 22 horas em oócitos com falha de FIV convencional, apresentaram taxa de fertilização de 48,5% e 5% de gestação. Esfandiari et al. (2008) relatam gravidez gemelar obtida após ICSI de resgate em oócitos de morfologia anormal não fertilizados por FIV convencional. Em nossos resultados, observamos taxas de fertilização (60,23%, n=53) e clivagem (62,23%, n=33), e duas gestações, que evoluíram para o termo (8,33%). A taxa de implantação obtida foi de apenas 3%. As baixas taxas de gravidez e implantação indicam que pode estar presente algum defeito intrínseco ou de desenvolvimento dos oócitos em casos de falha de fertilização após FIV com sêmen normal. Alterações oocitárias decorrentes do atraso da fertilização é provavelmente uma das razões para os maus resultados. Podemos concluir que, apesar do limitado sucesso na taxa de gestação (8,33%) confirmado neste estudo, as taxas de fertilização (60,23%) e de clivagem (62,23%) sugerem que realizar a ICSI após falha de FIV convencional pode ser um procedimento aceitável no laboratório de fertilização in vitro, evitando-se o cancelamento da transferência embrionária. A associação da ICSI de regate com técnicas de PGD, que não foram utilizadas neste estudo, pode contribuir para a melhora dos resultados finais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bedford JM, Kim HH. Sperm/egg binding patterns and oocyte cytology in retrospective analysis of fertilization failure in vitro. Hum Reprod. 1993; 8: 453-63.