JBRA Assist. Reprod. 2009;13(3):26-29
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.3.06
Uso dos marcadores da reserva e variáveis da resposta ovariana à estimulação gonadotrófica como preditores da implantação embrionária em ciclos de ICSI
Use of ovarian reserve markers and variables of response to gonadotropic stimulus as predictors of embryo implantation in ICSI cycles
1Setor de Reprodução Humana, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo
2Genesis - Centro de Assistência em Reprodução Humana, Brasília, Distrito Federal
Não houve ou há conflitos de interesse para a divulgação deste trabalho.
RESUMO
Objetivo: Avaliar a capacidade preditiva da implantação embrionária dos marcadores de reserva folicular e das variáveis da resposta ovariana ao estímulo com gonadotrofinas exógenas em ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
Métodos: Foram prospectivamente avaliados 45 ciclos de ICSI em mulheres com idade ≤ 38 anos, ciclos menstruais regulares, sem patologias endócrinas ou endometriose, com fator masculino exclusivo, com ambos os ovários e sem tratamento hormonal recente. A reserva ovariana foi inferida pelas dosagens basais dos hormônios anti-mülleriano (AMH), estradiol (E2) e folículo estimulante (FSH) e a resposta ao estímulo, pela contagem dos folículos dominantes no dia da hCG, do total de oócitos aspirados e de oócitos morfologicamente maduros. Curvas Receiver Operating Characteristic (ROC - AUC) foram traçadas para avaliação da capacidade discriminatória de cada variável em identificar implantação embrionária.
Resultados: nenhum dos marcadores de reserva ovariana apresentou capacidade discriminatória significativa de implantação embrionária. Entre as variáveis de resposta ovariana, foram significativas as capacidades discriminatórias do número de folículos dominantes no dia da hCG (ROC-AUC = 0,748; p < 0,01) e do número total de oócitos aspirados (ROC-AUC = 0,665; p < 0,05).
Conclusões: A avaliação da resposta ovariana a partir da contagem de folículos dominantes no dia de administração da hCG e do total de oócitos aspirados parece trazer alguma perspectiva quanto à predição da implantação embrionária em mulheres submetidas a ICSI.
PALAVRAS-CHAVE: Infertilidade, ICSI, Reserva Ovariana, Resposta Ovariana, Reprodução Assistida, FSH, AMH, Estradiol.
ABSTRACT
Objective: To evaluate the potential to predict embryo implantation from endocrine markers of follicular reserve and variables of ovarian response to exogenous gonadotropic stimulus in cycles of intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
Methods: We prospectively evaluated 45 ICSI cycles in women with 38 years of age or less, regular menstrual cycles, with no endocrine diseases or endometriosis, with male factor of infertility, with both ovaries and no recent hormonal treatment. Ovarian reserve was assessed by basal measurements of estradiol, folliclestimulating hormone and anti-müllerian hormone, and ovarian response to stimulus was assessed by dominant follicles count in the day of hCG administration, total number of oocytes retrived from follicular aspiration and the number of morphologically mature oocytes retrieved. Receiver Operating Characteristic curves (ROC - AUC) were obtained to determine discriminatory capacity of each variable to identify embruo implantation.
Results: None of ovarian reserve markers presented significant capacity to predict embryo implantation. Among the variables of ovarian response, we observed significant capacity of dominant follicles in the day of hCG administration (ROC-AUC = 0,748; p < 0,01) and of the total number of oocytes retrieved (ROC-AUC = 0,665; p < 0,05) to assess embryo implantation.
Conclusions: The evaluation of ovarian response by dominant follicles count in the day of hCG the total number of oocytes retrieved seems to be of good perspective in regard to prediction of embryo implantation in women submitted to ICSI.
KEYWORDS: Infertility, ICSI, Ovarian Reserve, Ovarian Response, Assisted Reproduction, FSH, Estradiol, AMH.
INTRODUÇÃO
O aumento na prevalência dos quadros de infertilidade e a procura cada vez maior por técnicas de reprodução assistida (TRA) exigem da equipe assistencial esforços contínuos na melhoria do aconselhamento, o que inclui estimativas das chances de gestação. Conquanto não garanta o “bebê em casa” de fato, o diagnóstico hormonal de gestação pode sinalizar tratamento bem sucedido, mas os marcadores propedêuticos atualmente disponíveis não são efetivos nessa predição (Broekmans et al., 2006; Carvalho et al., 2008).
A falta de uniformidade na caracterização do que seria a resposta ovariana adequada ao estímulo em TRA é um dos principais fatores para a dificuldade em se determinar um bom preditor de sucesso no tratamento; é possível, contudo, que não os marcadores de reserva, mas as variáveis da resposta ovariana estejam melhor relacionadas aos resultados em TRA, traduzindo a saúde oocitária necessária à formação de embriões de boa qualidade.
Seja para a resposta avaliada pelo crescimento folicular (Jenkins et al., 1991; Evers et al., 1998), seja para as distintas contagens de oócitos aspirados após estímulo (Bancsi et al., 2002; Elgindy et al., 2008; Klinkert et al., 2005; La Marca et al., 2007; Luna et al., 2008), não encontramos na literatura, contudo, bastantes estudos associando-os à ocorrência de gestação após TRA, ainda que elementos sinalizadores da boa resposta, como a contagem de folículos antrais, tenham sido, de algum modo, relacionados ao sucesso gestacional (Muttukrishna et al., 2005).
O objetivo deste estudo, assim, foi avaliar e comparar as capacidades dos marcadores endócrinos da reserva folicular e das variáveis da resposta ovariana ao estímulo com gonadotrofinas exógenas de predição da ocorrência de gravidez em ciclos de TRA de alta complexidade.
METODOLOGIA
A. Casuística
Entre junho de 2006 e fevereiro de 2008, foram prospectivamente avaliados 278 ciclos consecutivos de indução de ovulação para procedimentos de reprodução assistida no serviço de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A execução deste estudo foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição e todas as pacientes assinaram termo de consentimento livre e esclarecido concordando com o uso dos dados obtidos dos ciclos de TRA a que se submeteram em pesquisa.Os critérios de inclusão neste estudo foram: (1) infertilidade primária ou secundária, associada exclusivamente a fator masculino; (2) idade ≤ 38 anos; (3) ciclos menstruais com 23 a 32 dias de duração; (4) presença de ambos os ovários; (5) ausência de doenças endócrinas com possível efeito deletério sobre a função reprodutiva (doenças tireoidianas, hiperprolactinemia, anovulação hiperandrogênica, alterações do metabolismo glicídico); (6) ausência de endometriose confirmada por videolaparoscopia diagnóstica realizada nos doze meses antecedentes ao início do estudo; (7) eleição da técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI); (8) ausência de tratamento hormonal nos três meses antecedentes à inclusão no estudo.Preencheram os critérios de inclusão 50 ciclos, tendo sido posteriormente excluídos do estudo 3 ciclos em cujas pacientes apresentavam antecedente de cirurgia ovariana com perda tecidual (em razão da possível interferência negativa sobre a reserva folicular ovariana) e 2 ciclos em cujas pacientes apresentavam volumosos cistos ovarianos de aspecto folicular à ultrassonografia transvaginal basal. Como casuística final do estudo, foram estudados, assim, 45 ciclos consecutivos de ICSI.
B. Avaliação da reserva ovariana
Foram coletadas amostras de sangue entre o 3º e o 5º dia do ciclo menstrual prévio ao início da indução de ovulação. Após serem centrifugadas, os respectivos soros foram armazenados em temperatura de -70°C para dosagem em único momento dos níveis basais do hormônio folículo-estimulante (FSH), do estradiol (E2) e do hormônio anti-mülleriano (AMH). O E2 basal foi determinado por quimioluminescência (Immulite 2000, DPC, USA), com coeficiente de variação intra-ensaio de 2,95%. O FSH basal foi determinado por quimioluminescência (Immulite 2000, DPC, USA), com coeficientes de variação interensaios de 2,9% a 4,2% e intra-ensaio de 4,2%. A dosagem do AMH basal foi realizada por teste imunoenzimático ultrassensível - ELISA (Immunotech Inc, France), com coeficientes de variabilidade inter e intra-ensaios de 14,2% e 12,3%, respectivamente.
C. Protocolo de tratamento
Todas as pacientes iniciaram uso de contraceptivo hormonal oral combinado (COC) após a coleta das amostras de sangue. Na fase médio-luteal do ciclo imediatamente antecedente à data programada para início do tratamento, iniciava-se a inibição hipofisária pela administração subcutânea diária de 10 UI acetato de leuprolida (Lupron® - Abbott). Após 10 dias de uso do análogo do GnRH, suspendia-se o uso do COC e, com a ocorrência do fluxo menstrual, realizava-se a avaliação ultrassonográfica basal bidimensional por aparelho ATL HDI 3000 (ATL Ultrasound, Bothel, WA, USA), com sonda endovaginal na frequência de 4,0 a 9,0 MHz.A estimulação ovariana era iniciada após a avaliação ultrassonográfica, com doses diárias de folitrofina recombinante (Gonal-F® - Merck Serono, Germany) ou de gonadotrofina pós-menopausal purificada (Menopur® - Ferring Pharmaceuticals, Switzerland), com monitoração ultrassonográfica endovaginal a partir do sétimo dia de tratamento e, quando necessário, reajuste individualizado das doses por protocolo step-down. A administração subcutânea da gonadotrofina coriônica recombinante (hCG-r) (Ovidrel® - Merck Serono, Germany), em dose única de 250μg para indução de ovulação, era realizada quando dois ou mais folículos dominantes monitorados atingiam diâmetro médio ≥ 18 mm. A aspiração folicular para captação oocitária era realizada pela via endovaginal, 36 horas após a administração da hCG-r.
D. Avaliação da resposta ovariana
A resposta ovariana à estimulação foi aferida a partir: (a) do número de folículos com diâmetro médio ≥ 18 mm no dia de administração da hCG (folículos dominantes); (b) do número total de oócitos aspirados 36 horas após a administração da hCG; e (c) do número de oócitos morfologicamente maduros (presença de um corpúsculo polar extruso) aspirados 36 horas após a administração da hCG.
D. ICSI, transferência embrionária e diagnóstico de gravidez
Após período de incubação de 2 a 6 horas e banho de 30 a 60 segundos em solução de hialuronidase, procedia-se a remoção desta e das células do cumulus, e classificação dos oócitos quanto ao grau de maturação; em todos os casos, a ICSI foi realizada nos oócitos morfologicamente maduros. A ocorrência da fertilização foi confirmada em tempo de 14 a 20 horas após a ICSI, pela presença de dois pró-núcleos e dois corpúsculos polares.As transferências embrionárias (TE) foram realizadas utilizando-se cateter do tipo Frydman, no segundo dia (D2) ― para os casos com até três embriões obtidos ― ou terceiro dia (D3) após a ICSI, adotando como critérios para escolha dos melhores embriões o número de células (quatro células em D2, oito células em D3), a simetria entre os blastômeros e a taxa de fragmentação destes. Em nenhum dos casos houve transferência de quantidade superior a três embriões.O diagnóstico de gravidez foi realizado pela dosagem sérica da β-HCG no 14º dia após a realização da TE.
E. Análise estatística
As capacidades para predição da implantação embrionária dos marcadores de reserva e resposta ovariana foram aferidas a partir do traçado de curvas tipo Receiver Operating Characteristic (ROC), a partir das quais se estabeleceram as áreas sob as curvas (ROC-AUC), valores de corte, sensibilidade e especificidade. Para tanto, utilizou-se o programa MedCalc versão 9.3.7.0 (2007), considerando-se ROC-AUC = 1,0 resultado da perfeita capacidade do teste para predizer a ocorrência de gestação e ROC-AUC = 0,5 resultado da ausência completa de tal capacidade discriminatória. A significância dos resultados foi estabelecida pelo α = 0,05. Por se tratar de análise retrospectiva de prontuários referentes a todos os ciclos de TRA realizados no período selecionado, não foi realizado cálculo amostral.
RESULTADOS
A idade média das pacientes incluídas no estudo foi de 33,33 ± 4,4 anos (variação de 24-38 anos) e o índice de massa corporal (IMC) médio, de 24,11 ± 3,73 kg/ m2. Para estimulação, a dose média de FSH recombinante utilizada foi de 2015 ± 710 UI. Os níveis médios dos marcadores basais de reserva ovariana foram: E2 = 64,85 ± 89,13 pg/mL; FSH = 6,56 ± 2,56 UI/mL; e AMH = 14,74 ± 12,67 pmol/L. Após o estímulo, houve o crescimento médio de 4,1 ± 2,56 folículos dominantes e foram aspirados em média 9,0 ± 5,9 oócitos, sendo 5,38 ± 3,14 oócitos morfologicamente maduros.
A partir das curvas traçadas para E2 (ROC-AUC = 0,59; p > 0,05), FSH (ROC-AUC = 0,504; p > 0,05) e AMH (ROC-AUC = 0,532; p > 0,05), não observamos capacidade de predição de gravidez para os marcadores de reserva ovariana. Entre as modalidades de resposta ovariana ao estímulo gonadotrófico exógeno, o número de folículos dominantes no dia de administração da hCG foi a mais significativamente capaz de predizer a ocorrência de gestação (ROC-AUC = 0,748; p < 0,01), com sensibilidade de 73,7 % e especificidade de 70,8% para contagens superiores a três unidades. O número total de oócitos aspirados também apresentou capacidade preditiva de gestação (ROC-AUC = 0,665; p < 0,05), mas com sensibilidade e especificidade menos expressivas (Tabela 1). As áreas sob as curvas para variáveis de reposta ovariana estão representadas na Figura 1.
Tabela 1. Capacidade de predição de gestação de marcadores de reserva e resposta ovariana em ciclos de ICSI.
Figura 1. Áreas sob as curvas do tipo Receiver Operating Characteristic (ROC-AUC) para folículos ≥ 18 mm no dia da hCG (dominantes), total de oócitos aspirados e oócitos maduros aspirados.
DISCUSSÃO
Com este estudo, sugerimos que a contagem de folículos dominantes no dia da administração da hCG e o número total de oócitos aspirados podem predizer a ocorrência da implantação embrionária em ciclos de ICSI, o que não se observa para marcadores da reserva ovariana ou número de oócitos morfologicamente maduros.
O papel dos marcadores séricos da reserva ovariana na predição de sucesso em ciclos de reprodução assistida tem sido questionado e não existe um consenso sobre a verdadeira aplicabilidade dos diversos marcadores na prática clínica. Quanto à capacidade de predizer especificamente a ocorrência de gestação, vários estudos encontrados não foram capazes de suportar utilidade para marcadores como E2 (Scott et al., 1989; Licciardi et al., 1995; Smotrich et al., 1995), FSH (van Montfrans et al., 2000; Klinkert et al., 2005; van der Steeg et al., 2007; Luna et al., 2007) e AMH (Gnoth et al., 2008).
No caso do FSH basal, um dos marcadores mais estudados para propedêutica em TRA (Silberstein et al., 2006), Watt et al. determinaram valor de corte basal de 11,1 mUI/ mL, acima do qual não ocorreria gestação; não avaliaram, contudo, a resposta folicular propriamente dita e por se tratarem de ciclos de FIV, alterações no espermograma podem ter interferido negativamente nos resultados (Watt et al., 2000). Ashrafi et al., por sua vez, constataram que mulheres submetidas a FIV apresentando níveis de FSH ≥ 15 UI/mL tiveram menos oócitos aspirados e maior número de ciclos cancelados (Ashrafi et al., 2005), concordando com os resultados de Klinkert et al., que sugeriram taxas menores de gestação (mas sem significância) para os níveis referidos (Klinkert et al., 2005).
Embora os estudos mencionados tenham sugerido que FSH ≥ 15 UI/mL esteja relacionado diretamente ao mau prognóstico de gravidez em TRA, a ocorrência de gravidez foi demonstrada em aproximadamente metade das mulheres com FSH > 12,5 UI/L (van Montfrans et al., 2000) e Luna et al. demonstraram que as taxas de gravidez em mulheres < 35 anos e FSH basal elevado foram melhores que as de mulheres mais velhas, com níveis normais da gonadotrofina (Luna et al., 2007), reforçando que a idade é superior ao hormônio como ferramenta propedêutica.
É plausível acreditar que a resposta ovariana ao estímulo gonadotrófico exógeno apresente capacidade de predizer a ocorrência de gestação superior à apresentada por marcadores de reserva ovariana ou características da paciente. Infelizmente, estudos fazendo essa avaliação são escassos na literatura. Roest et al. demonstraram que o sucesso em ciclos de fertilização in vitro (FIV) está melhor relacionado à qualidade da resposta ao estímulo que à idade da mulher (Roest et al., 1996). Acreditamos no desenvolvimento folicular como o principal variável de resposta ovariana ao estímulo exógeno e, assim, na sua adoção como um dos principais critérios de sucesso em RA, por não sofrer interferências de eventuais dificuldades na aspiração oocitária ou perdas de oócitos durante o esvaziamento do cateter e a manipulação laboratorial. Nosso estudo corrobora nossa crença ao demonstrar que o número de folículos dominantes realmente pode predizer a ocorrência de implantação embrionária em ciclos de ICSI; mas não contradiz a tendência atual de se considerar o número de oócitos aspirados como critério de sucesso em ciclos de RA, já que houve significância da capacidade dessa variável na predição da implantação, embora com ROC-AUC pouco expressiva. Discordando dos nossos dados, o estudo retrospectivo de Ng et al. apontou taxas de implantação e gestação independentes do número de folículos dominantes no dia de administração da hCG em ciclos de fertilização in vitro (Ng et al., 2006).
Não se pode deixar de apontar as limitações deste estudo: (1) a possível interferência do fator masculino de infertilidade na ocorrência de gravidez, embora todas as pacientes tenham sido submetidas a ICSI, o que supostamente reduz significativamente a interferência do fator masculino sobre os resultados finais; e (2) a amostra limitada de ciclos/pacientes, podendo se tornar mais claro o papel dos preditores de implantação embrionária quando estudados em maior número casos.
Concluindo, marcadores de reserva ovariana podem ser ferramentas propedêuticas importantes no aconselhamento de casais inférteis candidatos a ciclos de RA, mas sua capacidade de predizer a ocorrência de gestação não pôde ser demonstrada neste estudo. Entretanto, a avaliação das variáveis de resposta, principalmente a contagem de folículos dominantes no dia de administração da hCG exógena, parece trazer alguma perspectiva quanto à predição da ocorrência de gravidez, caracterizando-se como importante elemento do aconselhamento ao casal e do acompanhamento da paciente pela equipe médica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ashrafi M, Madani T, Tehranian AS, Malekzadeh F. Follicle stimulating hormone as a predictor of ovarian response in women undergoing controlled ovarian hyperstimulation for IVF. Int J Gynaecol Obstet. 2005;91:53-7.