JBRA Assist. Reprod. 2009;13(3):35-44
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.3.08
1Endoscopia Ginecológica, Hospital das Clinicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas
2Clínica ORIGEN, BH
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte - MG
RESUMO
Um dos principais dilemas enfrentados pela Medicina reprodutiva, atualmente, é a dificuldade de preservação da capacidade reprodutiva feminina nas pacientes que têm seus ovários inativados pelo uso da químio/ radioterapia ou cirurgicamente retirados. Nesses casos, a criopreservação ovariana serviria tanto como fonte de reserva de oócitos para a preservação da função reprodutiva futura, bem como uma alternativa à terapia hormonal. Nesse artigo, fazemos uma breve revisão da literatura apresentando as principais causas da falência ovariana e os principais métodos atualmente disponíveis para preservação da função endócrina ovariana, com especial ênfase nos avanços em relação a criopreservação ovariana.
Palavras-chave: Transplante, ovário, criopreservação, ratos
ABSTRACT
One of the major problems against reproductive medicine is the incapacity of oocyte preservation in patients submitted to chemotherapies, radiotherapies and mutilating surgeries. In these cases, ovary preservation could restore hormonal e fertility capacity. In this article, we describe the main causes of ovarian failure and the alternatives to preserve ovarian function, especially the advances in ovarian cryopreservation.
Key-words: Transplantation, ovary, cryopreservation, rats
INTRODUÇÃO
A necessidade de preservação dos gametas femininos e o problema da reposição hormonal relacionado à melhor droga, dose e via de administração, indicações e efeitos colaterais são assuntos que vêm sendo discutidos há décadas e que até o momento não apresentam soluções definitivas (Barros et al., 2001). O banco de tecido ovariano pode ser uma das alternativas possíveis para atender estas questões e encontra-se em investigação experimental tanto em animais quanto em humanos, ainda em fases iniciais. Ele pode ser uma solução para a preservação da fertilidade em pacientes com câncer, situação em que o tratamento levará à falência ovariana, assim como o que ocorre em pacientes com endometriose grave ou tumores ovarianos benignos. Essa questão torna-se especialmente importante para mulheres solteiras e crianças, nas quais não é possível o uso do congelamento de embriões. Além disso, acredita-se que o transplante ovariano possa restaurar a função endócrina da mulher, sendo uma alternativa à terapia hormonal. Outra possível indicação seria para pacientes que retardam a concepção para um período avançado da vida reprodutiva, quando a reserva ovariana encontrase diminuída ou esgotada, hoje candidatas a tratamento com doação de oócitos.
No ano de 2006, foram estimados 1.399.790 novos casos de câncer nos Estados Unidos, sendo 679.540 em mulheres e 8% disso em mulheres abaixo de 40 anos (Jemal et al., 2006). Estima-se que em 2010, uma em cada 250 pessoas adultas serão sobreviventes de câncer na infância (Blatt, 1999). Os grandes avanços obtidos no diagnóstico e tratamento do câncer em crianças, adolescentes e adultos aumentou a expectativa de vida de mulheres sobreviventes na pré-menopausa, entretanto resultou numa população crescente de adolescentes e adultos curados de neoplasias malignas que experimentarão problemas de infertilidade devido a falência ovariana prematura (Blatt, 1999). Os efeitos das quimioterapias, radioterapias e cirurgias mutiladoras no futuro da fertilidade são matéria de estudos e preocupações das pacientes e de seus familiares.
1 - FALÊNCIA OVARIANA
1.1 - Falência Ovariana Pós-Quimioterapia
A quimioterapia, especialmente quando se utilizam agentes alquilantes, é reconhecidamente gonadotóxica. A gonadotoxicidade das drogas varia entre elas, sendo algumas extremamente tóxicas (ciclofosfamida, melphalan, clorambucil, ifosfamida, thiotepa e mostarda nitrogenada) e outras com efeitos mínimos ou nulos sobre a reserva folicular ovariana (Metotrexate, 5-fluoracil, vincristina) (Sonmezer & Oktay, 2004). A perda folicular é também dose dependente, sendo que cada curso de quimioterapia resulta em perda adicional proporcional à reserva (Akar & Oktay, 2005). O risco de falência ovariana aumenta com a idade, simplesmente como conseqüência da menor reserva ovariana em mulheres mais velhas (Meirow & Nugent, 2001). Mulheres novas possivelmente não experimentarão falência ovariana imediata com drogas altamente gonadotóxicas, mas eventualmente elas desenvolverão infertilidade e menopausa precoce (Poniatowski et al., 2001). Desse modo, a restauração de ciclos menstruais regulares não garante a fertilidade normal (Demeestere et al., 2007).Em uma recente revisão, Lobo (2005) mostrou que a chance de gravidez espontânea após o tratamento é de 28% em mulheres abaixo de 20 anos e de apenas 5% em mulheres acima de 25 anos. Além disso, relata que a terapêutica preconizada para o transplante de medula óssea induz falência ovariana em mais de 80% dos casos, mesmo em crianças.
1.2 - Falência Ovariana Pós-Radioterapia
A radiação induz dano gonadal através de efeitos citotóxicos diretos e indiretos (formação de radicais livres) no DNA. A dose de radiação calculada para destruir 50% da reserva oocitária é estimada em menos de 2 gray (Gy) (Wallace et al., 2003). Enquanto um total de 20 Gy pode induzir falência ovariana em mulheres abaixo de 40 anos, uma dose baixa, como 6 Gy, é suficiente para levar à falência mulheres acima de 40 anos. Pacientes que mantém ciclos regulares, após irradiação pélvica, também não estão livres de desenvolver menopausa precoce (Wallace et al., 1989).Além da radioterapia pélvica e abdominal utilizada em tumores pélvicos e doença de Hodgkin, a irradiação crânio-espinhal em tumores cerebrais e leucemia linfoblástica aguda e irradiação total usada conjuntamente aos procedimentos de transplante de células tronco também estão intimamente associadas a falência endócrina ovariana. O fracionamento da dose total permite uma menor toxicidade (Wallace et al., 2003). Além do mais, a exposição uterina a doses de irradiação tão baixas quanto 10 Gy pode comprometer a vascularização e musculatura uterina e levar à perda de distensibilidade, tendo como conseqüência altas taxas de aborto e infertilidade por fator uterino (Wallace et al., 1989).Algumas condições tidas como benignas podem também levar à perda da função endócrina ovariana em decorrência do tratamento instituído. Doenças como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, a doença de Behçet e outras auto-imunes podem ser tratadas com quimioterapia e/ou radioterapia nos dias atuais (Mattle et al., 2005).
1.3 - Falência Ovariana Após Cirurgia
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 493.000 novos casos de cânceres do colo uterino no mundo estão estimados para 2008, sendo o tumor que mais acomete as mulheres em idade fértil (WHO, 2008). Quase 80% dos casos novos ocorrem em países em desenvolvimento, onde, em algumas regiões, é o câncer mais comum entre as mulheres (INCA, 2008). A American Cancer Society (ACS) preconizou que, em 2007, ocorreriam 22.430 eventos novos em relação aos tumores ovarianos e 11.150 eventos de tumor do colo uterino (ACS, 2008).Já, no Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 18.680 novas ocorrências de câncer de colo, em 2008, representando 19 para cada 100.000 mulheres. É o tumor mais incidente, em mulheres na região Norte, com incidência de 22:100.000. Na região sudeste brasileira, é o terceiro em freqüência, com 17 casos novos em cada grupo de 100.000 mulheres. Importante ressaltar que, nessas estatísticas, não estão sendo computados os cânceres de pele não-melanoma. A incidência do câncer de colo de útero torna-se mais evidente na faixa etária de 20 a 29 anos e o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico, geralmente entre 45 e 49 anos, dados que esclarecem a importância de sua conseqüência sobre a fertilidade feminina (INCA, 2008).Pacientes jovens podem, nessas situações, ter seus ovários retirados cirurgicamente como alternativa terapêutica. Além dos casos de câncer, algumas doenças benignas como cistos ovarianos extensos, de natureza progressiva e/ou recorrentes semelhante ao que ocorre em alguns casos de endometriose, cistos mucionosos e teratomas podem ter indicação de ooforectomia bilateral, o que levaria à perda da função endócrina ovariana e de 100% da reserva folicular (Sonmezer & Oktay, 2004).Sklar et al. (2006) estudaram 2.819 sobreviventes femininas de tumores e as compararam com 1.065 de suas irmãs, em relação à ocorrência de menopausa prematura. Observaram que esta ocorreu em 126 mulheres que sobreviveram ao tumor e em 33 no grupo das irmãs (controle). Entre estas, a ooforectomia cirúrgica foi verificada em 61 (48%) e em 31 (94%) mulheres dos dois grupos, respectivamente. Entretanto, viram que a incidência cumulativa de menopausa prematura não-cirúrgica é de 8% nas sobreviventes do câncer e de 0,8% nas mulheres do grupo-controle, o que representa risco relativo da ordem de 13,21 de um grupo em relação ao outro. Daí, conclui-se que a menopausa não cirúrgica é mais freqüente nas sobreviventes de tumores malignos e que, em mulheres em idade fértil que têm menopausa precoce, a castração cirúrgica responde por 98%.
2 - MÉTODOS DE PRESERVAÇÃO DA FUNÇÃO ENDÓCRINA OVARIANA
A primeira opção para preservação da função ovariana e fertilidade futura será a utilização de drogas menos gonadotóxicas e menores doses possíveis de radioterapia. Não sendo isso possível, deve-se partir para alternativas que visem diminuir a ação dos quimioterápicos e da radiação nos ovários. Isso inclui a transposição dos ovários ou ooforopexia, a utilização concomitante aos quimioterápicos de agonistas e/ou antagonistas dos hormônios liberadores das gonadotrofinas hipofisárias (GnRH) (Demeestere et al., 2007) e novas drogas antagonistas da apoptose - Sphingosine-1-Phosphate (Kim, 2006).
2.1 - Ooforopexia
Na ooforopexia, os ovários são retirados do campo de irradiação, evitando, assim, os efeitos diretos da radiação ionizante. A transposição dos ovários tem sido utilizada por décadas, com o objetivo de preservar a função ovariana. Antigamente, era feita conjuntamente à laparotomia para estadiamento na doença de Hodgkin ou à histerectomia radical no câncer de colo uterino. Atualmente, com o desenvolvimento das técnicas de videolaparoscopia, esse tem sido o procedimento de escolha, devido à sua simplicidade, segurança e efetividade (Kim, 2006). A eficácia na prevenção da falência ovariana nunca foi muito boa, variando nos estudos entre 16 e 90 %. Essa grande variação é devido às diferentes doses utilizadas, ao grau de comprometimento da vasculatura, à idade da paciente e à concomitância ou não de quimioterapia (Bisharah & Tulandi, 2003). Diversas complicações são associadas ao procedimento, diminuindo ainda mais sua efetividade e incluem: isquemia da trompa, dor pélvica crônica, formação de cistos ovarianos e migração dos ovários de volta à sua posição original antes do início da radioterapia (Meirow & Nugent, 2001). Quando a ooforopexia é realizada, a gravidez espontânea torna-se inviável, a não ser que seja realizado um novo procedimento cirúrgico. Assim, como essas pacientes necessitarão de Fertilização In Vitro (FIV) no futuro, a coleta de oócitos será um grande desafio. Desse modo, pacientes candidatas à transposição devem ser cuidadosamente escolhidas, analisando-se as diversas variáveis que podem afetar o resultado final. Finalizando, nunca se deve indicar o procedimento a pacientes que serão submetidas conjuntamente à quimio e radioterapia (Sonmezer & Oktay, 2004).
2.2 - Análogos do GnRH
Considerando a possibilidade de preservação da função testicular em homens submetidos a quimioterapia nos quais foi realizada supressão gonadal e na premissa que garotas pré-púberes não são afetadas pela gonadotoxicidade dos quimioterápicos, foi aventada a hipótese de que a supressão ovariana pode ser protetora (Kim, 2006). Estudos realizados em animais demonstraram menor perda de folículos primordiais quando foi utilizado o análogo em animais submetidos à quimioterapia (Blumenfeld, 2007). Entretanto, falhou em mostrar os mesmos benefícios quando os animais foram submetidos à radioterapia (Sonmezer & Oktay, 2004). Em humanos, Blumenfeld et al. (1996) demonstraram claramente os efeitos benéficos da utilização do GnRH: no grupo tratado com o análogo, 15 de 16 pacientes (94%) reassumiram ciclos menstruais regulares entre 3 e 8 meses após o fim da quimioterapia, enquanto no grupo controle 61% apresentou falência ovariana. Já no estudo de Waxman (1987), não houve benefício com o uso do análogo, já que, após 3 meses de follow-up, 4 de 8 mulheres no grupo tratado e 6 de 9 no grupo controle ficaram amenorréicas. Em estudo publicado recentemente, Blumenfeld et al. (2008) mostraram novamente os benefícios da utilização do GnRH. No grupo que recebeu o GnRH, menos de 7% desenvolveu amenorréia hipergonadotrópica irreversível, ao passo que todas as outras voltaram a ter ciclos menstruais regulares, além de 33 terem engravidado espontaneamente 46 vezes. Alguns estudos randomizados fase III se encontram em andamento e irão, provavelmente, resolver a questão a respeito do uso de agonistas de GnRH na preservação da função ovariana e fertilidade em mulheres jovens na menacme, expostas à quimioterapia gonadotóxica (Blumenfeld, 2007).
2.3 - Antagonista do GnRH
Tem sido sugerido que novos estudos devem avaliar os antagonistas do GnRH, ao contrário dos agonistas, com o objetivo de se conseguir uma dessenssibilização hipofisária mais rápida, eliminando a necessidade de aguardar os 7-14 dias que os segundos levam para provocar o bloqueio hipofisário. Meirow et al. (2004) realizaram um estudo com animais, com o objetivo de testar o efeito protetor do Cetrorelix contra a ciclofosfamida e demonstraram que este existe, mas é dose dependente, diminuindo com o aumento da dose do quimioterápico. Outro estudo concluiu que, apesar dos efeitos benéficos conhecidos com os agonistas, os antagonistas de GnRH não conseguiram proteger o ovário dos efeitos danosos da ciclofosfamida (Danforth et al., 2005), colocando em dúvida a afirmação de que os antagonistas poderão, num futuro próximo, substituir os agonistas na proteção ovariana contra quimioterapia gonadotóxica (Blumenfeld, 2007).
2.4 - Sphingosine-1-Phosphate (Antagonista de Apoptose)
Os oócitos possuem intrinsecamente um mecanismo de apoptose que pode ser ativado por diversos estímulos, entre eles radiação e quimioterapia. Na teoria, então, a morte oocitária poderia ser evitada se o programa de apoptose pudesse ser inativado. Em estudo com ratos, a supressão da depleção de pools de folículos imaturos foi obtida com uma única injeção na bursa ovariana de Sphingosine-1-Phosphate, 2 horas antes da irradiação (Morita et al., 2000). Outro estudo (Paris et al., 2002) demonstrou que a proteção à radiação que ocorre devido a Sphingosine-1-Phosphate não está associada à propagação de danos genômicos a nível anatômico, histológico, bioquímico ou citológico, promovendo, assim, credibilidade prospectiva à utilização da droga. Apesar de ser uma droga promissora na preservação da função ovariana e da fertilidade após quimioterapia e irradiação, sua eficácia e aplicabilidade prática em humanos ainda precisa ser testada (Kim, 2006; Blumenfeld, 2007).
2.5 - Congelamento de Embriões
O único método estabelecido até o momento e rotineiramente utilizado em clínicas de reprodução assistida é a criopreservação de embriões, mas essa opção requer estimulação ovariana, coleta de oócitos e fertilização in vitro, o que pode levar entre 2-5 semanas. Assim, o atraso no inicio do tratamento quimioterápico para o armazenamento de embriões não é factível para algumas pacientes e pode ser, até mesmo, um risco em alguns tipos de câncer. Mais ainda, esse método não deve ser considerado uma opção em garotas pré-puerperais e é freqüentemente inaceitável por mulheres que não possuem parceiro fixo e naquelas que não desejam utilizar espermatozóide de doadores Kim, 2007). Há dúvidas sobre a segurança da estimulação ovariana em mulheres que apresentam tumores hormônio dependentes, como o câncer de mama, apesar de terem surgido novos protocolos de estimulação com o uso do Tamoxifeno e de inibidores da aromatase (Letrozole), mostrando resultados animadores (Oktay et al., 2005). Desse modo, o congelamento de embriões deve ser considerado como primeira opção na preservação da fertilidade em mulheres com parceiro fixo e com disponibilidade para ser submetida a pelo menos um ciclo de FIV.
2.6 - CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS
Outra alternativa é a criopreservação de oócitos, que pode ser utilizada em mulheres sem parceiro sexual definido e que tenham condições de serem submetidas a um ciclo de estimulação ovariana antes do início da quimioterapia (Jain & Paulson, 2006). Apesar do primeiro nascimento ocorrido a partir de oócitos congelados ter sido relatado em 1986 por Chen e das altas taxas de sucesso obtidas com o congelamento de embriões e espermatozóides, os resultados obtidos, a partir de FIV após oócitos descongelados, eram ruins, com baixas taxas de sobrevida, de fertilização e de gravidezes (Sonmezer & Oktay, 2004). Entretanto, a partir de significativa melhora obtida nas técnicas de congelamento e descongelamento, houve um pequeno incremento nas taxas de sobrevivência de oócitos congelados/descongelados e até de gravidezes (Borini et al., 2004). Uma revisão de estudos realizada em 2004 mostrou uma taxa de sobrevivência média de 47%, uma taxa de fertilização média de 52,5% e de gravidez por oócito descongelado de 1 a 5% (Donnez et al., 2006; Sonmezer & Oktay, 2004). Meta-análise publicada por Oktay et al. (2006) mostrou: taxa de nascimento por oócito descongelado variando de 1,9 a 2,0%; taxa de nascimento por oócito injetado de 3,4% e por embrião transferido de 21,6%. As novas tecnologias adotadas que possibilitaram essa melhoria incluem: aumento na concentração de sucrose, tempo de descongelamento mais lento e equilibrado e uso de meios com depleção de sódio, além da técnica de vitrificação (Donnez et al., 2006). Pode ser considerado um método promissor, mas ainda assim apresenta baixas taxas de sucesso.Nos últimos dois anos, resultados cada vez mais animadores têm sido descritos com métodos de congelamento lento, vitrificação e maturação in vitro (Tulandi et al., 2008). Albani et al. (2008) publicaram dados de um estudo retrospectivo com mais de 7500 oócitos descongelados mostrando melhora nas taxas de gravidez e de implantação nos últimos anos (6,7% e 2,4 % em 2001 e 15% e 8,2% em 2007 respectivamente). Boldt et al (2006) mostraram taxa de sobrevivência de 60,% por oócito congelado, taxa de fertilização de 62% por oócito injetado e de gravidez de 32,6% por embrião transferido. Já Chian et al. (2008) reportaram taxa de sobrevivência de 81% após descongelamento e de gravidez de 45%, com o nascimento de 22 bebês. Parmegiani et al. (2009) em estudo multicêntrico utilizando protocolo de congelamento lento após 2 horas da coleta e descongelamento rápido obtiveram 33,24% de embriões de ótima qualidade e taxa de gravidez por oócito descongelado e injetado de, respectivamente, 5,53% e 10,41%. Grifo & Noves (2009) demonstraram taxa de sobrevivência de oócitos de 92%, sendo 14 gravidezes confirmadas com taxa de 57%. Kim et al. (2009) obtiveram ótimos resultados após congelaram 395 oócitos e após descongelamento de 320, injetaram 285. Relataram taxa de fertilização de 72,3%, sendo 53 embriões transferidos em 19 pacientes. Destes, 24 implantaram resultando em 16 gravidezes (80%) e 3 abortos (15%). Também em 2009, Levi Setti et al. publicaram meta-análise mostrando os resultados globais de congelamento de oócitos. Com a utilização da vitrificação foram observadas as melhores taxas: sobrevivência de 83,9%, fertilização de 81,9%, gravidez de 43,3% e implantação de 14,8%. Mas, apesar de todos esses bons resultados, ainda deve ser considerado um método experimental.
2.7 - CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS IMATUROS
Esse método surgiu como uma alternativa ao congelamento de oócitos maduros, pois se acredita que por serem mais indiferenciados, não possuírem um fuso tão delicado que possa ser lesado e terem cromossomos protegidos por uma membrana nuclear, sejam mais resistentes ao processo. Entretanto, possui baixa taxa de maturação após descongelamento e desenvolvimento embrionário ineficiente (Tulandi et al., 2008). Esse método não será válido até que a maturação do oócitos in vitro se torne corriqueira (Kim, 2007). Até o momento, apenas algumas gravidezes foram relatadas na literatura com o uso de oócitos imaturos (Wu et al., 2001).
2.8 - CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO
A criopreservação de tecido ovariano é a única opção disponível para garotas pré-púberes e para mulheres em que não é possível postergar o início da quimioterapia (Barros et al., 2008). O congelamento de tecido ovariano foi feito, até o momento, por três técnicas: ovário inteiro com pedículo vascular, fragmentos do córtex ovariano e folículos isolados. Até o momento, a maioria das pesquisas animais e em humanos concentra-se em métodos de congelamento e transplante de fragmentos do córtex avascular, sendo que essa técnica foi a única que possibilitou a ocorrência de nascimentos em humanos até o momento (Donnez et al., 2006).A criopreservação de tecido ovariano apresenta diversas vantagens e traz menos dilemas éticos. Nesse método, centenas de oócitos imaturos podem ser preservados sem necessidade de estimulação. Estes são menores, quiescentes, não apresentam zona pelúcida, nem grânulos corticais (Barros et al., 2008). Realmente, a preservação do tecido ovariano através de congelamento/descongelamento tem se mostrado um sucesso em animais, mas existe ainda a questão de como desenvolver esses folículos imaturos armazenados no tecido congelado e permitir a fertilização.Teoricamente, existem três estratégias que permitem o desenvolvimento dos folículos: transplante autólogo/ heterólogo, transplante xenólogo e cultura in vitro.A estratégia mais desejada seria a que permitisse o desenvolvimento de um meio que possibilitasse o crescimento e maturação in vitro, considerando a ausência de novos procedimentos cirúrgicos, melhor acompanhamento do desenvolvimento e risco zero de transmissão de células cancerosas (Shaw et al., 1996). Apesar de já ser possível isolar folículos primordiais de tecido ovariano humano, não se obteve sucesso na sua maturação in vitro. Estudos em ratos nesse sentido são promissores, mas, se esse sucesso poderá ser transportado para humanos, ainda é uma incógnita (Sonmezer & Oktay, 2004).O Xeno-transplante de tecido ovariano humano em ratos imunodeficientes, com o crescimento e maturação de folículos nestes, mostrou ser essa uma técnica eficaz de desenvolvimento de folículos imaturos armazenados em tecido ovariano congelado (Oktay et al., 1998). Em estudo recente, Kim et al. (Kim et al., 2005) avaliaram a integridade de oócitos humanos obtidos após transplante xenólogo para ratos imunodeficientes e maturação in-vitro do complexo cúmulo-oocitário. Através de análise imunocitoquímica de micro-túbulos e DNA, alguns oócitos apresentaram-se com anormalidades nucleares e maturação citoplasmática. Além disso, a possibilidade de infecção viral trans-espécies, além de questões éticas e de segurança, ainda impedem seu uso na prática clínica (Kim, 2006).Apesar de diversas tentativas terem sido realizadas durante 100 anos, não foi possível proceder ao congelamento de células vivas até que o primeiro crioprotetor, glicerol, foi descoberto em 1948 em Londres (Kim, 2007). Assim, nos anos 50, surgiram diversas pesquisas a respeito da criopreservação e transplante de ovários. Em 1956, Parkes (1956) mostrou a restauração da função endócrina após transplante autólogo de ovário em ratas. Devido à falta de aplicabilidade clínica, esse método de preservação da fertilidade ficou somente no campo das pesquisas por aproximadamente 30 anos, até que em 1994, Gosden et al. (1994) obtiveram sucesso restaurando a fertilidade em ovelhas após transplante autólogo de tecido ovariano congelado/descongelado e mostraram novas perspectivas, especialmente como estratégia para preservar a função ovariana em mulheres com câncer. Dez anos depois, em 2004, foi descrito o primeiro nascimento após a realização de transplante ortotópico de tecido ovariano humano congelado/descongelado de uma mulher que teve linfoma de Hodgkin (Donnez et al., 2004).A criopreservação do tecido ovariano através da técnica de congelamento lento e descongelamento rápido tem obtido melhores resultados nos últimos anos, mas ainda não é o ideal. Ao contrário do congelamento de células únicas, o congelamento de tecido é muito mais difícil, visto que há uma grande quantidade de diferentes células (Kim, 2007). O maior dano que ocorre durante o processo é a formação intracelular de cristais e aumento da concentração de sais e, normalmente, a fase em que isso ocorre é durante o congelamento entre -10oC e -40oC. Newton et al. (1996) postularam que, com o objetivo de diminuir a injúria, a taxa de congelamento deveria ser rápida o suficiente para diminuir a exposição das células a altas concentrações intracelulares de eletrólitos e lenta o suficiente para desidratar as células e evitar a formação de cristais. A escolha do crioprotetor com a máxima permeabilidade e mínima toxicidade e potencial de formação de cristais deve ser específico para cada célula e tipo de tecido (Fuller & Paynter, 2004). De acordo com Hovatta (2005), o método padrão para a criopreservação de tecido ovariano deve ser o congelamento lento e programado usando meio contendo albumina humana associado ao propanediol, dimetilsufóxido ou etileno-glicol como crioprotetor e combinado ou não à sucrose. Com essa metodologia, as melhores taxas de sobrevivência de folículos obtidos de tecido congelado têm ficado em torno de 70 - 80% (Newton et al., 1996).
2.8.1 - Transplante Autólogo/Heterólogo Criopreservado em Animais
Os pioneiros no transplante ovariano pós criopreservação demonstraram a capacidade de preservação dos folículos levando à restauração da função ovariana endócrina e fértil. E, apesar dos primeiros esforços na realização dessas pesquisas, a técnica de criopreservação foi abandonada até os anos 1990 devido à falta de crioprotetores efetivos e máquinas automatizadas de criopreservação (Akar & Oktay, 2005).As taxas de sucesso obtidas após transplante autólogo/ heterólogo de fragmentos de tecido ovariano criopreservados observadas na literatura variam consideravelmente dependendo, principalmente, do animal estudado e do local de implantação, sendo que a grande maioria dos estudos, independente das variáveis descritas acima, mostra sucesso (Prates et al., 2008).Em camundongos, Harp et al. (1994) descreveram 75% de ciclos estrais regulares após o transplante. Candy et al. (1995), já no ano seguinte, mostraram sobrevivência de todos os fragmentos de tecido ovariano criopreservado de camundongos transplantados. Posteriormente, Cox et al. (1996) descreveram 100% de sucesso. Guanasena et al. (1997) obtiveram gestações em todas as 12 fêmeas de camundongos submetidas a transplante autólogo de ovário fresco e em 8 das 11 fêmeas submetidas a transplante autólogo de ovário após congelamento. Os transplantes foram realizados para a própria bursa ovariana, sem reanastomose vascular. Candy et al. (2000) mostraram restauração da fertilidade em 12 de 13 camundongos que receberam transplante de ovário fresco e em 10 de 12 que receberam-no congelado. Liu et al. (2000) realizaram transplante de fragmentos de vinte e seis ovários congelados e descongelados para a cápsula renal e mostraram que houve desenvolvimento folicular adequado. Também Liu et al. (2001) relataram gravidez após ICSI seguindo a mesma linha de pesquisa. Novamente Liu et al. (2002) realizando o mesmo procedimento, mostraram normalização da citologia vaginal após 11 dias. Wang et al. (2002a) relataram níveis de FSH, progesterona e estrogênio semelhantes nos grupos submetidos a transplante de tecido ovariano descongelado e controle. Salehnia (2002) demonstrou a presença de folículos nos vários estágios de desenvolvimento, após realizar congelamento, descongelamento e transplante em 24 camundongos. Lee et al. (2005) obtiveram sucesso no transplante de tecido ovariano fresco (73%) e congelado (62%) de ratas para subcutâneo, com posterior captação oocitária, FIV e desenvolvimento de blastocistos. Yang et al. (2006) mostraram sinais de desenvolvimento folicular em 100% dos ovários criopreservados transplantados para a cápsula renal de camundongos. Migishima et al. (2006) relataram retorno da fertilidade em camundongos submetidos à radioterapia e posterior transplante de tecido ovariano criopreservado. Soleimani et al. (2008) realizaram transplante de tecido ovariano criopreservado para cápsula renal e músculo e viram desenvolvimento folicular em todos os implantes, além de terem obtido doze embriões através de ICSI, que resultaram em três nascidos vivos.Em ratas, Sugimoto et al. (2000) demonstraram desenvolvimento folicular através de histologia, após transplantarem fragmentos de ovários para a cápsula renal, em todos os nove animais estudados. Também em 2000, Kagabu & Umezu realizaram transplante de ovários de ratas congelados para a cavidade uterina e mostraram, à histologia, sobrevivência folicular de apenas 11%. Já Yin et al. (2003), relataram gravidez em ratas após transplante de tecido ovariano congelado e descongelado com sobrevivência de 4 dos 7 (57%) fragmentos criopreservados.Em estudo recente, Prates et al. (2008) demonstraram a viabilidade funcional hormonal do transplante ovariano autólogo para o peritônio de 67 ratas, após o congelamento e descongelamento, através de citologia vaginal seriada e estudo histológico dos ovários transplantados. Souza et al. (2005) demonstraram sucesso após estimular ovários congelados e transplantados para o peritoneo de ratas com FSH recombinante. Nesse estudo os autores contaram o número de folículos em crescimento no grupo estimulado e compararam com ovários de ratas transplantados após congelamento, porém sem estimulo hormonalJá em ovelhas, Gosden et al. (1994) obtiveram duas gestações normais em 6 animais estudados, sendo uma a partir de transplante autólogo de tecido ovariano fresco e outra após congelamento e descongelamento. Salle et al. (1998) mostraram desenvolvimento normal de folículos em fragmentos corticais de ovário de 6 ovelhas transplantados para o hilo ovariano contralateral após congelamento. Folículos primordiais até os estágios antrais foram encontrados na análise histológica em todos os casos. Baird et al. (1999) descreveram apenas 7% de perda de folículos após congelamento e transplante autólogo em 8 ovelhas. Aubard et al. (1999) observaram desenvolvimento folicular em 6 ovelhas que tiveram ovários congelados reimplantados. Salle et al. (2003) descreveram 4 gestações em ovelhas que receberam ovários descongelados. Também em 2003, Bedaiwy et al. relataram preservação, em curto prazo, de tecido ovariano criopreservado transplantado em 100% dos casos e níveis de FSH semelhantes ao período pré re-implantação. Almodin et al. (2004) realizaram criopreservação de tecido ovariano e o transplantaram após irradiação, obtendo gravidez espontânea nas duas ovelhas. Arav et al. (2005) realizaram transplante de ovário inteiro criopreservado com anastomose vascular para o hilo ovariano contra-lateral e relataram atividade progestogênica, após 24-36 meses do reimplante, em 3 animais. Foi realizado, em duas, coleta oocitária e FIV, com posterior desenvolvimento de embrião de 8 células. Em 2006, Imhof et al. (2006) relataram uma gravidez espontânea após transplante de ovário inteiro com anastomose vascular em ovelhas.
2.8.2 - Transplante Autólogo Criopreservado em Humanos
Uma vez que o tecido ovariano foi congelado, ele pode ser transplantado de duas maneiras: Ortotópico - colocando o ovário ou fragmentos de ovário na fossa ovárica próximo ao ligamento infundíbulo-pélvico; Heterotópico - implantando o tecido para o tecido subcutâneo. Uma gravidez espontânea pode, teoricamente, ser obtida quando do transplante ortotópico em uma paciente com trompas pérvias. No caso do heterotópico, quando os fragmentos são inseridos no subcutâneo abaixo da fáscia braquioradial ou no abdome abaixo da fáscia do músculo reto, a gravidez só será possível através de FIV (Akar & Oktay, 2005).Em teoria, uma gestação natural pode ser obtida por meio de transplante ortotópico de tecido cortical ovariano congelado/descongelado, nos casos em que as tubas permanecerem intactas.Em 2000, Oktay & Karlikaya reportaram um transplante via laparoscópica de tecido ovariano congelado/descongelado para a parede pélvica lateral, em uma paciente de 29 anos de idade, que havia sido submetida à ooforectomia bilateral por patologia benigna. Fragmentos do tecido ovariano criopreservado foram descongelados e transplantados. A paciente teve seu tecido ovariano estimulado por meio de gonadotrofinas após 15 semanas e novamente depois de 10 meses. O desenvolvimento folicular foi demonstrado pela ultra-sonografia e a ovulação ocorreu em resposta à administração de hormônio gonadotrófico humano (HCG).O segundo caso de transplante ortotópico foi relatado por Radford et al. em 2001 e foi realizado em uma mulher de 36 anos com linfoma, que teve seu ovário direito criopreservado antes da realização de quimioterapia. Dezenove meses após, com a paciente em menopausa, dois fragmentos de tecido ovariano descongelado foram transplantados para a fossa ovárica direita e sobre o ovário esquerdo. Cinco meses depois, o estrogênio atingiu 352 pmol/l e a ultrassonografia revelou folículo 20 mm e endométrio 10 mm. Mais dois meses e a paciente não apresentava mais sintomas climatéricos. Posteriormente, (nove meses após o reimplante), o FSH e LH retornaram aos níveis pré-transplante (73 UI/l e 108 UI/l, respectivamente).O nascimento do primeiro bebê após transplante de tecido ovariano congelado em humanos foi relatado por Donnez et al em 2004. Fragmentos de tecido ovariano de uma paciente com linfoma Hodkgin, que seria submetida a quimioterapia e radioterapia, foram criopreservados. Quatro anos após o fim do tratamento, os fragmentos foram descongelados e implantados em uma janela peritoneal, criada adjacente ao ovário direito. A paciente engravidou espontaneamente. Existe, entretanto, a possibilidade dessa gravidez ter se originado de um oócito que ovulou do ovário remanescente e não do tecido transplantado (Oktay & Tilly, 2004).No ano seguinte, Meirow et al. (2005) relataram o segundo caso de nascido vivo, após transplante ovariano criopreservado em humanos, em um paciente com falência ovariana prematura, após quimioterapia. A paciente menstruou após 8 meses, e um aumento na dosagem de Hormônio anti-mulleriano e inibina B indicaram a presença de folículos em crescimento e ovulação. Após um ciclo de FIV, um embrião de 4 células foi transferido e a gravidez atingiu o termo.Também em 2005, Schmidt et al. apresentaram os resultados de três casos de transplante de tecido ovariano para a cavidade peritoneal, próximo do sítio natural ovariano. Todas as três pacientes com ovários transplantados tiveram retorno da função endócrina ovariana confirmada pelo retorno dos ciclos, pela presença visível de folículos pela ultra-sonografia e pelos níveis hormonais normais. Dois embriões foram obtidos de três oócitos coletados em metáfase II, mas não resultaram em gravidez após a transferência embrionária.Em 2006, Demeestere et al., utilizando transplante ortotópico e heterotópico, obteve gravidez clínica em uma paciente. Tecido ovariano criopreservado de uma mulher de 29, anos tratada previamente com transplante de medula óssea após doença de Hodgkin, foi transplantado para o ovário, para o peritônio e para o tecido abdominal subcutâneo. Os marcadores de reserva ovariana foram se normalizando após 5 meses. Seis ciclos naturais foram acompanhados e a paciente engravidou durante o sexto, mas abortou após 7 semanas de gestação. Essa paciente continuou a ser acompanhada pelo grupo e, um ano após o primeiro transplante, um aumento no FSH e uma diminuição nos níveis de inibina B sugeriram deterioração dos fragmentos (Demeestere et al., 2007). Um novo transplante ortotópico e heterotópico foi então realizado: dois fragmentos de ovário foram suturados no ovário remanescente e mais dois no tecido subcutâneo abdominal. A partir do terceiro ciclo, o FSH retornou para valores abaixo de 10 UI/l e durante o quinto, 2 folículos de 15 m cada foram observados no local do ovário remanescente. Um exame de gravidez positivo no 14º dia da fase lútea e batimentos cardiofetais à ultrassonografia (US) confirmaram a gestação. Esta transcorreu sem intercorrências e a paciente pariu uma menina saudável com 41 semanas de gravidez (Demeestere et al., 2007).Ainda não se conhece a longevidade dos fragmentos de tecido ovariano e, desse modo, repetidos transplantes podem ser necessários para permitir a manutenção da função ovariana. Desse modo, o transplante heterotópico se torna mais factível evitando repetidos procedimentos invasivos e anestesias e tornando o acompanhamento e a captação de oócitos mais fácil. Entretanto, ainda não se conhece o melhor sítio para o transplante e o grande desafio é conseguir obter oócitos maduros e saudáveis (Kim, 2007).O primeiro caso de transplante de tecido ovariano fragmentado para o subcutâneo foi descrito por Oktay et al. (2001) e foi realizado em uma paciente de 35 anos com carcinoma cervical estadio IIIB e que foi submetida a radioterapia pélvica. Após 10 meses do transplante, a ultrassonografia realizada mostrou folículo dominante 15 mm e quatro folículos antrais, enquanto que os níveis de FSH e LH entre 120 e 227 dias ficaram em torno de 8,6 UI/l e 12,8 UI/l, respectivamente.Kim et al. (2004) realizaram transplante heterotópico de tecido ovariano em três mulheres com câncer de colo uterino. Das duas que sobreviveram, observou-se restauração da função ovariana após 14-18 semanas do transplante e essa função normal vem se mantendo desde então, apesar de novos transplantes terem sido necessários. O FSH basal em 2005 encontrava-se abaixo de 10 UI/l17. Os autores investigaram qual o melhor sítio para o transplante e viram que houve uma maior freqüência de folículos dominantes quando o transplante foi feito para a parede abdominal, em comparação com mama e coxa, além de ser possível ocorrer ovulação espontânea. O grupo já conseguiu coletar cinco oócitos maduros a partir do implante abdominal e um do implante na coxa.Oktay et al. (2004) conseguiram obter um embrião de 4 células, após transplante heterotópico de tecido ovariano criopreservado de uma mulher de 36 anos com câncer de mama. Essa paciente havia sido submetida a mastectomia e esvaziamento axilar bilateral, além de ter recebido quimioterapia 6 anos antes. A paciente teve todos os sintomas do climatério e a menopausa após a quimioterapia. Três meses após o transplante, a mulher voltou a apresentar função ovariana e oócitos começaram a ser coletados.Wolner-Hassen et al. (2005) relataram o transplante de tecido ovariano criopreservado para o antebraço. Apenas dois folículos desenvolveram e o tecido sobreviveu por apenas 7 meses. Os autores alertam sobre o risco de exposição à temperatura baixa, pressão alta e trauma para os fragmentos transplantados para o subcutâneo. Rosendahl et al. (2006) publicaram o caso de uma gravidez bioquímica, ocorrida após transplante ovariano heterotópico de tecido criopreservado. Uma paciente de 28 anos de idade, cujos ovários foram criopreservados previamente ao tratamento quimioterápico para linfoma de Hodgkin, teve fragmentos descongelados implantados no ovário remanescente, na parede pélvica e numa janela criada no retroperitônio. A mulher voltou a apresentar secreção hormonal e folículos desenvolveram-se nos três sítios. Os folículos que se desenvolveram no retroperitônio foram aspirados diversas vezes. Realizou-se Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) nos óvulos coletados e embriões foram transferidos. Em uma dessas situações, o teste de gravidez ficou positivo 14 dias após a transferência. Entretanto, gravidez clinica não foi detectada.Apesar de todos esses esforços, até o momento não houve nenhum relato de nascido vivo de tecido ovariano criopreservado transplantado heterotopicamente, o que pode ser atribuído ao fato dos folículos nunca atingirem mais do que 15 mm. Esse desenvolvimento folicular limitado pode ser devido a diferentes temperaturas e pressões que os folículos são submetidos no subcutâneo, quando comparado à cavidade abdominal (Donnez et al., 2006).Apesar desses relatos de gravidezes em humanos, ainda permanecem dúvidas a respeito da origem desses oócitos, já que, em todos os casos, havia ovário residual que poderia ter reassumido sua função (Oktay, 2006). Diversos estudos (Schimmer et al., 1998; van Kasteren & Shoemaker, 1999) têm mostrado que, apesar de pequena, existe a chance de recuperação da função endócrina ovariana após químio e radioterapia com posterior gravidez. Sanders et. al. (1996) acompanharam 708 mulheres tratadas com altas doses de quimioterápicos e irradiação ionizante para tratamento de anemia aplásica e leucemias e observaram a normalização da função ovariana em 10 e gravidez espontânea em 32. Oktay & Oktem (2005) relataram o caso de uma paciente que, após ser submetida à quimioterapia, apresentou falência ovariana. Após transplante de tecido ovariano para o braço, o ovário voltou a apresentar função normal, levando, inclusive, ao nascimento de uma criança.
2.8.3 - Transplante de Ovário Inteiro com Reanastomose Vascular
Outra estratégia que vem sendo estudada é o transplante do ovário inteiro com reanastomose vascular. Através desta técnica, obtém-se fluxo sanguíneo imediato para o órgão transplantado, minimizando a injúria causada pela isquemia, que pode levar a diminuição da reserva folicular e conseqüente sobrevida do tecido. Wang et al. (2002b) descreveram o sucesso que obtiveram com essa técnica em ratas quando congelaram a parte superior do útero, o oviduto, o ovário com sua vascularização e depois realizaram o transplante com anastomose vascular. A função reprodutora normal foi restabelecida em 4 de 7 (57%) animais, sendo que um engravidou.Apesar do sucesso obtido em ratos, o congelamento de ovários inteiros de grandes animais ainda permanece como um desafio devido à dificuldade de difusão adequada do crioprotetor em grandes massas de tecido e à injúria vascular causada pela formação intravascular de gelo. Seguindo este raciocínio, Bedaiwy et al. (2003) relataram a restauração da função ovariana após auto-transplante de ovários intactos de ovelhas com anastomose vascular. Entretanto, deve-se ressaltar que 27% dos ovários foram perdidos durante o follow-up, devido a eventos trombóticos no pedículo vascular anastomosado.Mais recentemente, Imhof et al. (2006) demonstraram que o auto-transplante de ovários inteiros de ovelhas com anastomose vascular pode levar à gravidez. E mais surpreendente é que, em seis dos oito ovários, os vasos estavam livres de trombos e a estrutura do estroma ovariano encontrava-se intacta, após 19 meses do procedimento.Estudos em humanos já vêm sendo realizados, inclusive com a adoção de protocolos de congelamento. Martinez-Madrid et al. (2004) descreveram o processo de criopreservação e transplante de ovário inteiro com pedículo vascular e mostraram sobrevivência folicular de 75% e estrutura histológica normal. Entretanto, até o momento, ainda não há relatos de nascimentos ou gravidezes na literatura.Apesar de todos esses resultados favoráveis, não podemos nos esquecer do risco de transmissão de células malignas através do tecido utilizado, com possibilidade de recidiva da doença, após o transplante.Shaw et al. (1996) mostraram a transmissão de linfoma, em 7 de 7 fêmeas de camundongos, após transplante de tecido ovariano fresco e em 6 de 7 destes animais, que receberam transplante após congelamento. Entretanto, Kim et al. (2001) relataram que tecido ovariano retirado de pacientes com linfoma de alto grau é seguro para o transplante. Essa segurança foi testada através do xeno-transplante de tecido ovariano humano de pacientes com câncer para ratas imunodeficientes, sendo que nenhum dos animais transplantados desenvolveu a doença. No grupo controle, todos os ratos que receberam fatias de linfonodo contendo células de linfoma não Hodkgin desenvolveram linfoma de células B.
3 - PERSPECTIVAS
Além de todos os benefícios acima descritos, outras perspectivas futuras surgem para o uso do transplante ovariano. A sua utilização em substituição à terapia de reposição hormonal do climatério seria uma alternativa mais fisiológica. Com o desenvolvimento de novas drogas imunossupressoras cada vez mais potentes e com menos efeitos colaterais, para a prevenção da rejeição de tecidos não-autólogos e com o aperfeiçoamento das técnicas de criopreservação e de crioprotetores, poderia se pensar em um banco de tecido ovariano. Entre as pacientes que se beneficiariam da existência desse tipo de banco, estão as portadoras de disgenesia gonadal, aquelas com falência ovariana precoce e até mesmo mulheres que tiveram que atrasar o projeto maternidade.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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