JBRA Assist. Reprod. 2009;13(4):17-19
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.13.4.04
Uso do corante Azul de Bromofenol na avaliação da fertilidade masculina
Use of Bromophenol Blue dye in the evaluation of male fertility
Centro de Reprodução e Genética - FERTVIDA, Fortaleza/CE
Tatyane Bandeira Barros - Rua Atilano de Moura, 530, Edson Queiroz, Fortaleza/CE. Telefones: (85) 8816 8266. E-mail: tatybiobandeira@yahoo.com.br
RESUMO
A morfologia e vitalidade espermática são duas das características avaliadas em espermogramas que melhor se correlacionam com a fertilidade. Esse trabalho objetivou comparar o corante Azul de Bromofenol com os corantes eosina para a avaliação da vitalidade e Panótico de Hemograma para a avaliação da morfologia espermática na espécie humana. As 26 amostras de sêmen foram colhidas por masturbação. Para cada amostra foram confeccionadas duas laminas com 5ul de sêmen em cada. À primeira adicionou-se 5μl de eosina e à segunda 5μl de Azul de Bromofenol. As lâminas preparadas foram deixadas ao ar livre sobre uma placa aquecida a 35°C por alguns minutos e então levadas ao microscópio óptico. Foram contados 200 espermatozóides de cada lâmina e estes foram classificados quanto à vitalidade. Para a análise morfológica 10μl de sêmen foi fixado e corado por meio da técnica Panótico de Hemograma. Para verificar se houve diferença estatística entre os tratamentos empregados utilizou-se o teste t de student. Os percentuais de células viáveis foram semelhantes, 82,4 ± 81,68 para a Eosina e 83,76 ± 83,06 para o Azul de Bromofenol, não apresentando diferença estatística. Quando o corante Azul de Bromofenol foi comparado ao Panótico de Hemograma para a análise morfológica, também não foi vista diferença estatística entre as células espermáticas normais. Assim, pode-se concluir que o corante Azul de Bromofenol é eficiente para avaliação da vitalidade e morfologia espermática humano, podendo ser utilizado em laboratórios de Reprodução Humana.
Palavras-chave: Azul de bromofenol, vitalidade espermática, morfologia espermática, espermograma.
ABSTRACT
The morphology and sperm vitality are two of the characteristics evaluated in espermogramas that best correlated with fertility. This study aimed to compare the Bromophenol blue dye with the dye eosin for evaluation of vitality and Panótico of Blood for the evaluation of sperm morphology in humans. Twenty six samples of semen were collected by masturbation. For each sample two slides were prepared with 5ul of sperm in each. At first it added 5μl of eosin and the second 5μl of bromphenol blue. The prepared slides were left outdoors on a plate heated to 35 ° C for several minutes and then brought to the optical microscope. 200 sperm were counted for each slide and these were classified as to the vitality. For analysis of sperm morphology 10μl was fixed and stained by the technique of Panótico of Blood. To check whether there was statistical difference between treatments employed using the Student t test. The percentage of viable cells were similar, 82.4 ± 81.68 to 83.76 ± 83.06 and Eosin for Bromophenol blue, showed no statistical difference. When the Bromophenol blue dye was compared to Panótico of Blood to the morphological analysis, no statistical difference was seen between the normal sperm cells. Thus we can conclude that the Bromophenol blue dye is effective for assessment of human sperm morphology and vitality, can be used in laboratories in Human Reproduction.
Keywords: Bromophenol blue, sperm vitality, sperm morphology, espermograma.
INTRODUÇÃO
A infertilidade humana constitui um problema de saúde pública reconhecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No mundo este problema atinge de 15% a 20% dos casais. A causa em 50% dos casos é por fator masculino (Castro et al., 2008).
O objetivo principal de uma análise seminal é avaliar os parâmetros descritivos de um ejaculado produzido por masturbação (Remohi et al., 2008). A partir de seus resultados não é possível afirmar que um homem pode tornar-se pai biológico ou não. Entretanto, esta análise fornece informações sobre problemas no órgão genital, podendo ser utilizada como foco na investigação da infertilidade masculina (Kvist & Bjorndahl, 2002).
A morfologia e vitalidade espermática são duas das características seminais que melhor se correlacionam com a fertilidade (Viero et al., 2006).
A proporção de espermatozóides vivos nem sempre coincide com os que apresentam motilidade (Remohi et al., 2008). Assim, é importante determinar a vitalidade espermática para não fornecer um falso resultado.
A proporção de espermatozóides vivos pode ser determinada usando técnicas de coloração que são baseadas no princípio que células mortas apresentam danos na membrana plasmática, o que permite a entrada dos corantes (WHO, 1999). Dentre os corantes vitais, a eosina e a prova hiposmótica (Remohi et al., 2008) são bastante utilizadas para a avaliação dos espermatozóides humanos.
Embora os espermatozóides humanos mostrem uma grande variação em sua morfologia, observações da célula espermática obtida a partir do muco cervical pós-coito tem ajudado a definir a morfologia ideal de um espermatozóide (Kvist & Bjorndahl, 2002). Para a avaliação da morfologia podem ser utilizadas técnicas como o teste do Papanicolau e o sistema computadorizado de análise seminal (CASA) (Remohi et al., 2008).
Porém, muitos desses métodos são caros ou laboriosos, não sendo aconselháveis quando se necessita de uma avaliação rápida. Além disso, ainda não existe uma técnica que seja utilizada para análise da vitalidade e morfologia simultaneamente, o que seria mais eficiente.
O corante Azul de Bromofenol foi utilizado para a avaliação da morfologia espermática do sêmen ovino (Medeiros et al., 2006). Porém, apesar dos bons resultados apresentados em estudos com outra espécie, não há estudo com esse corante para a espécie humana.
Assim, esse trabalho objetivou comparar os corantes Azul de Bromofenol com a Eosina para a avaliação da vitalidade e com o Panótico de Hemograma para a avaliação da morfologia espermática na espécie humana.
MATERIAIS E MÉTODOS
Pacientes
Todos os 26 pacientes que foram avaliados no Centro de Reprodução e Genética Humana - FERTVIDA assinaram um termo de consentimento permitindo a utilização das amostras de sêmen doadas em exames convencionais e nos experimentos propostos por este estudo.Os pacientes foram submetidos a uma abstinência sexual de 3 à 5 dias. As amostras de sêmen foram colhidas em potes plásticos estéreis via masturbação, e só então levadas ao laboratório, onde permaneceram em banho-maria até liquefação (30 minutos). Apenas amostras com pH em torno de 7,0 e coloração de branco a amarelo, os quais indicam normalidade, foram utilizadas para este experimento.
Preparação do corante Azul de Bromofenol
A solução corante foi constituída por 0,1g de Azul de Bromofenol adicionado de 0,4 g de citrato de sódio e 10 ml de água destilada. A osmolaridade da solução foi medida e quando necessário, ajustada com água destilada para valores entre 300 e 310 mOsm.
Avaliação da vitalidade espermática
Para cada amostra foram confeccionadas duas lâminas com 5μl de sêmen cada. À primeira adicionou-se 5μl de eosina e à segunda 5μl de Azul de Bromofenol. Esse volume foi homogeneizado com auxílio de uma pipeta automática. Para a eosina o volume foi coberto com uma lamínula, já para o Azul de Bromofenol foi realizada a técnica do esfregaço.As lâminas preparadas foram deixadas ao ar livre sobre uma placa aquecida a 35°C por 2 a 3 minutos e então levadas ao microscópio óptico (aumento 20x). Foram contados 100 espermatozóides de cada lâmina (em duplicata), e estes foram classificadas em não corados (vivos) e corados (mortos). Os resultados foram expressos em porcentagem média.
Avaliação da morfologia espermática
Para a análise da morfologia foi feito um esfregaço com 10μl de sêmen. A lâmina foi então fixada e corada com o kit Instant-Prov® (corante para coloração diferencial rápida em hematologia) segundo recomendações do fornecedor. A morfologia foi avaliada apenas no dia seguinte.A lâmina de Azul de Bromofenol foi utilizada para avaliação da vitalidade e também para análise da morfologia espermática. De cada lâmina foram contados 100 espermatozóides em duplicata, e estes foram classificados em normais ou anormais conforme o manual WHO (1999).
Análise estatística
Para o tratamento estatístico das médias utilizou o teste de normalidade e para verificar se houve diferença estatística entre os tratamentos empregados utilizou-se o teste t de student com correção Welch (p > 0,05).
Resultados
Um total de 26 amostras seminais foram avaliadas neste estudo. Nem todas as amostras encontravam-se dentro dos parâmetros de normalidade de concentração e morfologia indicado pelo manual WHO (1999). Tal fato não teve influência nos resultados da pesquisa.
Para a análise da vitalidade, com o corante Eosina os espermatozóides mortos apresentaram-se com a região da cabeça corada em rosa, enquanto que os vivos não apresentaram coloração. Com o Azul de Bromofenol observouse também uma diferenciação dos espermatozóides vivos e mortos, sendo estes corados em azul, enquanto os vivos, assim como na Eosina, não foram corados.
O Azul de Bromofenol apresentou como desvantagem o fato deste deixar, em algumas lâminas, resíduos de corante na lâmina, o que dificultou a visualização dos espermatozóides. Este fator pode ter sido ocasionado devido a quantidade de Azul de Bromofenol aplicado ao sêmen.
Os percentuais de células viáveis foram semelhantes (Tabela I), 82,4 ± 81,68 para a Eosina e 83,76 ± 83,06 para o Azul de Bromofenol, não apresentando diferença estatística entre os corantes utilizados.
Tabela I. Comparação da vitalidade espermática no sêmen humano utilizando os corantes Eosina e Azul de Bromofenol
Quando o corante Azul de Bromofenol foi comparado ao Panótico de Hemograma para a análise morfológica, também não foi vista diferença estatística entre as células espermáticas normais de ambos os corantes (Tabela II). O percentual de células ovais para o Panótico de Hemograma foi de 17,46 ± 18,35, enquanto que para o Azul de Bromofenol foi de 16,57 ± 18,35.
Tabela II. Comparação da morfologia espermática no sêmen humano utilizando os corantes Panótico de Hemograma e Azul de Bromofenol.
Além disso, o Azul de Bromofenol apresentou uma maior praticidade quando comparado ao Panótico de Hemograma quanto a realização da técnica.
DISCUSSÃO
Mensurações feitas em uma população de espermatozóides de um ejaculado não podem definir a capacidade fertilizante daqueles que atingem o local da fertilização. Apesar disso, a análise seminal provê informações essenciais do estado clínico de um indivíduo (WHO, 1999). Assim é essencial que os procedimentos como este sejam padronizados e eficientes.
A observação pura e simples da motilidade não é suficiente para apreciar a qualidade potencial de um sêmen (Einarson & Viring, 1973). Porém a análise da porcentagem de espermatozóides vivos e mortos é um importante parâmetro para predizer o potencial fecundante (Chemineau et al., 1991). Estudos demonstram uma alta correlação entre esta avaliação e a fertilidade (Colas, 1980). A eficiência do Azul de Bromofenol como corante para análise da vitalidade espermática é pouco conhecida, porém Medeiros et al. (2006) ao comparar esse corante com a Eosina-Nigrosina, já amplamente utilizada para análise da vitalidade na espécie ovina, não observaram diferença significativamente entre os tratamentos testados. Tais resultados também foram observados no presente estudo quando o corante Azul de Bromofenol foi comparado a Eosina, utilizada em Centros de Reprodução Assistida com a mesma finalidade.
O Azul de Bromofenol e o Panótico de Hemograma na análise morfológica não apresentando diferença significativa entre os tratamentos analisados. Conforme Oehninger (2004) e Windt & Kruger (2004), a avaliação da morfologia espermática permite uma previsão dos resultados de procedimentos de Fertilização in vitro, uma diminuição de espermatozóides normais tem mostrado ser de valor significativo para predizer taxas de fertilização e gravidez.
A avaliação da morfologia espermática está correlacionada com o potencial de fertilização durante estudos in vitro e in vivo. Além do seu papel como indicador da fertilidade humana, a avaliação da morfologia espermática pode também ser útil em estudos que envolvem a saúde reprodutiva, endocrinologia e toxicologia ambiental. (Franken, 2004). Apesar das características morfológicas dos espermatozóides, utilizando microscopia de campo claro, ser uma questão subjetiva, onde a precisão dos resultados depende do técnico, do nível de conhecimento técnico, experiência e principalmente, da qualidade da lâmina produzida, para que seus resultados sejam confiáveis é necessário que o método de avaliação, preparação e coloração da lâmina sejam eficientes, além de possibilitar a visualização dos contornos da célula espermática, permitindo identificar alterações em sua morfologia, que foi conseguido com o Azul de Bromofenol.
Além da sua eficiência o corante Azul de Bromofenol apresenta outras vantagens em relação aos outros corantes testados, é um produto de baixo custo, de simples preparação e pode ser utilizado simultaneamente para análises da vitalidade e morfologia espermática.
CONCLUSÕES
Esse estudo permitiu concluir que o corante Azul de Bromofenol é eficiente para avaliação da vitalidade e morfologia espermática, podendo ser utilizado em laboratórios de Reprodução Humana.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CASTRO WR, CASTRO GR, QUEIROZ AB. Infertilidade humana masculina: uma revisão bibliográfica. J Bras Rep Assist. 2008; 12 (1): 31