Injeção intracitoplasmática de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI) e seu impacto nas taxas de fertilização, clivagem e qualidade embrionárias.

Alcides Clemente Tarasconi; Edilene Ventura Silva; Bruno Ventura Tarasconi; Franciele Verzeletti; Diego Ventura Tarasconi

JBRA Assist. Reprod. 2010;14(1):19-23
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2011.14.1.03

Injeção intracitoplasmática de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI) e seu impacto nas taxas de fertilização, clivagem e qualidade embrionárias.

Intracitoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) and its impact on fertilization rates, cleavage and embryo quality.

Alcides Clemente Tarasconi¹, Edilene Ventura Silva², Bruno Ventura Tarasconi³, Franciele Verzeletti⁴, Diego Ventura Tarasconi⁵

¹Universidade de Passo Fundo, Rio Grande do Sul. Genesis Clinica de Reprodução Humana, Passo Fundo, Rio Grande do Sul, acreditada pela RED LARA.
²Bióloga. Genesis Clinica de Reprodução Humana, Passo Fundo, Rio Grande do Sul.
³Estudante de Medicina da Universidade de Passo Fundo, Rio Grande do Sul.
⁴Biomédica. Embriologista estagiaria da Genesis Clinica de Reprodução Humana.
⁵Estudante de Medicina da Universidade de Passo Fundo, Rio Grande do Sul.

Received September 14, 2009
Accepted December 12, 2009

Correspondência:
Alcides Clemente Tarasconi
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Passo Fundo, RS.
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Fax 54 3311 6599
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Local da Realização do Trabalho.
Genesis Clinica de Reprodução Humana.
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Passo Fundo, Rio rande do Sul, Brasil.
CEP 99010-070
Fone e Fax: 3311 6599

RESUMO
Objetivo: Realizar estudo comparativo entre a injeção intracitoplasmática de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI), e a injeção intracitoplasmática de espermatozóides convencional (ICSI), avaliando-se a eficácia das mesmas quanto às taxas de fertilização, clivagem e qualidade embrionárias.
Métodos: Foram analisados 36 ciclos de injeção intracitoplasmática. Nestes ciclos, foram obtidos 603 oocitos maduros (MII), que foram injetados com espermatozóides selecionados por duas diferentes técnicas. Os oocitos obtidos de cada paciente foram divididos em dois grupos (A e B). No grupo A (302 oocitos), foi utilizado, para avaliar a morfologia dos espermatozóides a serem injetados, um equipamento convencional, que propicia um aumento de 400X (ICSI convencional). No grupo B (301 oocitos), foi utilizado, para a seleção dos espermatozóides, um equipamento, que permite um aumento de 6800X, (IMSI). Depois de realizado o cultivo embrionário, foram avaliadas as taxas de fertilização, clivagem e a qualidade embrionária até o dia 3, em cada grupo.
Resultados: A taxa de fertilização total no grupo A foi de 78,81%, e no grupo B 81,06%.A taxa de clivagem do grupo A foi 97,29%, e no grupo B 96,41%. O percentual de embriões de boa qualidade (grau I e II), no dia 2, no grupo A foi 79,53% e no grupo B 78,13%. O percentual de embriões de boa qualidade no dia 3, no grupo A foi 77,41% e no grupo B 78,81%.
Conclusão: Não se evidenciou diferenças significativas nas taxas de fertilização, clivagem e qualidade embrionária até o dia 3, comparando-se os dois métodos de seleção espermática.

Palavras-chave: ICSI, IMSI, qualidade embrionária, morfologia espermática

ABSTRACT
Objective: To develop a comparative study among intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) and conventional intracytoplasmic sperm injection (ICSI), assessing the efficacy of both in fertilization rates, cleavage and embryo quality.
Methods: 36 cycles of intracytoplasmic sperm injection have been analyzed. In these cycles were obtained 603 mature oocytes (MII), which were injected with sperm selected by two different techniques. The oocytes obtained of each patient were divided into two groups (A and B). In group A (302 oocytes), were employed, to assess the morphology of sperm to be injected, the conventional equipment that provides optic magnification of 400 X (conventional ICSI). In group B (301 oocytes), were employed an equipment that provides an optic magnification of 6800X, (IMSI). After embryo culture was performed, fertilization rates, cleavage and embryo quality until day 3, on each group, were analyzed.
Results: The total fertilization rate in group A was 78,81%, and in group B, 81,06%. The cleavage rate in group A was 97,29% , and in group B, 96,41%. The percentage of good quality embryos (grade I e II), in day 2, in group A was 79,53% and in group B, 78,13%. The percentage of good quality embryos on day 3, in group A was 77,41% and in group B 78,81%.
Conclusion: There were no significant difference in fertilization rates, cleavage and embryo quality to day 3, comparing these two methods of sperm selection.

Key Words: ICSI, IMSI, embryo quality, sperm morphology

INTRODUÇÃO
A primeira grande revolução no campo da reprodução humana ocorreu a partir da divulgação do nascimento da primeira criança gerada por técnica de fertilização “in vitro” (Steptoe & Edwards, 1978). Tal acontecimento gerou um grande incremento, tanto na utilização, quanto na pesquisa de novas técnicas e tecnologias a serem aplicadas no campo de reprodução assistida, com o objetivo de solucionar problemas de infertilidade, até então, sem nenhuma expectativa de resolução.
Posteriormente foi demonstrada (Krueger et al., 1988) a influencia da morfologia espermática, nos resultados, em ciclos de fertilização “in vitro”, constatando o aumento nas taxas de gestação, quando eram utilizados espermatozóides oriundos de homens com avaliações da qualidade do sêmen dentro da normalidade, em comparação com ciclos em que havia alterações morfológicas no sêmen utilizado.
A segunda grande revolução, no campo da reprodução humana, especialmente em relação à infertilidade masculina, foi provocada pelo desenvolvimento de uma nova técnica de fertilização “in vitro”, a injeção intracitoplasmática de espermatozóides (Van Steirteghem et al., 1993). Tal técnica consiste na micro injeção de um único espermatozóide, selecionado morfologicamente, através de um sistema óptico que propiciava originalmente, um aumento de 400X.
Demonstrou-se posteriormente que, indivíduos com morfologia seminal normal, que realizavam procedimentos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides, apresentavam resultados superiores quando comparados a indivíduos que apresentavam alterações na morfologia seminal (Mansour et al., 1995).
Entretanto, um ano depois, , publicaram-se dados de 354 ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides, não encontrando aumento nas taxas de gestação correlacionadas com melhor morfologia espermática (Slavander et al., 1996). Criou-se assim, a necessidade da realização de um maior número de trabalhos sobre o tema, para se chegar a uma posição mais definitiva e contundente. A importância da morfologia da cabeça dos espermatozóides, em relação aos resultados de gravidez, em ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) foi demonstrada (Tasdemir et al., 1997). Estes autores constataram que a micro injeção de espermatozóides com alterações morfológicas na cabeça, avaliadas por sistema óptico convencional, que propiciava um aumento de 400x na imagem dos espermatozóides, diminuíam as taxas de gestação, em comparação com ciclos em que se utilizavam espermatozóides com morfologia normal.
Bartoov et al. (2002) publicaram trabalho pioneiro, demonstrando um novo método de avaliação da morfologia espermática, para a seleção dos espermatozóides a serem utilizados em procedimentos de injeção Intracitoplasmática. Tal método consiste na visualização e seleção morfológica dos espermatozóides, através da utilização de um equipamento constituído por um microscópio de alta resolução, equipado com um sistema óptico que permite uma excepcional visualização, de todas as estruturas do espermatozóide, com um aumento que pode atingir, dependendo da configuração de cada equipamento, entre 6000x e 12000x. Com a utilização de tal equipamento, os autores demonstraram um aumento nas taxas de implantação embrionárias e de gestação, em comparação com a utilização de espermatozóides selecionados morfologicamente por equipamentos ópticos convencionais. Este equipamento permite uma visualização do espermatozóide em tempo real, ou seja, analisando todas as suas estruturas, especialmente seu núcleo, com o mesmo se movendo, permitindo-se assim, a escolha do espermatozóide morfologicamente mais adequado, técnica denominada pelos autores de IMSI.
Posteriormente, divulgou-se trabalho (Berkovitz & Bartoov, 2005), com um maior numero de casos, demonstrando que a utilização de espermatozóides morfologicamente selecionados, aumentava as taxas de gestação, assim como, diminuíam as taxas de abortamentos. Também foi demonstrado, no mesmo estudo, que a utilização de espermatozóides sem nenhuma alteração nuclear, em comparação com a utilização de espermatozóides com alguma alteração nuclear (somente realizada em casos de ausência de espermatozóides com morfologia nuclear normal), trazia vantagens, em termos de resultados, quanto às taxas de gestação e abortamentos. Avaliando-se os principais trabalhos publicados sobre o tema, tem-se a clara impressão de que a morfologia espermática tem uma influencia direta no sucesso dos procedimentos de fertilização “in vitro” com injeção Intracitoplasmática de espermatozóides. Os trabalhos referidos nesta revisão sugerem fortemente que a melhor seleção dos espermatozóides é realizada com o equipamento que permite um aumento maior da imagem. Nosso trabalho, prospectivo e randomizado, tendo como única variável o método de seleção dos espermatozóides a serem empregados, convencional ou com maior magnificação, pretende demonstrar se existe melhoria nas taxas de fertilização, de clivagem, e na qualidade embrionária, com a utilização de uma seleção mais acurada dos espermatozóides.

MÉTODOS
Pacientes:
Este estudo foi realizado no período de Abril a Julho de 2009, na Genesis – Clínica de Reprodução Humana, Passo Fundo, RS, Brasil. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Passo Fundo, Rs e CONEP FR – 210112.
. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre esclarecido, concordando com a utilização dos dados de seus tratamentos para publicação de trabalhos científicos. Trata-se de um trabalho prospectivo e randomizado, tendo sido incluídos neste estudo, 36 casais com infertilidade, independente do fator causal. A fim de avaliar mais diretamente o método de seleção dos espermatozóides e sua influencia nas taxas de fertilização, clivagem e qualidade embrionárias, foram utilizados somente ciclos em que os espermatozóides foram oriundos do ejaculado. Também se excluíram do estudo os ciclos em que a punção folicular tenha recuperado um número inferior a 10 oocitos maduros (MII), aptos a serem utilizados nos procedimentos de injeção intracitoplasmática, o que tecnicamente facilitou a realização do trabalho.

Estimulação ovariana e recuperação oocitária:
O bloqueio hipofisário foi atingido com a utilização do análogo agonista do Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (Gonadotrophin Realising Hormone – GnRH, Lupron Kit™, Abbott S.A, Paris, Franca), seguido por hiperestimulação ovariana controlada, com a administração de Hormônio Folículo Estimulante recombinante (Recombinant Follicular Stimulating Hormone – rFSH, GonalF™, Serono, Genebra, Suíça), em dose inicial de 150UI, com ajustes de doses de acordo com a resposta de cada paciente. A indução da ovulação foi acompanhada pela realização de ultra-sonografias transvaginals seriadas e dosagens séricas de estradiol, conforme a necessidade de cada caso. Quando o folículo dominante atingiu 18mm ou pelo menos dois folículos atingiram de 16 a 18mm de diâmetro, foram administrados 250ug de Gonadotrofina Coriônica Humana recombinante (Recombinant Human Corionic Gonadotrophin - rhCG, Ovidrel™, Serono, Genebra, Suíça) para maturação folicular final. A punção folicular foi realizada de 34 a 36 horas apos a administração do rhCG. Os oocitos recuperados foram incubados em micro-gotas de Fluido de Tuba Uterina Humano (Human Tubal Fluid – HTF, Irvine, EUA), suplementado com 10% de Albumina Sérica Humana (Human Seric Albumin – HSA, Irvine, EUA), não tamponado, cobertas com óleo mineral (Oil for Embryo Culture - Irvine, EUA) previamente equilibrado em ph e temperatura. Apos o cultivo inicial de 4 a 6 horas, os oocitos foram expostos a uma solução contendo hialuronidase (gotas de 150μL de meio de cultivo Hepes tamponado, contendo 80UI/mL de hialuronidase – Irvine, EUA) por 30 segundos. Posteriormente, foi realizada a retirada total das células do complexo cumulus-corona mecanicamente, por intermédio de sucessivas pipetagens, utilizando-se pipetas Pasteur de diâmetros decrescentes. Apos denudados, os oocitos foram numerados progressivamente, e cultivados separadamente, sendo assim possível acompanhar o desenvolvimento individualizado de cada oocito, durante todo o processo de fertilização e de cultivo embrionário. As amostras de sêmen de cada casal foram todas coletadas por masturbação, uma vez que somente utilizamos para o trabalho, casos com sêmen do ejaculado.

Divisão dos oocitos para a injeção intracitoplasmática:
Em todos os ciclos, os oocitos MII obtidos foram divididos em dois grupos (A e B), sendo que cada grupo continha um numero muito aproximado de oocitos. Os oocitos do grupo A foram destinados a serem micro injetados com espermatozóides selecionados morfologicamente por um equipamento óptico convencional, utilizando um microscópio invertido da marca Nikon Eclipse 300, com objetiva de 40X e ocular de 10X, proporcionando um aumento na imagem de 400x (ICSI). Os oocitos do grupo B foram destinados a serem micro injetados com espermatozóides selecionados morfologicamente através de outro sistema, utilizando um microscópio invertido da marca Nikon TE 2000, equipado com ópticas Nomarski DIC, com objetiva de imersão de 100x, conforme técnica descrita por Bartoov e cols. (2003), onde as imagens são capturadas por uma color vídeo câmera Sony DXC 950 P e um monitor de vídeo Sony Trinitron 14 polegadas, o que nos possibilita a visualização da imagem, com um aumento de 6800x (IMSI). O principal critério morfológico utilizado para a seleção dos espermatozóides em maior aumento foi a completa normalidade do núcleo, evidenciada pela ausência de vacúolos em seu interior. No equipamento convencional, esta característica não pode ser verificada, uma vez que em um aumento de 400x, somente podem ser visualizados vacúolos volumosos, não se podendo, de forma segura, excluir a presença de pequenos vacúolos.Esta randomização nos permitiu uma divisão da amostra uniforme, tendo-se como única variável, o método de seleção dos espermatozóides para a micro injeção (grupo A ou B), uma vez que o processo de injeção intracitoplasmática seguiu a mesma técnica, em todos os oocitos. O tempo

Injeção intracitoplasmática de espermatozóides e cultivo embrionário:
A injeção intracitoplasmática foi realizada de acordo com a técnica padrão descrita por Palermo e cols, (1992). Todos os procedimentos da micro injeção foram realizados pelo mesmo embriologista. Os oocitos do grupo A foram colocados em uma placa própria para o procedimento de injeção intracitoplasmática, contendo micro gotas com espermatozóides a serem selecionados morfologicamente com um aumento de 400x. Os oocitos do grupo B foram colocados em placa semelhante contendo micro gotas com espermatozóides previamente selecionados com um aumento de 6800x. As placas contendo espermatozóides dos dois grupos foram mantidas sempre em idênticas condições durante seu manuseio, eliminando-se assim qualquer possibilidade de que o tempo gasto pelo operador para a seleção dos espermatozóides pudesse influenciar nos resultados. Depois de terminada a micro injeção, os oocitos de cada grupo foram colocados em placas de cultivo distintas, em gotas numeradas de Fluido de Tuba Uterina Humano (Human Tubal Fluid – HTF, Irvine, EUA), suplementado com 10% de Albumina Sérica Humana (Human Seric Albumin – HSA, Irvine, EUA), não tamponado, cobertas com óleo mineral (Oil for Embryo Culture – Irvine, EUA), previamente equilibrado em pH e temperatura, e levados a uma incubadora de CO2, que mantém um ambiente de cultivo, em uma temperatura de 37 graus centígrados, com uma concentração de CO2 de 6%. Após 16 a 18 horas em cultivo, a fertilização foi verificada pela presença de dois pró-nucleos distintos. Em seguida, os oocitos fertilizados, foram novamente colocados em cultivo, sob mesmas condições, e aproximadamente 24 horas da verificação da fertilização, foram novamente examinados, para a presença da clivagem e avaliação da qualidade embrionária, seguindo critérios morfológicos (Veeck, 1991), através de parâmetros como numero e simetria de blastômeros, e grau de fragmentação embrionária. Nos casos em que o cultivo embrionário foi prolongado por mais 24 horas, também em condições idênticas de cultivo, a analise da qualidade embrionária foi novamente realizada, seguindo os mesmos critérios. Para a análise estatística dos dados foi utilizado o test t de student’s, considerando-se valores significativos quando o p-valeu = 0,05 entre as variáveis.

RESULTADOS
Foram analisados um total de 36 ciclos de fertilização ”in vitro” com folículo aspiração, tendo sido recuperados de tais procedimentos um total de 603 oocitos maduros (MII), aptos a serem utilizados em procedimentos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Os oocitos recuperados de cada paciente foram divididos em dois grupos, (A e B). Fizeram parte do grupo A, somando-se todas as pacientes, um total de 302 oocitos, e do grupo B, um total de 301 oocitos.. Os dados da evolução da fertilização e do desenvolvimento embrionário em ambos os grupos são apontados na tabela I.

Tabela I. Evolução do desenvolvimento embrionário ocorrido comparando-se as duas técnicas de seleção de espermatozóides para injeção intracitoplasmática.

A taxa de fertilização total no grupo A foi de 78,81% em comparação com o grupo B que foi de 81,06%. A taxa de fertilização normal foi de 73,18% para o grupo A e 74,09% para o grupo B. A taxa de fertilização anormal no grupo A foi de 7,28% e no B foi de 7,64%. A Taxa de oocitos não fertilizados foi de 10,93% para o grupo a e 11,63% para o grupo B. A taxa de clivagem no grupo A foi de 97,29% e no grupo B foi de 96,41%. O percentual de embriões de boa qualidade (grau I e grau II), no dia 2 no grupo A foi de 79,53% e no grupo B foi de 78,13%. O percentual de embriões de boa qualidade no dia 3 no grupo A foi de 77,41% e no grupo B foi de 78,81%. Avaliando-se os dados acima descritos, concluímos que o método de seleção dos espermatozóides para micro injeção não influenciou o desenvolvimento embrionário, em nenhuma de suas etapas, até o dia 3.

DISCUSSÃO
O objetivo deste trabalho foi demonstrar se a seleção morfológica de espermatozóides para serem utilizados em procedimentos de injeção intracitoplasmática, através de um sistema óptico mais potente, o qual nos permite uma visualização mais detalhada, em comparação com o método tradicionalmente utilizado, teria influencia nas etapas iniciais do desenvolvimento embrionário. A qualidade dos espermatozóides utilizados para procedimentos de injeção intracitoplasmática exerce um papel muito importante durante o processo de fertilização (Swann et al., 2006; Saunders et al., 2007). A viabilidade dos embriões utilizados para transferências depende da qualidade biológica dos gametas envolvidos no processo de fertilização. Os efeitos paternos, tanto precoces quanto tardios, tem sido apontados como parte importante em falhas repetidas em tentativas de técnicas de reprodução assistida, assim como o desenvolvimento embrionário pode ser comprometido por deficiências no genoma nuclear espermático ou por fatores citoplasmáticos derivados dos espermatozóides (Benchaib et al., 2003; Tesarik, 2005). Estudos recentes tem demonstrado um melhor desenvolvimento embrionário ate o estagio de blastocisto quando se utilizam espermatozóides morfologicamente selecionados (Zech et al., 2007; Zech et al., 2007; Cassuto et al., 2007). Tem-se também demonstrado um aumento nas taxas de gestação (Bartoov et al., 2003; Junca et al., 2004; Berkovitz et al., 2008) , quando utilizados espermatozóides morfologicamente selecionados nos procedimentos de injeção intracitoplasmática, em presença de alterações morfológicas seminais. Aparentemente, a utilização de espermatozóides selecionados morfologicamente em procedimentos de injeção intracitoplasmática também aumentaria a possibilidade do nascimento de um maior numero de crianças saudáveis em comparação com a técnica de ICSI convencional (Berkovitz et al., 2007). Todos estes dados nos levam a concluir que a utilização de espermatozóides morfologicamente selecionados, com características nucleares mais adequadas, especialmente nos casos de alterações seminais importantes, terão um impacto positivo tanto nas taxas de formação de blastocistos quanto nas taxas de gestação, assim como na diminuição nas taxas de abortamento (Bartoov et al., 2003; Oliveira, 2007), em ciclos de FIV com injeção intracitoplasmática. Entretanto, nosso trabalho demonstrou que a utilização de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI) em comparação com a seleção morfológica tradicional (ICSI), não teve nenhuma influencia nas taxas de fertilização, clivagem embrionária e no desenvolvimento embrionário até o dia 3. Tal achado se deve provavelmente ao fato de que, na seleção pela técnica de IMSI, se evita a utilização de espermatozóides com vacúolos, os quais não conseguem ser evidenciados pela ICSI convencional. A presença de vacúolos na cabeça dos espermatozóides esta correlacionada com a presença de um maior grau de DNA fragmentação, fato determinante do efeito adverso paterno tardio nas fases mais avançadas do desenvolvimento embrionário (Tesarik, 2004), fato que determina um pior prognóstico em tratamentos de reprodução assistida ( Berkovitz et al., 2006). Esta seria a explicação para o fato de os embriões oriundos da utilização de espermatozóides morfologicamente selecionados terem uma evolução e morfologia iniciais muito semelhante aos embriões oriundos de espermatozóides selecionados pela técnica tradicional, uma vez que o efeito paterno tardio relacionado a fragmentação de DNA se manifesta nas fases mais tardias do desenvolvimento embrionário. Tal afirmativa fica reforçada pelo fato de os embriões oriundos da IMSI terem um melhor desenvolvimento até o estagio de blastocisto, assim como melhores taxas de implantação e menores taxas de abortamento, em comparação com os embriões da ICSI convencional, provavelmente devido ao fato de os embriões resultantes da IMSI terem sido fertilizados com espermatozóides com menos vacúolos, consequentemente com menor grau de DNA fragmentação. Concluímos que, a utilização de espermatozóides morfologicamente selecionados (IMSI) nos procedimentos de injeção intracitoplasmática, em comparação com a técnica de seleção convencional (ICSI), não apresenta melhora no desenvolvimento embrionário até o dia 3, apesar de existirem claras evidencias de que melhore as taxas de formação de blastocistos, de implantação e acarretar uma diminuição nas taxas de abortamento.