JBRA Assist. Reprod. 2010;14(1):33-36
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2011.14.1.07
1Conceber – Centro de Medicina Reprodutiva
2Faculdades Pequeno Príncipe
RESUMO
As baixas taxas de implantação de embriões de pacientes acometidos na Reprodução Humana Assistida (RHA), encontrados na literatura mundial, nos leva a uma necessidade de técnicas mais avançadas como a do metaboloma, para que haja uma melhor seleção embrionária, combinando com um preparo endometrial correto para que a receptividade deste embrião tenha sucesso. A inabilidade de avaliar adequadamente o potencial reprodutivo de embriões individualmente, bem como as altas taxas de gravidez múltiplas nos leva à um estudo profundo de uma determinação rápida e não invasiva do potencial reprodutivo do embrião antes de sua transferência. A análise do metaboloma pode ser determinada através da impressão digital metabólica, distinguindo biomarcadores específicos do meio de cultura contendo secreção de alguns metabólitos derivados da função biológica expressado por proteínas, onde se encontra um possível embrião viável. Há grandes interesses na introdução de estratégias específicas de análise na espectroscopia, pois esta possui características de rapidez e exatidão de praticável aplicação clínica.
Palavras chave: técnicas reprodutivas assistidas, metaboloma, implantação do embrião
ABSTRACT
Low implantation rates of patients involved in human assisted reproduction, found in world wide literature, leads us to a need of more advanced techniques as metabolomics, in order to select a better embryo, added to an ideal endometrial preparation leading to a successful implantation. Due to inability of adequate individually embryo evaluation, as well as the high multiple pregnancy rates lead us to a need, a study of a fast and non-invasive determination of the reproductive potential of the embryo before its transference. Metabolomics analysis could be determined through the metabolic fingerprint, distinguishing specific biomarkers from culture media contents of some metabolites derived from the biological function expressed by proteins, from a possible viable embryo. It has great interest in introduction of specific strategies of analysis in the spectroscopy, therefore its characteristics of fast and exactness of practical clinical application.
Keywords: reproductive techniques, metabolomics, embryo implantation
INTRODUÇÃO
As baixas taxas de implantação de embriões no endométrio de pacientes submetidos a procedimentos na Reprodução Humana Assistida (RHA), é uma realidade. Devido a isto, aumenta-se o número de embriões transferidos, o que leva à um aumento na taxa de natalidade múltipla, parto prematuro e baixo peso dos bebês ao nascimento. Dados encontrados na literatura mundial indicam uma necessidade de técnicas mais avançadas para melhor seleção embrionária, bem como um preparo endometrial correto para que a nidação dos embriões tenha sucesso (Bromer et al., 2008).
Justifica-se a análise do metaboloma, onde consiste quantificar a proteína ubiquitina nos meios de cultura gastos pelo embrião. Esta proteína distingue embriões com maior quantidade de marcadores celulares de degradação, para que ocorra uma nidação com sucesso ao endométrio materno.
Este estudo visa abordar técnicas avançadas na RHA, enfatizando o metaboloma, através de análise de publicações a partir de 2006, por intermédio de buscas sistemáticas utilizando principalmente banco de dados eletrônicos e acervo bibliográfico disponível em revistas específicas.
IMPLANTAÇÃO EMBRIONÁRIA E TAXAS DE GESTAÇÃO
A implantação é um fenômeno que envolve uma interação entre o embrião e o endométrio materno. Durante o ciclo menstrual, há um período curto e bem determinado, no qual a interação materno-embrionária é ideal, permitindo a adesão e a invasão do blastocisto no endométrio secretor preparado pela progesterona. Esse período é chamado janela de nidação ou janela de implantação, no qual ocorrem alterações na morfologia epitelial endometrial, caracterizadas pelo aparecimento de projeções de membrana chamadas pinópodes. A expressão de fatores de crescimento e citoquinas, tem um papel importante no fenômeno da implantação, e funcionam como biomarcadores da implantação embrionária. A compreensão da função desses biomarcadores é importante para diagnosticar a viabilidade embrionária (Cavagna et al., 2006).
O endométrio humano é bastante seletivo quanto à implantação do embrião e assim, este deve ser realizado dentro do período do ciclo feminino compreendido entre o 19º e 21º dia no ciclo natural, sendo que nos ciclos induzidos este período é mais precoce. Com o aumento da idade, a fecundidade natural e as taxas de gestação são reduzidas mesmo na reprodução humana assistida. Este declínio ocorre a partir dos 30 anos e já aos 40 anos reduz a 50% a taxa de gestação (Bromer et al., 2008). O fator preponderante para esta redução de fertilidade é a queda da qualidade oocitária. Estudos apontam que mulheres receptoras de óvulos de doadoras jovens, têm a mesma taxa de gestação clínica e de parto que as mulheres jovens. Este fator é considerado um marcador indireto na reprodução humana. Entre os testes para avaliar a reserva ovariana de cada mulher, empregamse os marcadores bioquímicos, os métodos de imagem e os testes dinâmicos. Os marcadores bioquímicos são o hormônio folículo estimulante (FSH), estradiol, inibina A e B e hormônio anti-mülleriano (AMH); os marcadores de imagem são a contagem de folículos antrais e volume ovariano total. Os testes dinâmicos por sua vez, são testes após estímulo com clomifeno e resposta ao estradiol e inibina após estímulos com FSH ou agonista do GnRH (hormônio liberador de gonodatrofinas) (Abreu et al., 2006).
Desta forma, os testes para análise da reserva ovariana, quando isolados, não devem ser supervalorizados porque não são de diagnóstico preciso. Ou seja, seu uso deve ser cauteloso e feito sempre conjuntamente com a idade, pois mulheres acima de 35 anos com a taxa de FSH moderadamente elevada (10-20 UI/L) ainda apresentam taxas de gestação satisfatórias, apesar de apresentarem maior risco de cancelamento de ciclos de estimulação ovariana (Abreu et al., 2006).
A seleção do embrião com maiores chances de implantação e gestação é um ponto crítico para o sucesso das técnicas de RHA, principalmente devido à tendência mundial de transferir um embrião por ciclo. Diversos métodos vêm sendo propostos sem que exista ainda um consenso mundial sobre qual deles, isoladamente, seria o de maior poder prognóstico de implantação e gestação (Bos-Mikich et al., 2007).
Métodos qualitativos avaliam características morfológicas, desde o estágio de zigoto até o de blastocisto. Por outro lado, critérios fisiológicos indiretos de viabilidade embrionária, como a dinâmica dos pronúcleos e das divisões celulares e o início da compactação têm recebido cada vez mais credibilidade (Bos-Mikich et al., 2007).
METABOLOMA
O metaboloma é usado para se referir ao conjunto de todos os metabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo. Os metabólitos por sua vez, regulam a atividade das proteínas, o processo de transcrição e tradução, além de servirem de substratos para síntese de DNA e RNA, e modificação de proteínas e lipídeos. Portanto, os metabólitos são os produtos finais do metabolismo celular desempenhando um papel muito importante na conexão de diferentes vias metabólicas, que operam dentro de uma célula viva. O nível é determinado pela concentração e propriedades das enzimas, sendo assim uma função do sistema complexo regulatório dentro das células (Silas & Gombert, 2006). A identificação do nível dos metabólitos é desse modo, um complemento fundamental na determinação da função gênica. O metaboloma de uma célula ou tecido tem a capacidade de responder rapidamente a qualquer alteração ambiental e ou genética, sendo inclusive capaz de caracterizar mutações ditas silenciosas. O que todos os cientistas procuram é o exame ideal, que forneça o perfil metabólico do paciente, com todas as análises feitas de uma só vez onde cada pessoa poderia ser avaliada como um todo (Silas & Gombert, 2006).
Na reprodução humana assistida, isso é possível parcialmente visto que as técnicas reprodutivas ajudadas (TRA) são cada dia mais populares, pois é através delas que é possível observar as fases iniciais do desenvolvimento embrionário (Silas & Gombert, 2006). Em procedimentos anteriores, a morfologia e fragmentação eram avaliadas no embrião, hoje através da tecnologia de detecção pelo perfilamento metabolômico do embrião, pode ser realizada a bioespectroscopia baseada em Raman, a qual oferece um grande potencial para avaliação não invasora do processo reprodutivo embrionário, antes de sua implantação, melhorando assim a habilidade dos embriologistas de determinar o potencial reprodutivo dos embriões individualmente (Nagy et al., 2008).
No perfilamento metabolômico estão inclusos a avaliação da glicose, lactato, piruvato e o metabolismo do ácido aminado, enquanto que no perfilamento proteômico é realizada a avaliação do consumo de oxigênio. Estudos recentes mostram que o perfilamento metabolômico de meios de cultura dos embriões permite avaliar diferentes concentrações de proteínas, em determinados dias, associadas com a fragmentação e morfologia embrionária (Bromer et al., 2008). Esta avaliação biotecnológica visa distinguir biomarcadores específicos pela avaliação de modificações na composição química do meio de cultura, usando uma aproximação infravermelha rápida da espectroscopia (NIR). O NIR analisa separadamente o algoritmo genético seletivo do comprimento de onda, determinando as regiões do material genético do embrião que será implantado no útero (Sakkas et al., 2008).
Para que ocorra a ativação do genoma embrionário, depende de uma complexa série de eventos, como a transcrição através de ondas até atingir o estágio de 2 células (ativação do genoma) e após no estágio de 4 células (diferenciação) com as mudanças na estrutura nuclear, juntamente com o conteúdo citoplasmático que regulamenta estas ondas de atividade transcricional. Portanto, uma vez que o genoma embrionário foi ativado, genes específicos e proteínas são expressos de acordo com o tempo de desenvolvimento. Assim, embriões com um genoma funcional e proteoma corretamente ativado tem um potencial mais elevado de viabilidade (Mandy et al., 2006).
Mandy et al em 2006 revela que na análise do secretoma de embriões em desenvolvimento e degeneração durante a mesma fase de desenvolvimento, indicam uma diferença significativa na expressão de um biomarcador protéico com 8,5kDa. Os embriões em desenvolvimento apresentaram alta expressão do biomarcador protéico de 8,5kDa, e embriões em estado de degeneração exibiram uma relativa ausência da proteína. Esses dados sugerem que a proteína cujo peso molecular é de 8,5kDa “ubiquitina” está correlacionada com o desenvolvimento do embrião em curso. No entanto, há uma possibilidade remota que os embriões não liberadores desta protease possam degradar a proteína. Este biomarcador protéico analisado no quinto dia de desenvolvimento foi abundantemente encontrado.
Outros estudos realizados por Mandy et al, 2006 investigando a ubiquitina durante o desenvolvimento de embriões humanos, tem sugerido que a participação da proteína no processo de implantação é provavelmente, através do controle das atividades das principais moléculas de sinalização. Portanto, é concebível que a quantificação da ubiquitina só pode ser correlacionada com a competência no desenvolvimento dos embriões, mas também está ligada ao potencial de implantação materno-embrionário e sua viabilidade.
ANÁLISE
A análise do metaboloma pode ser determinada através da impressão digital metabólica, investigando o meio de cultura onde se encontra um possível embrião viável. A investigação ideal na seleção dos embriões para transferência deve ser minimamente invasiva, o que justifica a análise do meio de cultura para medir os componentes liberados pelo embrião (Posillico, 2007). Os índices de viabilidade do potencial reprodutivo do embrião devem ser calculados para cada amostra, ou seja, cada embrião analisado. Tanto a sensibilidade como a especificidade de predição são calculados de modo que o perfil metabolômico dos meios de cultura, bem como a viabilidade embrionária sejam demonstradas em um gráfico individualmente (Sakkas et al., 2008).
Os resultados na aplicação da SELDI-TOFMS (Surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-light mass espectrometry), espectometria de massa por ionização à laser confirma os dados de secreção do blastocisto no meio de cultura do 5° ao 6° dia de desenvolvimento onde a proteína ubiquitina se encontra relativamente aumentada. É provável que mais de uma proteína esteja envolvida neste desenvolvimento, portanto estes biomarcadores devem ser investigados com a finalidade de um diagnóstico clínico conhecido (Magli et al., 2009).
Por sua vez, a espectroscopia de Raman quando aplicada, permite uma avaliação simultânea de um grande número de análises do meio, rendendo um perfil mais próximo à escala inteira dos metabólitos secretados. O diagnóstico de exatidão para a falha na implantação ou diagnóstico de predição na implantação de embriões transferidos era maior que 80% (Magli et al., 2009).
Em estudo realizado por Magli e colaboradores, em 2009 a espectroscopia de Raman previu a sensibilidade de 86% e especificidade de 76,5%, enquanto a NIR forneceu uma sensibilidade de 75% e especificidade de 83,3%, concluindo assim que as duas metodologias se completam com a correlação da bioinformática, indicando melhores resultados positivos na gravidez (Seli et al., 2007).
Em pesquisa realizada pela espectroscopia de NIR (Vergowu et al., 2008) com 333 pacientes programados para a fecundação através da FIV, foram selecionados e implantados baseados em critérios morfológicos, embriões nos dias 2 e 3. Como resultado se obteve uma regressão logística dos fatores correlacionados aos resultados da gravidez, mostrando que a idade materna, a porcentagem da fragmentação e a viabilidade relativa demonstraram estar relacionadas. A exatidão na avaliação de embriões viáveis no terceiro dia pelo perfilamento metabolômico era 53,6% e a exatidão da seleção morfológica era 38,5%. Além disso, o valor preditivo positivo do perfilamento metabolômico era 0,365% e o valor preditivo negativo era 0,830%. Concluindo que o perfilamento metabolômico de NIR nos meios de cultura esgotados pelo embrião distingue embriões viáveis dos não viáveis para a reprodução (Scott et al., 2008).
CONCLUSÃO
Através do estudo com marcadores bioquímicos específicos pode se evidenciar que a seleção mais apurada dos embriões aumenta a eficiência da FIV, visto que possibilita melhores resultados na transferência de um único embrião, proporcionando ainda um aumento na taxa de implantação embrionária.
Esta análise pode ser realizada de diversas maneiras, ou seja diversas técnicas através de aparelhos de diagnóstico como NIR, SELDI-TOFMS, Raman e outros, que de acordo com análises encontradas na literatura, demonstram picos da proteína ubiquitina, cujo peso molecular é de 8,5Kda indicando uma possível sinalização da degradação celular em embriões com maior chance de viabilidade.
Com os avanços da tecnologia e estudos freqüentes, espera-se que a RHA tenha uma maior precisão em seus procedimentos e resultados.
De acordo com as considerações apontadas pelos autores citados neste estudo, observa-se que os métodos não invasivos, e em especial a análise do metaboloma, são úteis para a obtenção de melhores resultados na RHA, aumentando a taxa de implantação bem como diminuindo a probabilidade de gravidez gemelar, parto prematuro e baixo peso dos bebês ao nascimento.
Agradecimentos
Dr. Rogério Saad Vaz – Faculdades Pequeno Príncipe. Ms. Mariana Araujo Pereira – Faculdades Pequeno Príncipe.