JBRA Assist. Reprod. 2010;14(2):36-40
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.14.2.07
Indução da foliculogênese em ovários congelados/ descongelados e transplantados para o peritôneo de ratas
Folliculogenesis in transplanted rat ovaries after freezing/thawing
1Pós Graduação em Saúde da Mulher - Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte – Minas Gerais
2ORIGEN - Centro de Medicina Reprodutiva – Belo Horizonte – Minas Gerais
RESUMO
Objetivo: Avaliar, através de análise histológica, a capacidade do ovário de ratas congelados/descongelados e posteriormente transplantados para o peritônio, responder à indução da foliculogênese com hormônio folículoestimulante recombinante.
Métodos: Um total de 30 ratas da raça Holtzman, da mesma idade, foi dividido em 3 grupos, sendo o grupo I submetido a indução da foliculogênese com FSH após congelamento/descongelamento e transplante do ovários; grupo II teve indução com FSH após transplante; grupo III teve indução da ovulação (controle) apos laparotomia. O congelamento foi feito pela técnica de congelamento lento, com crioprotetor DMSO. O descongelamento foi feito à temperatura ambiente no dia do transplante. A indução foi realizada no 15° dia após a cirurgia. Os ovários de todas as ratas foram removidos no 4° dia do ciclo estral para analise histológica.
Resultados: Os ovários do grupo I apresentaram um total de quatro folículos primários, oito pré-antrais e 13 antrais; no grupo II, sete folículos primários, 11 préantrais e 10 antrais; e o grupo III, um folículo primário, 14 pré-antrais e 16 antrais. Os ovários congelados/ descongelados e transplantados para o peritoneo responderam ao estímulo com FSH de forma semelhante a ovários em sítio natural e em relação aos transplantados sem congelamento.
Conclusões: A criopreservação, descongelamento e transplante do tecido ovariano de ratas, sem reanastomose vascular para o peritonio, não prejudicou o desenvolvimento folicular após a administração do hormônio folículo-estimulante.
Palavras-chave: ovários, transplante, congelamento, câncer, foliculogênese, indução
ABSTRACT
Objective: Evaluate the capacity of transplanted rat ovaries to respond to ovulation induction with follicular stimulation hormone, after freezing/thawing.
Methods: A total of 30 Holtzman rats at the same age, were included in the study and split in 3 groups. In group I ovulation induction with FSH was performed after Freezing/Thawing and transplantation of the ovary to the peritoneum; in group II ovulation induction with FSH was performed after transplantation of the ovary to the peritoneum; in group III, ovulation induction with FSH was performed after laparotomy was performed (shame operation). Slow freezing was performed in all groups using DMSO and thawing was performed at room temperature at the day transplantation was performed. Ovulation induction was performed on day 15 after surgery. Ovaries were removed on day 4 of the oestral cycle for histological analyses.
Results: Ovaries of group I had four primary follicles, eight pre-antral follicles and 13 antral follicles; group II, seven primary follicles, 11 pre-antral follicles and 10 antral follicles; and group III one primary follicle, 14 preantral follicles and 16 antral follicles. Frozen/thawed and transplanted ovaries did respond to ovulation induction with FSH similar to normal and non-frozen ovaries.
Conclusion: Cryopreservation, thawing and transplantation of rat ovarian tissue, with no vascular anastomosis, to the peritoneum, did not jeopardize follicular development after ovulation induction with follicular stimulation hormone.
Keywords: ovary, transplant, cryopreservation, cancer, folliculogenesis, induction
INTRODUÇÃO
As mulheres portadoras de patologias malignas apresentam, atualmente, longa expectativa de vida proporcionada pelos tratamentos disponíveis (Ries et al., 1999). Com a redução dos índices de mortalidade e crescimento das taxas de sobrevida, as conseqüências dos tratamentos em termos de resultados sobre a capacidade reprodutiva tornaram-se fatores importantes a serem levados em consideração (Agarwal & Said, 2004). Os tratamentos com agentes quimioterápicos, radioterapia e com cirurgias, entretanto, estão associados a significante dano gonadal. Assim, vários métodos de preservação da função gonadal têm sido propostos (Howell & Shalet, 2002).
Algumas opções estão disponíveis para preservar a fertilidade em pacientes oncológicas e dar-lhes a oportunidade de se tornarem mães após o tratamento. O congelamento de embriões, a criopreservação oocitária e a criopreservação de tecido cortical ovariano estão entre as mais recentes opções (Gosden, 2005; Meirow et al., 2005; Prates & Geber, 2009). A escolha do método a ser utilizado depende de diferentes parâmetros: do tipo e da urgência do tratamento, do tipo de tumor, da idade da paciente e da existência de parceiro (Kim, 2006).
Para as pacientes a serem submetidas ao tratamento cirúrgico (ooferectomia), o congelamento do tecido ovariano seria o mais recomendado. Uma vez findo o tratamento oncológico, o ovário pode ser descongelado e transplantado novamente para a paciente (Demesteree et al., 2006). A criopreservação tem sido realizada em estudos experimentais, com resultados bastante satisfatórios, mantendo a viabilidade do tecido germinativo (Hovatta, 2005). Mais ainda, a recuperação do tecido ovariano após o descongelamento vem sendo demonstrada por analises morfológica, imunohistoquimica e funcional (Newton et al., 1996; Candy et al., 2000; Fabbri et al., 2003; Liu et al., 2003; Segino et al. 2003).
O transplante ovariano fresco, para a cavidade peritoneal, sem reanastomose vascular, em ratas, foi descrito com sucesso por Barros et al., 2008. Lee et al. (2005) descreveram desenvolvimento folicular após transplante subcutâneo de tecido ovariano criopreservado, em ratas. Em ovários de ratas congelados/descongelados, e posteriormente transplantados sem reanastomose vascular, Prates et al., (2008) também descreveram retorno à função reprodutiva. Em ovelhas, Gosden et al. (1994) descreveram gestações, a partir de transplante autólogo de tecido ovariano fresco e após congelamento. Salle et al. (1998) mostraram desenvolvimento normal de folículos em fragmentos de ovário de ovelhas transplantados para o hilo ovariano contralateral após congelamento. Gunasena et al. (1997) obtiveram gestações em camundongos apos transplante autólogo de ovário fresco e após congelamento.
O uso de indutores da foliculogênense após congelamento/ descongelamento e transplante de tecido ovariano, foi inicialmente descrito por Wang et al. (2002). Os autores descrevem crescimento folicular nos ovários de fêmeas de camundongos induzidas com gonadotrofina da mulher menopausada superior ao observado no grupo sem indução.
Em humanos, apenas um número limitado de mulheres foi submetida à indução da foliculogênese após transplante de ovários congelados/descongelados, com resultados limitados. Um total de 25 mulheres foram submetidas ao tratamento com um pequeno número de oócitos captados, com baixa taxa e fertilização e desenvolvimento embrionário e apenas uma gestação descrita apos uso da técnica de reprodução assistida (Oktay & Sonmezer, 2004; Schmidt et al., 2005; Dolmans et al., 2009; Sanchez-Serrano et al., 2010).
O objetivo do estudo foi avaliar, através de análise histológica, a capacidade do ovário de ratas congelados/ descongelados e posteriormente transplantados para o peritônio, responder à indução da foliculogênese com hormônio folículo-estimulante recombinante.
METODOLOGIA
Foi realizado um estudo experimental controlado que utilizou ratas da raça Holtzman, nuligestas e com idade superior a 12 semanas de vida, cujo peso mínimo era de 200 gramas. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais (101/05). A abordagem dos animais foi feita de acordo com as recomendações da Declaração de Helsinque e com as Normas Internacionais de Proteção aos Animais (Cooper, 1985). As ratas foram mantidas em regime de luz/escuridão de 12/12horas com água e ração ad libitum.
Um total de 30 ratas foi dividido em três grupos com 10 ratas cada sendo: Grupo I (estudo) indução da foliculogênese, após ooferectomia, criopreservação e transplante do tecido ovariano; Grupo II (controle) indução da foliculogênese após o ooferectomia e transplante do tecido ovariano e Grupo III (controle - laparotomia branca), indução da foliculogênese.
Procedimento cirúrgico
Os animais foram operados em dois conjuntos de 15, todos pertencendo à mesma ninhada, sendo cinco para cada um dos grupos de estudo, escolhidos de forma aleatória. Foram realizadas as cirurgias seguindo-se a seguinte ordem: congelamento (Grupo I), transplante peritonial (Grupo II), controle (Grupo III), completando-se, desta forma, as 15 cirurgias. Os três grupos foram emparelhados quanto à idade das ratas e quanto à habilidade do cirurgião (a mesma equipe) no decorrer de todo o experimento.Inicialmente foi realizada analgesia e anestesia com a associação de xilazina (10mg/kg) e ketamina (60 mg/kg) por via intramuscular, seguida de tricotomia e anti-sepsia da região abdominal e abertura da cavidade abdominal e com o respectivo inventário. Nas ratas do grupo I, foram realizadas a ooforectomia bilateral e cauterização do suporte sanguíneo com cautério bipolar. Os ovários excisados foram seccionados em seu maior diâmetro e introduzidos cada um em um tubo Eppendorf distinto, contendo meio de cultura tamponado (Geber et al., 2002), e colocados em gelo. Cada rata desse grupo foi identificada por meio de pequenas incisões nas orelhas.Nas ratas do grupo II, os ovários também foram ressecados bilateralmente, seccionados pela metade e, uma das metades seccionada foi suturada em superfície de peritônio, ipsilateralmente ao ovário originário, junto à bifurcação dos vasos epigástricos inferiores superficiais. As ratas do grupo III foram submetidas à laparotomia, com o inventário da cavidade e observação criteriosa dos ovários das mesmas. Nos três grupos, após a realização dos procedimentos descritos, foi feita a sutura em monobloco de peritônio, aponeurose e pele. Depois disso, as ratas eram observadas até o seu restabelecimento e recolocadas nas respectivas gaiolas.
Congelamento/descongelamento
Os ovários removidos, e seccionados em duas metades, foram preparados para o congelamento a partir da retirada de toda a gordura peritonial e periovariana. Foi realizado o congelamento de apenas uma das metades de cada ovário. Cada fragmento foi lavado por três vezes em meio de cultura tamponado contendo 10% de substituto sintético de soro (SSS – Irvine - EUA) e então colocado em criotubos identificados contendo um volume final de 1,8 ml de crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO - Sigma - EUA) 1,5 Molar, acrescido de 10% de SSS. Em seguida, foram colocados em uma máquina de congelamento (KRYO 10 - Planer – EUA) para a realização do procedimento, seguindo-se o protocolo lento, primeiramente descrito por Newton et al. (1996). Inicialmente, a temperatura foi reduzida em 2°C por minuto até atingir a temperatura de -9°C, quando foi realizado o seeding e a temperatura foi mantida por 10 minutos. Em seguida, as rampas foram de: 3°C por minuto até -40°C e 10°C por minuto até atingir -140°C, quando os tubos foram levados para os racks e inseridos em nitrogênio líquido a -196°C, onde foram mantidos por quatro semanas (Geber et al., 2002).O descongelamento foi feito colocando-se os criotubos em banho-maria à temperatura de 37°C por 3 minutos em agitação. Os fragmentos dos ovários foram então, exaustivamente lavados em meio de cultura tamponado e colocados em novos tubos, em gelo.
Transplante após congelamento/descongelamento
No dia do descongelamento, isto é, quatro semanas após a exerese e congelamento do tecido ovariano, as ratas (grupo I) foram submetidas a uma nova laparotomia. Os fragmentos dos ovários descongelados foram então suturados na superfície peritonial junto à bifurcação dos vasos epigástricos inferiores superficiais, da mesma forma descrita para as ratas do grupo II, e cada rata recebeu seus próprios ovários.
Indução da foliculogênese
Foi utilizado o FSH recombinante (Gonal F – Serono – Brasil) na dose de 15 UI, realizado no 15° dia após a cirurgia (dia 1 do ciclo estral) por via intramuscular, nas ratas dos grupos II e III. Para as ratas do grupo I, realizou-se o mesmo procedimento 15 dias após o transplante dos fragmentos dos ovários descongelados.
Exérese dos ovários e analise histológica
Os ovários de todas as 30 ratas foram removidos no quarto dia do ciclo estral estimulado (três dias após a administração do FSH), por laparotomia, e foram mantidos em formol, para posterior avaliação histológica. Os cortes de parafina foram realizados com espessura de 6μm e as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina.Foi realizada análise quantitativa e qualitativa dos fragmentos dos ovários, com avaliação do número e do estágio de desenvolvimento folicular com aumento de 400 vezes, em uma área de 1000μm X 1000μm, locada no centro da lâmina. Os folículos foram classificados como primários, quando possuíam uma camada de células da granulosa cubóides; como pré-antrais, quando tinham duas ou mais camadas de células da granulosa, mas não mostravam um antro folicular; e como antrais, quando a cavidade antral era observada (Oktay et al., 1995).
Análise estatística
O cálculo amostral revelou a necessidade de análise de um mínimo de sete ratas por grupo, para detectar a diferença de 1,81 entre o número médio de folículos dos grupos, com poder de 80% e erro tipo I de 5%. Para a análise estatística foram utilizados os testes do qui-quadrado e a análise da mediana e dos intervalos interquartil (25–75), estes últimos devido à não-normalidade dos dados. Os resultados foram considerados significativos quando p<0,05.
RESULTADOS
Um total de 30 ratas foi incluído neste estudo e não foram observados óbitos ou perdas durante a realização do mesmo. Em três ovários foi observada a formação de abscessos, sendo um em rata do grupo II e dois em ratas do grupo I. Todas foram excluídas da análise. Não houve diferença entre o peso das ratas dos três grupos, variando de 200 a 350g (p = 0,432). A idade das mesmas variou de 12 a 18 semanas, com média de 14,6 semanas.
Foram observados folículos em todos os estágios do desenvolvimento, nos três grupos estudados, e o grupos apresentaram o mesmo comportamento quanto à ocorrência de folículos, com predominância dos folículos antrais sobre os folículos primários (p = 0,158). Devido à não-normalidade dos dados, foi feita análise da mediana e dos intervalos interquartis p25 e p75 para os folículos encontrados em casa fase do desenvolvimento. Nessas análises, não se observou diferença entre os grupos em relação aos achados de folículos em todas as fases do desenvolvimento (Figuras 1, 2, 3).
Figura 1. Comparação entre o número de folículos primários em ovários normais, transplantados e transplantados após congelamento/descongelamento (p = 0,62)
Figura 2. Comparação entre o número de folículos pré-antrais em ovários normais, transplantados e transplantados após congelamento/ descongelamento (p = 0,71).
Figura 3. Comparação entre o número de folículos antrais em ovários normais, transplantados e transplantados após congelamento/descongelamento (p = 0,68).
O número de folículos encontrados, a partir da somatória de todos os campos analisados, nas 8 ratas do grupo I foi de 25; nas 9 ratas do grupo II foi de 28 e nas 10 ratas do grupo III foi de 31. Não foi observado diferença entre os três grupos, (p=0,99) (Tabela 1). Quando avaliamos o número de folículos em desenvolvimento, observado em cada ovário, o número variou de dois a cinco. Encontrouse variação entre dois e cinco folículos no grupo I e entre dois e quatro nos grupos II e III, com medianas de 3,00 para os grupos I e II e de 3,50 para o grupo III (Figura 4).
Tabela 1. Número de folículos observado após indução da foliculogênese em ovários normais, transplantados e transplantados após congelamento/descongelamento
Figura 4. Comparação entre o número de folículos em desenvolvimento em ovários normais, transplantados e transplantados após congelamento/ descongelamento (p= 0,99).
DISCUSSÃO
A preservação do tecido ovariano para posterior utilização em ciclos de reprodução assistida representa importante alternativa na manutenção da capacidade reprodutiva em mulheres submetidas a tratamentos que têm como efeito adverso a castração. Muitas das pacientes com doenças malignas durante o período reprodutivo irão evoluir com a falência ovariana prematura, certamente aquelas submetidas à ooferectomia bilateral. Algumas abordagens visando à proteção ovariana tem sido propostas e variam conforme o tratamento utilizado (Prates & Geber, 2009).
No caso de ooferectomia bilateral, a alternativa de se criopreservar o tecido ovariano para posterior transplante, é uma opção que pode permitir o retorno da capacidade reprodutiva. Para isso, é fundamental que ocorra não apenas a sobrevivência do tecido ovariano criopreservado, mas que também ocorra o transplante com sucesso. A simplicidade do procedimento e sua viabilidade técnica foram demonstrados por Barros et al. (2008), em procedimento realizado com sucesso, sem reanastomose vascular, para a superfície peritonial.
A técnica de congelamento ovariano tem sido proposta há alguns anos. Gosden et al. (1994) descreveram gestações em ovelhas após congelamento de fragmentos de ovários e posterior transplante. Candy et al., (2000) demonstraram que os ovários congelados de macacas apresentavam retomada da foliculogênese depois de transplantados para camundongos imunodeficientes. Newton et al. (1996) comprovaram a viabilidade de se transplantarem fragmentos de ovários humanos congelados para camundongos imunodeficientes. Em 1997, Gunasena et al. obtiveram nascimentos de camundongos após transplante autólogo de ovários congelados. Prates et al., (2009) demonstraram a manutenção da capacidade endócrina dos folículos em tecido ovariano transplantado para o peritônio de ratas após congelamento/descongelamento. A idade e o peso das ratas foi o mesmo em todos os grupos, não interferindo nos resultados observados. A presença de três casos de abscessos, não interferiu nos resultados, uma vez que as ratas acometidas foram excluídas do estudo. Como não ocorreram nos caos do grupo sem transplante, podemos inferir que tenha ocorrido em conseqüência à manipulação pois, embora em números absolutos estes sejam poucos (um caso nos transplantes a fresco e dois após o congelamento/descongelamento), os abscessos estiveram presentes nos casos de mais manipulação. Uma segunda explicação poderia estar ligada à inviabilidade desses ovários (necrose tecidual), secundária à perda de aporte sanguíneo. Importante lembrar que o tempo decorrido entre a exérese ovariana e o congelamento, somado ao tempo entre o descongelamento e o transplante, não foi superior a três horas em nenhum dos casos. Cleary et al. (2001) relatam a falta de influência nos índices de necrose ovariana quando o período em que o tecido ovariano ficasse sem aporte sanguíneo fosse inferior a três horas
Nosso estudo teve como objetivo avaliar o desenvolvimento folicular, em ovários congelados/descongelados e transplantados para a superfície peritonial de ratas, após estímulo com FSH, e comparou, provavelmente pela primeira vez, o efeito com ovários transplantados e não congelados e ovários normais. A resposta ovariana ao estímulo com gonadotrofinas foi observada por Wang et al. (2002). Este estudo, foi realizado em camundongos, com o uso de hMG e apenas no grupo de estudo, sem se preocupar com o uso de grupo-controle, sem congelamento.
Este fato pode ter criado viés no resultado, pois foram comparados diferentes grupos, isto é, com e sem indução.
Em humanos, Oktay & Sonmezer (2004), descreveram uma paciente submetida a transplante ovariano após congelamento/descongelamento, e obtiveram 20 oócitos em oito meses de indução com gonadotrofinas, sendo oito inseminados, dois fertilizados e um transferido, sem gravidez. Schmidt et al. (2005) induziram a foliculogênese em uma paciente, após transplante de ovário congelado/ descongelado, e conseguiram dois embriões, que foram transferidos e não resultaram em gestação. Dolmans et al. (2009) descreveram 21 casos de punção folicular após indução com apenas 16 oócitos identificados sendo 10 em MII, cinco fertilizados com bom desenvolvimento embrionário, porém sem gravidez. Sanchez-Serrano et al., (2010) relataram gravidez apos transplante de ovário congelado/descongelado, seguido de indução da foliculogenese para fertilização in vitro.
Nossos resultados demonstraram que a resposta folicular ao estímulo com FSH em ovários de ratas congelados/descongelados e transplantados para o peritônio sem anastomose vascular é semelhante à obtida com os ovários in locus e aos transplantados para a superfície peritonial sem congelamento. Esses resultados permitem sugerir a possibilidade de se realizar o procedimento de forma semelhante em mulheres submetidas à ooforectomia, mantendo-se sua capacidade reprodutiva. Mais ainda, eles poderão encorajar o desenvolvimento dos protocolos de transplante autólogo de tecido cortical ovariano, após congelamento/descongelamento, com mais possibilidades de obtenção de gestação.
Em resumo podemos concluir que a criopreservação, descongelamento e transplante do tecido ovariano de ratas, sem reanastomose, vascular para o peritonio, não prejudicou o desenvolvimento folicular após a administração do hormônio folículo-estimulante.
Referências Bibliográficas
Agarwal A, Said TM. Implications of systemic malignancies on human fertility. Reprod Biomed Online. 2004; 6:673-9.
Cooper M. Ethics and Laboratory animals. Vet Rec. 1985; 116: 594-5.