Estudo comparativo de três métodos de vitrificação de embriões de camundongo baseado no seu desenvolvimento in-vitro.

Lucileine Keico Santos Nishikawa; Álvaro Pigatto Ceschin; Condesmar Oliveira Marcondes; Raul Nakano

JBRA Assist. Reprod. 2010;14(3):15-18
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2010.14.3.02

Estudo comparativo de três métodos de vitrificação de embriões de camundongo baseado no seu desenvolvimento in-vitro

Comparative study of three methods of cryopreservation of mouse embryos based on their in-vitro development

Lucileine Keico Santos Nishikawa¹, Álvaro Pigatto Ceschin¹, Condesmar Oliveira Marcondes², Raul Nakano³

¹Feliccità Instituto de Fertilidade - Curitiba-Pr
²Núcleo de Reprodução Humana - Santos-SP
³Ferticlin - São Paulo-SP

Received May 26, 2010
Accepted October 02, 2010

Local do trabalho: Feliccità Instituto de Fertilidade – Curitiba-PR

RESUMO
Objetivo: A criopreservação de embriões pode ser realizada através de congelamento lento ou rápido, dentre eles a vitrificação. O presente trabalho tem como objetivo comparar a evolução de embriões submetidos a três técnicas distintas de vitrificação.
Material e Métodos: Fêmeas de camundongo F1 (C57bl/6xBlab) foram submetidas a protocolo de indução da ovulação e colocadas com machos. Oitenta embriões foram obtidos por lavado de tuba uterina no estágio de oito células à mórula sendo divididos aleatoriamente em quatro grupos distintos, vinte embriões grupo Controle (A), vinte grupo Cryotip® (B), vinte grupo Cryotop® (C) e vinte grupo Vitri-Ingá® (D). O grupo A foi cultivado em incubadora à 5%CO₂ e temperatura de 37ºC por 48 horas. Os demais embriões foram vitrificados segundo as três técnicas e desvitrificados 24 horas após, sendo mantidos nas mesmas condições do grupo controle.
Resultados: No grupo A, 18 embriões (90%) evoluíram a blastocisto, no grupo B 15 embriões (75%), grupo C 14 embriões (70%) e grupo D 12 embriões (60%). O nível de significância foi calculado com base no teste não paramétrico, AxB (p=0,405), AxC (p=0,236), AxD (p=0,068),BxC (p=1,000), BxD (p=0,5) e CxD (p=0,740); e através do teste qui-quadrado, AxBxCxD (p=0,184).
Conclusão: Não houve diferença significativa entre o grupo controle e os demais grupos, nem entre grupos entre si, quanto ao desenvolvimento embrionário a blastocisto.

Palavras-chave: camundongo, embrião, vitrificação, criopreservação

ABSTRACT
Objective: Cryopreservation of embryos may be conducted by freezing slowly or quickly, among them the vitrification. This study aims to compare the development of embryos subjected to three different techniques of vitrification.
Material and methods: Female mice F1 (C57bl/6xBlab) were subjected to a protocol of ovulation induction and placed with males. Eighty embryos were obtained by lavage of the uterine tube in the stage of eight cells to morula were divided randomly into four groups, twenty embryos Control group (A), twenty Cryotip ® group (B), twenty Cryotop ® group (C) and twenty Vitri-Inga® group (D).The Group A was grown in an incubator with 5% CO2 and 37 º C for 48 hours. The remaining embryos were vitrified according to the three techniques and thawed after 24 hours, being kept under the same conditions of the control group.
Results: In group A, 18 embryos (90%) developed to blastocyst in group B, 15 embryos (75%), group C 14 embryos (70%) and group D 12 embryos (60%). The significance level was calculated based on the nonparametric test, AxB (p = 0.405), AXC (p = 0.236), AXD (p = 0.068), BXC (p = 1.000), BxD (p = 0.5) and CXD (p = 0.740) and the chi-square AxBxCxD (p = 0.184).
Conclusion: There was no significant difference between control group and the other groups, nor between groups among themselves as to the embryonal blastocyst.

Key Words: mouse, embryo, vitrification, cryopreservation

INTRODUÇÃO
A criopreservação é uma técnica baseada na conservação de células ou tecidos a temperaturas inferiores a 150ºC negativos permitindo a preservação de células por tempos prolongados. A criopreservação de embriões humanos vem sendo realizada desde a década de 80, as primeiras gestações obtidas por intermédio da técnica de congelamento-descongelamento de embriões e de oócitos ocorreram em 1983 (Trounson & Mor, 1983) e em 1986 (Chen, 1986; Al-Hasani et al., 1986) respectivamente.
Tanto oócitos como embriões podem sofrer danos morfológicos e funcionais significativos durante a criopreservação. Esses danos irão depender do tamanho e forma das células, da permeabilidade da membrana bem como da qualidade e sensibilidade do oócito ou embrião (Vatja & Kuwayama, 2006).
A criopreservação pode ser realizada através de congelamento lento ou rápido, dentre eles a vitrificação. O congelamento lento possui algumas desvantagens como a necessidade de equipamento programável de alto custo para resfriamento, do tempo prolongado para execução da técnica bem como dos riscos elevados da formação de cristais de gelo, tão danosos à célula (Almodin, 2008) A vitrificação é um método de criopreservação baseada no resfriamento de células em velocidade ultra-rápida, promovendo a solidificação por aumento da viscosidade (Fahy et al., 1984). Essa técnica surgiu como uma alternativa para evitar problemas relacionados com o congelamento lento. O processo utiliza altas concentrações de crio-protetores sem que ocorra a formação de cristais de gelo a baixas temperaturas (Rieger, 1998; Kuleshova et al., 1999). Muitos trabalhos realizados tiveram resultados importantes e promissores quanto à sobrevida e qualidade dos pré-embriões e gametas após o congelamento rápido e descongelamento (Katayama et al., 2003; Kuwayama et al., 2005a; Kuwayama et al., 2005b; Kuwayama, 2007).
Essa técnica vem sendo objeto de estudo em embriões e oócitos mamíferos e não demonstrou resultados inferiores se comparado ao congelamento lento (Kuwayama, 2007). Embriões de camundongos podem ser criopreservados eficientemente em vários estágios do desenvolvimento (Leibo et al., 1974; Rall & Fahy, 1985), sendo freqüentemente utilizado em pesquisas
Vatja e col. (1998) relataram a técnica de vitrificação com “Open Pulled Straw (OPS) - Palheta Esticada Aberta”, com bons resultados em embriões bovinos, em seguida Kuleshova e col. (1999), relataram uma gravidez usando o mesmo método.
Desde o seu desenvolvimento e aplicação, novas tecnologias e protocolos foram desenvolvidos com o intuito de aperfeiçoar a técnica e melhorar os resultados. As principais variáveis entre as metodologias que devem ser citadas incluem o tempo de exposição da amostra ao crioprotetor, o volume utilizado de cada solução bem como o aparato ou suporte físico utilizado em cada metodologia. Zang et al. (2009) relatou uma taxa de 91,2% de evolução à blastocisto de embriões oito células vitrificados/aquecidos pelo método Cryotop® . Após estudo comparativo entre os métodos Cryotip® e Cryotop® utilizando blastocistos humanos, Kuwayama (2005b) relatou não haver diferença significativa nos resultados obtidos. O Cryotip® tem apresentado taxas levemente inferiores de sobrevivência e desenvolvimento se comparado ao Cryotop®.
Recentemente foram realizados dois estudos de vitrificação com oócitos bovinos e humanos utilizando o método Vitri-Ingá® , resultando em 86% e 83% de taxa de sobrevivência, respectivamente, após análise morfológica (Almodin et al., 2008; Fachini et al., 2008).
O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo da evolução de embriões de camundongo submetidos a três técnicas distintas de vitrificação.

MATERIAIS E MÉTODOS
Fêmeas de camundongo F1(C57bl/6 x Balb ), mantidas a temperatura de 22+ 2°C e ciclo de luz 12/12h (claro /escuro) e com quatro semanas de idade, foram superovuladas com administração intraperitoneal de 10 IU eCG (Gonadotrofina Coriônica eqüina- Novormon®) e após 48h com 10 IU hCG (Gonatrofina Coriônica humana- Vetecor® ). Após a injeção de hCG, as fêmeas foram colocadas com machos durante a noite e na manhã do dia seguinte após observada a presença do tampão vaginal, indicativo de cópula, foram sacrificadas com CO₂/O₂. Os embriões foram lavados da tuba uterina e selecionados utilizando-se como critério de avaliação sua integridade morfológica, regularidade dos blastômeros e grau de fragmentação. Ointenta embriões no estágio de oito células à mórula foram selecionados e divididos aleatoriamente e igualmente em quatro grupos distintos, grupo Controle (A), grupo Cryotip® (B), grupo Cryotop® (C) e grupo Vitri-Ingá® (D). Os 20 embriões do grupo controle foram colocados em gotas de 50µl de IVF (Vitrolife AB, Suécia), sob óleo mineral e mantidos em incubadora com atmosfera contendo 5% de CO₂ a 37ºC e umidade máxima por 48 horas para posterior análise de desenvolvimento embrionário a blastocisto. Os demais grupos foram vitrificados e desvitrificados após 24 horas, segundo as três técnicas distintas.

Vitrificação

Grupo B : Cryotip® – Irvine Scientific.
Os embriões foram colocados em gota de 20µl de Solução de Equilíbrio -Equilibration Solution (ES) de 5 a 15 minutos. Essa solução é composta por Hepes de meio-199 e com sulfato de gentamicina (35Hµg/mL), 7,5% (v/v) de dimetilsufóxido (DMSO) e etilenoglicol cada e 20% (v/v) de Dextran Serum Suplement (suplemento substituto de soro). Após o equilíbrio os embriões foram transferidos, com o menor volume possível de ES, sucessivamente à 4 gotas de 20μl de Solução de Vitrificação - Vitrification Solution (VS), constituída por Hepes de meio-199 e com sulfato de gentamicina (35Hµg/mL), 15% (v/v) de DMSO e etilenoglicol cada, 20% (v/v) de Dextran Serum Suplement (suplemento substituto de soro) e 0,5M de sacarose, denominadas VS1, VS2, VS3 e VS4.Nesta etapa o tempo de exposição é crítico sendo de máximo 90 segundos em temperatura ambiente, até o preenchimento da palheta com aproximadamente 1µL da solução, selagem e imersão em nitrogênio líquido (LN₂). O preenchimento rápido e controlado da palheta é essencial, os embriões presentes na SV foram aspirados respeitando as marcas delimitadoras presentes na palheta, conforme protocolo. Para evitar danos à extremidade mais fina, cobriu-se com a proteção metálica.

Grupo C: Cryotop® – CryoTech Lab
O Cryotop® é uma haste de polipropileno composta por um filme bem fino aderido a um cabo plástico mais grosso. Os embriões foram colocados em placa contendo 2mL de ES, composto de 7,5% de etilenoglicol e dimetilsufóxido, diluídos em meio tamponado com 20% de soro sintético e permaneceram de 8 a 15 minutos. Após o equilíbrio foram transferidos, com o mínimo volume de ES, para placa contendo 2mL de VS, composta de 15% de etilenoglicol e dimetilsufóxido e 0,5M de sacarose diluídos em meio tamponado com 20% de soro sintético. Os embriões são transferidos através de movimentos repetidos em diferentes posições da placa. Em seguida são aspirados e colocado no Cryotop®, com o mínimo de meio possível, imerso imediatamente em LN_2. e protegido por um protetor de plástico. Até a imersão em LN₂ o tempo não ultrapassava 90 segundos, em temperatura ambiente, sempre respeitando o volume mínimo de VS ao adicionar o embrião na haste.

Grupo D: Vitri-Ingá® - Ingámed
O processo de vitrificação foi realizado com auxílio do Vitri-Equip (Ingámed, Perobal-Brasil), composto de uma caixa de foam contendo dois compartimentos de aço que são usados como suporte para as hastes (aparato). A haste Vitri-Ingá é um aparato de polipropileno de aproximadamente 0,7mm de espessura que está aderido a um cabo plástico mais grosso e na outra extremidade apresenta um pequeno orifício, onde a amostra pode ser colocada.Os embriões foram transferidos para 0,5mL de Solução de Equilíbrio (VI-1) que contém 7,5% de etilenoglicol e dimetilsufóxido, diluídos em meio tamponado com 20% de soro sintético, por 5 a 15 minutos. Após equilíbrio, foram sucessivamente transferidos para 3 gotas de 20μl de Solução de Vitrificação (VI-2), composta de 15% de etilenoglicol e dimetilsufóxido e sacarose a 0,5M diluídos em meio tamponado com 20% de soro sintético, permanecendo no máximo 15 segundos em cada gota. Em seguida os embriões eram colocados no orifício presente nas hastes, com um mínimo de meio possível, imersos rapidamente em LN₂ e protegidos com a cobertura de plástico. Os protetores plásticos foram primeiramente resfriados no equipamento Vitri-Equip (Ingamed) para em seguida serem verticalmente posicionados no equipamento contendo nitrogênio líquido para receberem as hastes. A etapa da vitrificação é crítica para o bom resultado do processo, respeitando o tempo máximo de 60 segundos, em temperatura ambiente, e o volume mínimo de meio ao depositar na haste.

Desvitirificação/Aquecimento
Após a realização das três técnicas de vitrificação os embriões foram em seguidas desvitirificados, seguindo o protocolo específico de cada técnica.

Grupo B : Cryotip® – Irvine Scientific.
As palhetas a serem descongeladas foram selecionadas no botijão de LN₂ e transferidas para um reservatório cheio de LN_2. As mesmas são retiradas do LN₂ e colocadas em banho-maria a 37ºC por três segundos. O excesso da água é retirado com auxílio de tecido estéril e a parte selada é cortada, onde o conteúdo é dispensado em placa. Essa pequena gota formada é unida à outra gota de aproximadamente 1µl de Solução de Descongelamento – Thawing Solution (TS), que serviu de lavagem para a palheta, composta de 1M de sacarose diluído em meio tamponado com 20% de soro sintético, permanecendo por 1minuto. Em seguida os embriões são transferidos a uma nova gota de 20µl de TS e mantido por mais 1minuto. Passado esse tempo, são transportados para duas gotas de 20µl de Solução de Diluição – Dilution Solution (DS1 e DS2), composta de 0,5M de sacarose dissolvida em meio tamponado com 20% de soro sintético, por 2 minutos em cada. Em seguida os embriões foram transferidos para 3 gotas de Solução de Lavagem – Washing Solution (WS) : WS1, WS2 e WS3, e mantidos por 3 minutos em cada gota, sendo composto de meio tamponado com 20% de soro sintético. Finalizado esse processo os embriões foram então transferidos para gotas de 50µl de IVF30 (Vitrolife AB, Suécia), sob óleo mineral e mantidos em incubadora à 5%CO₂ e temperatura de 37ºC por 48 horas.

Grupo C: Cryotop® – CryoTech Lab
As palhetas a serem descongeladas foram selecionadas no botijão de LN₂ e transferidas para um reservatório cheio de LN_2. A proteção de plástico é desconectada e o Cryotop® submerso imediatamente em 2mL de TS, à 37ºC, composta de 1M de sacarose diluído em meio tamponado com 20% de soro sintético, permanecendo por 1 minuto. Em seguida, transportado para 2mL de DS, por 3 minutos, composta de composta de 0,5M de sacarose dissolvida em meio tamponado com 20% de soro sintético. Finalmente é transferido para 2mL de WS - WS1 e WS2 por 5 minutos cada, sendo WS2 à 37ºC. Essa solução é composta apenas de meio tamponado acrescido de 20% de soro sintético. Após esse processo os embriões foram transferidos para gotas de 50µl de IVF30 (Vitrolife AB, Suécia), sob óleo mineral e mantidos em incubadora à 5%CO₂ e temperatura de 37ºC por 48 horas.

Grupo D: Vitri-Ingá® - Ingámed
As palhetas a serem descongeladas foram selecionadas no botijão de LN₂ e transferidas para um reservatório cheio de LN_2. A proteção de plástico é desconectada e a haste submersa imediatamente em 0,5mL de Solução de Desvitrificação (DV-I), composta de 1M de sacarose diluído em meio tamponado com 20% de soro sintético, permanecendo por 1 minuto, à 37ºC. Após esse breve período transferir imediatamente para 0,5mL de Solução Diluente (DV-II) por 3 minutos, composta de 0,5M de sacarose dissolvida em meio tamponado com 20% de soro sintético e lavar os embriões por duas vezes em 0,5mL de Solução de Lavagem (DV-III) por 5minutos cada. Essa solução final é composta apenas de meio tamponado acrescido de 20% de soro sintético. Após esse processo os embriões são transferidos para gotas de 50µl de IVF30 (Vitrolife AB, Suécia), sob óleo mineral e mantidos em incubadora à 5%CO₂ e temperatura de 37ºC por 48 horas.

Estatística
Os dados foram analisados através dos testes não-paramétricos “Comparação entre duas Proporções” (através do software “Primer of Biostatistics”), e através do teste “Qui-Quadrado” (pelo Epi-Info), onde o nível de significância (probabilidade de significância) adotado foi menor que 5% (p<0,05)

RESULTADOS
Foram utilizados neste trabalho oitenta embriões de camundongo no estágio de oito células à mórula, sendo vinte embriões grupo Controle (A), vinte grupo Cryotip® (B), vinte grupo Cryotop® (C) e vinte grupo Vitri-Ingá® (D). Após 48 horas de cultivo in vitro, os embriões desvitrificados e do grupo controle foram analisados e comparados quanto o seu desenvolvimento a blastocisto. No grupo A, 18 embriões (90%) evoluíram a blastocisto, no grupo B 15 embriões (75%), grupo C 14 embriões (70%) e grupo D 12 embriões (60%) (Gráfico 1).

Gráfico 1. Taxa de desenvolvimento de embriões de camudongo após técnicas distintas de vitrificação

Com base nestes valores e após análise descritiva dos dados foi possível comparar o resultado das técnicas e verificar que não houve diferença significativa entre os grupos de estudo: grupo AxB (p=0,405), grupo AxC (p = 0,236), grupo AxD (p = 0,068), grupo BxC (p=1,000), grupo BxD (p=0,500) e grupo CxD (p=0,740). Analisando os grupos em geral: AxBxCxD, foi possível obter o valor de p=0,184, confirmando não haver diferença significativa.

DISCUSSÃO
O primeiro relato e publicação a respeito de congelamento de embriões de camundongos foi realizado por Whittingham et al. (1972). A utilização desses embriões tem sido freqüente em estudo e análise de qualidade de material, meio de cultivo e toxicidade dos mesmos (Perin et al., 2008), bem como na manutenção de recursos genéticos de animais domésticos e selvagens.
As taxas de sobrevida de oócitos e embriões previamente vitrificados, bem como o desenvolvimento embrionário à blastocisto, variam de 83 a 91,2%.
Neste estudo as taxas variam de 60 a 75%, não havendo diferença significativa entre os diferentes métodos de vitrificação.
Cada técnica de vitrificação em estudo possui um protocolo específico, porém o bom resultado da técnica, indiferente da metodologia aplicada, depende da velocidade em que ocorre o congelamento e aquecimento da amostra, bem como o volume pequeno de solução em que a amostra deverá ser armazenada.
Os grupos estudados possuem aparatos distintos. O grupo B enquadra-se no grupo denominado de sistema fechado, o que permite uma proteção da amostra biológica em relação ao LN₂, já os grupos C e D fazem uso de um sistema aberto, sendo importante salientar não ter havido relato de nenhum caso de transmissão de doenças atribuída ao nitrogênio líquido em animais domésticos ou na biologia reprodutiva humana (Vatja & Kuwayama, 2006). Uma forma de evitar possíveis contaminações nos dois outros casos, denominados de sistema aberto, seria a de utilizar uma alíquota de nitrogênio líquido filtrado ou esterilizado pelo menos para realizar o resfriamento inicial após passar pela fase de vitrificação, já que em seguida será adicionada uma capa protetora antes do armazenamento em botijão contendo LN2.
Na avaliação da sobrevivência dos embriões de camundongos entre os grupos de estudo não foi observada diferença significativa. O grupo Vitri-Ingá® quando comparado com os demais grupos apresentou maior variação de resultado, embora não significante essa variação pode estar ligada a diferenças no aparato utilizado para depósito e armazenamento dos embriões, bem como à diferença no volume de solução utilizada durante o processo de vitrificação e aquecimento, visto que os componentes da formulação são semelhantes.
A vitrificação já passou por muitos avanços, porém ainda é possível observar que existem diferenças nos protocolos e nos aparatos utilizados em cada metodologia. Assim como ocorreu com o congelamento lento, a vitrificação está passando por um processo de avaliação onde os resultados estão cada vez mais promissores. É possível que num futuro próximo esses métodos aumentem sua eficácia, somando o que há de mais interessante de cada técnica, excluindo pontos negativos, podendo então se tornar um método padronizado.
Através da pesquisa realizada e com base nos resultados obtidos pode-se concluir que não houve diferença significativa entre o grupo controle e os demais grupos, nem entre grupos entre si, quanto ao desenvolvimento embrionário a blastocisto, após serem submetidos às três técnicas distintas de vitrificação. Os métodos de vitrificação estudados parecem ser boas opções de escolha já que apresentaram resultados satisfatórios.

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