JBRA Assist. Reprod. 2011;15(1):35-39
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2011.15.1.08
Bases para criopreservação de espermatozóides e os parâmetros seminais (OMS - 2010)
Basis for cryopreservation of spermatozoa and semen parameters (WHO - 2010)
1Professor Adjunto (Doutor) do ICBS/PUC Minas. Diretor Secretário da SBRA
2Acadêmico de Medicina da Faculdade FASEH/MG
3Professor Titular do ICBS/PUC Minas
RESUMO
O artigo oferece uma atualização do presente estágio da tecnologia, praticabilidade e limites da criopreservação de espermatozóides humanos. Desta forma, a criopreservação de sêmen representa uma prevenção, uma opção concomitante aos pacientes oncológicos que necessitam de uma oportunidade de manter suas habilidades reprodutivas.
Palavras-chave: espermatozóides, banco de sêmen, criopreservação, infertilidade masculina.
ABSTRACT
The article provides an update of the present stage of technology, practicality and limitations of cryopreservation of human sperm. Therefore, semen cryopreservation is a prevention, a concurrent option to cancer patients who need an opportunity to maintain their reproductive abilities.
Keywords: sperm, sperm bank, cryopreservation, male infertility.
INTRODUÇÃO
O reconhecimento, através de técnicas de reprodução assistida, da importância da manutenção em baixas temperaturas de espermatozóides e de células da linhagem espermatogênica, significou uma revolução nas etapas de criopreservação de sêmen e obtenção de uma gravidez a termo. Assim, a criopreservação de sêmen humano para utilização em reprodução assistida é atualmente procedimento mundialmente reconhecido. A qualidade inicial da amostra, o número de espermatozóides móveis após o descongelamento e os parâmetros da motilidade espermática, avaliados através de análise pormenorizada, são preditivos do potencial fértil do sêmen congelado (Allan et al., 2009; Zegers-Hochschild et al., 2009).
A redução do potencial fértil dos espermatozóides após o descongelamento é um dos principais fatores limitantes do sucesso da inseminação intra-uterina e da fertilização in vitro convencional envolvendo sêmen criopreservado. Mesmo utilizando-se técnicas avançadas de criopreservação, 25 a 75% dos espermatozóides morrem ou são lesados irreversivelmente durante esse processo (Centola, 1992). É aceitável assumir que uma taxa de gravidez cumulativa usando-se espermatozóides descongelados é comparada àquela obtida com sêmen fresco. Todavia, as taxas de fecundidade por ciclo para sêmen fresco e descongelado podem se apresentar significativamente diferentes. Assim, a inseminação artificial com espermatozóides descongelados tem uma taxa de gravidez reduzida que varia de 5 a 20% por ciclo. A criopreservação de sêmen é um ramo da criobiologia que estuda a manutenção de espermatozóides em baixas temperaturas, preservando sua capacidade de fertilizar óvulos e adequado desenvolvimento embrionário inicial (Allan et al., 2009).
As primeiras abordagens práticas de congelamento de sêmen remontam ao século XVIII, através de Spallanzani em 1776 (Nieschlang & Behre, 1997), com observações sobre a sobrevivência de espermatozóides a baixas temperaturas. Mantegazza em 1866 sugeriu que os espermatozóides deveriam ser congelados para utilização futura (bancos de sêmen). Shettles em 1940 indicou a existência de variações individuais perceptíveis após o descongelamento (Holt,2000).
O sucesso na criopreservação de espermatozóides de mamíferos começou a ter grande repercussão após as observações de Polge et al em 1949 mostrando que o glicerol tem interessantes e peculiares propriedades como meio crioprotetor. A técnica do vapor de nitrogênio líquido introduzida por Sherman no início dos anos 60 ainda continua a ser muito empregada. Com o passar dos anos, o congelamento com velocidade lenta e controlada tornou-se o método de escolha para a criopreservação do sêmen e permitiu a utilização de taxas de resfriamento reprodutíveis levando à efetiva e uniforme desidratação celular, evitantando a formação de cristais intracelulares. Sherman, em 1964, identificou padrões de toxicidade para o dimetilsulfóxido (DMSO) na quando na condição de crioprotetor. Ackerman, em 1968, mostrou as repercussões do choque térmico no congelamento e descongelamento (Verheyen et al, 1993; Gilmore, et al, 2000).
Na década de 70, Bankay relatou o nascimento de bebês através de técnicas de reprodução artificial utilizando sêmen diluído e criopreservado em pequenos péletes. Os anos 80 foram marcados pelo aumento da eficácia das técnicas de congelamento. Oates, em 1996, obteve sucesso na criopreservação de espermatozóides recolhidos do epidídimo. Fischer e colaboradores, no mesmo ano, relataram a viabilidade do congelamento de gametas extraídos do testículo (Fischer et al, 1996).
REGULAMENTO TÉCNICO PARA O FUNCIONAMENTO DOS BANCOS DE CÉLULAS E TECIDOS GERMINATIVOS (RDC/ANVISA nº 33, 17/02/2006).
Buscando padronização para o acondicionamento de espermatozóides, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) introduziu procedimentos relativos a bancos de células e tecidos germinativos (BCTG) no país. A ponderação inicial estabelece a necessidade de o BCTG estar vinculado administrativa e tecnicamente a um serviço assistencial de saúde. Sendo condicionante para funcionamento a licença emitida pelo Órgão de Vigilância Sanitária competente. Essa licença é válida pelo período de 01 (hum) ano, a contar da data de sua emissão, podendo ser cassada, a qualquer momento, em caso de descumprimento do regulamento técnico estabelecido por esta Resolução,
Aos bancos de células e tecidos germinativos (BCTG), são atribuídas as seguintes competências:
a) obter termo circunstanciado para congelamento de espermatozóides, conforme modelo padronizado pelo BCTG, de acordo com a legislação vigente;Quando o BCTG estiver instalado em um estabelecimento assistencial de saúde, ele poderá compartilhar os ambientes técnicos e de apoio (recepção de doadores, centro cirúrgico ambulatorial, laboratório clínico, farmácia, central de material esterilizado, depósito central de armazenamento de nitrogênio líquido (ABNT/NBR 12.188), depósito de material de limpeza, depósito de materiais, sanitários, copa, sala de equipamentos, posto de enfermagem e serviços, sala de utilidades, quarto individual ou coletivo de curta duração, área para recepção de pacientes, sala de espera de acompanhantes, vestiário para funcionários, lavanderia e centrais de energia elétrica, climatização, água, esgoto, gases, telefonia e lógica).
b) orientar, viabilizar e proceder à coleta, quando necessário;
c) avaliar e processar as células espermáticas recebidas ou coletadas;
d) responsabilizar-se pela realização dos exames laboratoriais necessários à identificação de possíveis contraindicações e condições especiais necessárias ao seu emprego;
e) garantir a qualidade do processo de conservação dos espermatozóides;
f) liberar o material preservado, para a sua utilização conforme a legislação vigente;
Caso o armazenamento das células ou tecidos seja efetuado em tanques de nitrogênio líquido, ou haja um sistema de segurança com nitrogênio líquido para congelador com temperatura igual ou inferior a 135°C negativos, a área de armazenamento deve possuir:
a) visualização externa do seu interior;Determinante também na RDC n.33 é a caracterização da sala de processamento de sêmen que deve tornar-se o único espaço onde se pode receber material potencialmente contaminado. Requer que: “a sala destinada ao processamento de sêmen, com acesso restrito pelo vestiário de barreira; sistema de climatização que mantenha pressão positiva em relação aos ambientes adjacentes; condições de temperatura 21 C a 24 C; unidade relativa do ar entre 40% e 60%; vazão mínima de ar total de 45 (m3/h)/m2; vazão mínima de ar exterior de 15(m3/h)/ m2 e filtragem mínima no insuflamento com filtros G3+carvão ativado+F8”.
b) sistema de climatização que mantenha a pressão negativa em relação aos ambientes adjacentes e sistema exclusivo de exaustão mecânica externa para diluição dos traços residuais de nitrogênio que mantenha uma vazão mínima de ar total de 75(m3/h)/m2. Este sistema deve prover a exaustão forçada de todo o ar da sala, com descarga para o exterior. As grelhas de exaustão devem ser instaladas próximas ao piso. O ar de reposição deve ser proveniente dos ambientes vizinhos ou suprido por insuflação de ar exterior, com filtragem mínima com filtro classe G1; 24ºC; umidade relativa do ar entre 40% e 60%; vazão mínima de ar total de 45(m3/h)/m2; vazão mínima de ar exterior de 15(m3/h)/ m2 e filtragem mínima no insuflamento com filtros G3+carvão ativado+F8.
Fica evidente a preocupação do órgão fiscalizador quanto ao rigor do local apropriado para manipulação das frações seminais obtidas. Assim estabelece que a manipulação das amostras somente deve ser efetuada em uma área limpa classificada, no mínimo, como ISO Classe 5, segundo a norma NBR/ISSO 14644-1 da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Para a obtenção dessas condições, o BCTG deve utilizar uma das opções abaixo:
a) cabine de segurança biológica Classe II Tipo A;
b) módulo de fluxo unidirecional;
c) sala classificada, como ISO classe 5 no mínimo, segundo as orientações da NBR/ISO 14644-4 da ABNT. Neste caso o BCTG deve obrigatoriamente possuir uma antecâmara de acesso à sala de processamento, além do vestiário de paramentação.
ANÁLISE E PREPARAÇÃO DE SÊMEN PARA CRIOPRESERVAÇÃO ( Taitson & Romano, 2007; WHO, 2010) Coleta de sêmen
As amostras de sêmen devem ser coletadas após um período de três a cinco dias de abstinência sexual. Os frascos de coleta de boca larga com capacidade de volume mínimo de 10 mL são os mais utilizados. A transparência do mesmo possibilita avaliar as condições do sêmen durante a etapa de liquefação. A automanipulação (masturbação) é o método de escolha. As práticas de coito interrompido e coletas em preservativos podem, muitas vezes, estabelecer contato entre o líquido seminal e substâncias nocivas ao mesmo. O sêmen coletado deve ser enviado ao laboratório para criopreservação em tempo não superior a 1 hora.
Análise a fresco
Nesta etapa , obtém-se o espermograma com valorização da concentração espermática, motilidade e atividade, isto é, a relação entre espermatozóides vivos e mortos. Dez µL de sêmen depositados num campo microscópico, com aumento de 400x, possibilita obter-se visão geral do sêmen a ser criopreservado. A insuficiência de volume não significa, em muitos casos, problema importante sob o aspecto da infertilidade, principalmente quando há boa vitalidade dos espermatozóides. Em geral, o volume de sêmen possui relação direta com a freqüência de coitos. Assim, pode-se estimar a atividade e a motilidade dos espermatozóides obtidos (WHO, 2010).A motilidade dos espermatozóides é um fator necessário para a fertilidade, porém não é suficiente para indicar capacidade de fertilização. A atividade fisiológica dos espermatozóides está ligada à manutenção de nível mínimo, porém suficiente, de ATP para suprir as necessidades de sua motilidade por determinado período de tempo. Um espermatozóide normal pode perder sua habilidade de fertilização muito antes de perder sua motilidade (Henry et al, 1993).A determinação do número de espermatozóides num ejaculado é uma dos principais variáveis utilizadas na avaliação de sua capacidade de fertilização, sendo fator determinante na eficácia do processo reprodutivo. Por isto, a estimativa do número de espermatozóides/mL de sêmen é um passo importante do processo de criopreservação seminal.Embora existam divergências sobre o melhor método de determinação da concentração de células espermáticas, a câmara de Makler ainda desponta com destaque para utilização. Ela permite, além, da contagem dos espermatozóides, a avaliação de sua motilidade, o que não ocorre no hemocitômetro (Mortimer et al, 1996; WHO, 2010).
Tabela 1. Valores do espermograma humano, segundo a Organização Mundial da Saúde em 2010. Limites inferiores de referência (percentil 5 e seus intervalos de confiança 95%).
Identificação das amostras
Deve ser atribuída, a cada amostra coletada, uma identificação numérica ou alfanumérica. Esta identificação deve acompanhar toda a documentação e o material durante os testes, processamento, criopreservação, armazenamento, descongelamento e liberação, devendo, também, ser atribuída às alíquotas, permitindo a identificação de cada uma delas. A identificação deve ser feita com etiquetas resistentes a baixas temperaturas e impermeáveis.
Adição de crioprotetores
A escolha do meio de criopreservação para o sêmen deve ser dirigida para a melhoria da capacidade de manter a integração e função celulares durante o processo de congelamento e descongelamento. Sabe-se que a capacidade de fertilização do sêmen fresco é, em muitos casos, maior do que a do congelado. Tal condição pode ocorrer devido ao uso de meio de criopreservação inadequado o qual provoca causa danos celulares atribuíveis ao crioprotetor utilizado (Verheyen, 1993, Taitson & Souza, 2008). De uma maneira geral, podemos agrupar os crioprotetores em dois grandes grupos, os permeáveis (que apresentam proteção intracelular) e os impermeáveis (que propiciam proteção externa à célula). O primeiro grupo é composto pelo glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propanediol e etilenoglicol, entre os mais conhecidos. Os crioprotetores impermeáveis de maior utilização são a gema de ovo de galinha, leite em pó, açúcares, água de côco e glicose (Gilmore, et al, 2000).O crioprotetor permeável deve proporcionar:
a) diminuição da taxa de difusão da água da célula,Os meios de criopreservação convencionais de sêmen humano são baseados em:
b) diminuição da temperatura de nucleação homogênea,
c) diminuição da taxa de crescimento de cristais de gelo e,
d) diminuição do ponto de congelamento.
a) glicerol, como principal crioprotetor permeável, na concentração final entre 5 e 10 %;Usualmente, os protocolos de criopreservação incluem adição de glicerol e Tes-Tris e gema de ovo tamponados, na razão de 1:1 com o sêmen (RED LARA, 2006; Al-Hasani & Zohni, 2008).É importante a utilização de meios crioprotetores que, em função sua alta osmolaridade, penetrem na membrana espermática durante o congelamento e saiam dessa membrana durante o descongelamento, causando baixo dano celular. Tal como já mencionado, a eficácia dos agentes crioprotetores pode ser medida comparando-se os parâmetros précongelamento com os obtidos no pósdescongelamento, como a motilidade. Entretanto, estas avaliações não levam em consideração os danos adquiridos pela membrana celular durante o processo de criopreservação e nem a inativação da reação acrossomal. O processo também leva à perda ou inativação da acrosina, uma importante enzima para a fertilização. Além disso, o espermatozóide pode perder sua habilidade de atingir capacitação máxima ou sofrer reação acrossomal ou mesmo perder alguns mecanismos complexos de ativação do ovócito durante o processo de fertilização (Watson et al., 1992., Devireddy et al.,2000).
b) adição soluções-tampão, tais como citrato, Tes-Tris ou Hepes;
c) adição de macromoléculas não permeáveis, tais como gema de ovo ou albumina.
RESFRIAMENTO
A passagem do sêmen, adicionado de crioprotetores, de ~37 °C para a temperatura de congelamento (-196°C) deve ser lenta e programada. Congelamento (5-50 oC/ min) e descongelamento (4 °C a 37°C/ min) lentos podem ser parcialmente responsáveis pelo aumento na população de espermatozóides capacitados, com acrossoma ativo e funcionalmente viáveis (Bielanski & Vajta, 2009; WHO, 2010).
CONGELAMENTO
A criopreservação deve ocorrer o mais precocemente possível, podendo ser feita em equipamento programável de congelamento ou em sistema manual. A criopreservação deve ser obtida submetendo a amostra ao congelamento sob variação controlada da temperatura, em processo de congelamento validado, devendo ser registrados os dados pertinentes a curva de redução de temperatura, quando utilizada a técnica de congelamento lento e a origem, o lote e a concentração dos meios e reagentes utilizados. O BCTG deve manter registros da avaliação da viabilidade de cada amostra descongelada para uso.
Os seguintes fatores são importantes para a aplicação de taxa de congelamento adequada:
• viscosidade da solução intracelular,
• área da superfície celular,
• taxa de difusão da água através da membrana celular,
• distância entre a célula e o primeiro cristal de gelo a se formar,
• viscosidade da solução extracelular e,
• permeabilidade do crioprotetor utilizado.
Crio-injúria
Os meios de criopreservação são, em geral, estocados em baixa temperatura (-10 oC). A adição destes meios ao sêmen a ser criopreservado deve ser feita em temperatura de 37 oC. A inobservância deste procedimento é uma das causas principais de crio-injúria.Causas individuais de crio-injúria:
a) choque frio (temperatura crítica: entre 0 e -40°C),
b) pH,
c) gelo intracelular,
d) gelo extracelular,
e) toxicidade do crioprotetor,
e) efeito soluto e,
f) efeito volume.
TEMPO DE ESTOCAGEM
Não existe grande volume de informação científica o tempo de armazenamento do sêmen congelado. Sabese hoje, que parâmetros seminais humanos, como motilidade e atividade, tendem a decrescer com o tempo. Quando a estocagem é mantida de forma criteriosa, o sêmen pode ser utilizado em diferentes de técnicas de reprodução assistida, tais como fertilização in vitro (FIV) e a injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Em março de 2004, foi o nascimento de um bebê utilizandose semen congelado por 21 anos e FIV. Em 2005, foi relatado o nascimento de criança através de inseminação intrauterina combinada com sêmen congelado por 28 anos. (Horne et al., 2004; Feldschuh et al., 2005).
Estudo publicado em 2005 avaliou 238 amostras seminais de 34 indivíduos (18 tinham câncer) no período de 1976 a 1989. Existiam amostras com 21 anos de congelamento. Todas as amostras apresentaram redução considerável da motilidade seminal pós descongelamento em relação ao sêmen fresco (Bolten et al., 2005).
Clarke e colaboradores em 2006, estudando seis amostras congeladas após 28 anos destacaram a motilidade e a habilidade seminal para interação com a zona pelúcida. A reação acrossômica normal foi estabelecida em 4 amostras. Outro estudo mostrou que somente 27% dos homens que congelam sêmen pré tratamento de câncer utilizam as amostras em um tempo inferior a dez anos (Blackhall et al., 2002; Taitson et al., 2009).
DESCONGELAMENTO
Os espermatozóides são células sensíveis a alteração brusca de temperatura. O descongelamento lento e progressivo de sêmen criopreservado em glicerol reduz as chances de formação excessiva de cristais de gelo intracelular. Fortes indícios revelam tendência do uso, no futuro, da técnica de vitrificação, baseada em congelamento e descongelamentos ultra-rápidos, durante os quais não há tempo suficiente para a formação de cristais (Trummer et al.,1998).
ANÁLISE PÓS-DESCONGELAMENTO
A redução da atividade espermática pós-descongelamento pode variar de 25-50%. Importância maior é dada às alterações de motilidade, morfologia e percentagem de espermatozóides vivos. Uma análise pós-descongelamento criteriosa possibilita melhores êxitos na utilização de espermatozóides congelados em técnicas de reprodução assistida.
INDICAÇÕES (Costabile, 1993; Sanger et al., 1992). A criopreservação de espermatozóides humanos é indicada nas seguintes situações:
• anterior à quimioterapia e /ou radioterapia; o congelamento seminal deve anteceder aos tratamentos quimioterápicos e/ou radioterápicos, os quais geralmente ocasionam aplasia germinativa; aproximadamente 30.000 a 40.000 jovens americanos entre 18 e 35 anos são anualmente diagnosticados com câncer; Câncer de testículo, doença de Hodgkin e leucemia são os tipos de neoplasias mais encontradas.
• assincronia da atividade reprodutiva e ciclos induzidos; mulheres com ciclos assincrônicos são cada mais comuns em protocolos de ICSI. anterior à cirurgias pélvicas que possam comprometer a fertilidade futura, como microcirurgias reconstrutivas no trato genital masculino (vaso-vaso e vaso-epidídimo anastomoses),
• anterior à vasectomia; indivíduos que necessitam realizar vasectomia podem criopreservar os espermatozóides antes da realização desta cirurgia.
CONCLUSÃO
Passados 60 anos, a habilidade de se congelar espermatozóides tem causado profundo impacto na ciência reprodutiva. A melhoria da qualidade dos crioprotetores, a forma de acondicionamento do sêmen e o maquinário utilizado, propiciam melhora significativa na viabilidade dos espermatozóides após o descongelamento. Novos modelos de biologia molecular, bioquímica analítica, fisico-quimica e biologia reprodutiva, são preditivos ao avanço da reprodução humana masculina.
SUMMARY
This paper provides a review of the present state of technology, practicability, and limits of cryopreservation of human spermatozoa. Thus cryopreservation of semen represents a preventive, concomitant therapeutic option in oncological patients that offers the chance to maintain reproductive abilities.
Key-words: spermatozoa, sperm banking, cryopreservation, male infertility.
Referências Bibliográficas:
Al-Hasani S, Zohni K. Futures aspects in human cryopreservation. J Famil Reproduct Health 2008; 2: 1-11.
Allan A, et al. Sperm banking: Theory and practice. Cambridge: CUP; 2009.