JBRA Assist. Reprod. 2011;15(3):10-14
ARTIGO ORIGINAL
10.5935/1518-0557.2011.15.3.02
Evaluación de vacuolas nucleares y apoptosis espermatica luego del uso de columnas de anexina V en pacientes con terarozoospermia severa
Nuclear vacuoles and apoptosis markers after annexin V columns in patients with severe teratozoospermia.
Avaliação de vacúolos nucleares e apoptose espermática depois do uso de colunas de anexina V em pacientes com teratozoospermia severa
1Laboratorio de Biología, Investigación y Estudios Especiales (LABINEE)
2Coordinador del Laboratorio de Embriología
3Miembro del Staff del Laboratorio de Embriología
4Director Médico
5Directora del Laboratorio de Embriología
6Director Científico
*Centro de Estudios en Ginecología y Reproducción (CEGyR) Buenos Aires, Argentina
Lugar de Realización:
Centro de Estudios en Ginecología y Reproducción (CEGyR)
Viamonte 1438, C1055ABB, Buenos Aires-Argentina
Teléfono: +54 11-4372-8289
Fax: +54 11-4371-7275
RESUMEN
Objetivo: La técnica de Columnas de Anexina V ha sido propuesta como herramienta para disminuir los niveles de apoptosis espermática. El objetivo de este trabajo es evaluar la presencia de vacuolas nucleares y marcadores de apoptosis en las diferentes fracciones luego del uso de columnas y valorar si existe relación entre la tamañonumero de vacuolas con la presencia de apoptosis espermática.
Métodos: Estudio prospectivo de cohorte - doble ciego. Se analizaron 10 muestras de semen que tenían estudio de TUNEL previo (>20%). Se realizó el pasaje de los espermatozoides a través de las Columnas de Anexina V. Se estudiaron 3 poblaciones: luego del gradiente, fracción eluida y la fracción adherida a la columna; se evaluó en cada una de las fracciones el número y tamaño de vacuolas, externalización de fosfatidilserina, caspasa-3 activa y TUNEL.
Resultados: En los 3 marcadores de apoptosis espermática evaluados, se observó una disminución significativa en la población eluida luego del uso de columnas (p< 0,05). Sin embargo, tanto el porcentaje de vacuolas, así como el número-tamaño, no mostraron diferencias entre las fracciones estudiadas. En la población adherida a la columna (altos niveles de apoptosis) no se encontró un predominio de espermatozoides con vacuolas, y que estas a su vez, presenten un mayor tamaño.
Conclusión: Los niveles de apoptosis espermática disminuyen significativamente luego del uso de Columnas de Anexina V, pero no así, el porcentaje de espermatozoides vacuolados. Según nuestros resultados, no existe correlación entre el mayor número y tamaño de vacuolas con altos niveles de apoptosis espermática.
Palabras claves: Teratozoospermia severa, vacuolas nucleares, apoptosis, Columnas de Anexina V.
ABSTRACT
Objective: Annexin V columns has been proposed as a tool to reduce levels of sperm apoptosis. The aim of this study was to determine the presence of nuclear vacuoles and apoptotic markers after using Annexin V columns and evaluate the size and number of nuclear vacuoles with sperm apoptosis.
Methods: Double-blind prospective cohort study Ten semen samples, with a previously TUNEL assay (>20%), were analyzed. After two layers gradient, the pellet was eluted through Annexin V column. Three sperm populations were studied: after gradient, eluted fraction and the fraction retained in the column; evaluating the number and size of vacuoles, phosphatidylserine externalization, cleaved caspase-3 and TUNEL.
Results: A significant decrease of apoptotic sperm markers levels was observed after using Annexin V columns (eluted fraction) (p<0.05). However, the number and size of nuclear vacuoles do not showed a significant difference between fractions. The fraction with high levels of sperm apoptosis (fraction retained in the column) do not showed a prevalence of vacuolated spermatozoa and larger size of vacuoles.
Conclusions: The sperm apoptosis levels significantly decreased after using Annexin V Columns, but not in the same way in relation to the number of vacuolated spermatozoa. There is not a correlation between a major number and size of vacuoles with high levels of sperm apoptosis.
Key words: Severe teratozoospermia, nuclear vacuoles, apoptosis, Annexin V columns.
RESUMO
Objetivo: A técnica de Colunas de Anexina V foi proposta como ferramenta para diminuir os níveis de apoptose espermática. O objetivo deste trabalho é avaliar a presença de vacúolos nucleares e marcadores de apoptose nas diferentes frações depois do uso de colunas e determinar se existe relação entre o tamanho-número de vacúolos e a presença de apoptose espermática.
Materiais/Métodos: Estudo de coorte prospectivo duplo-cego. Foram analisadas 10 amostras de sêmen que tinham teste de TÚNEL prévio (>20%). Foi realizada a passagem dos espermatozoides através das Colunas de Anexina V. Foram estudadas 3 populações: gradiente, eluída e a aderida à coluna, avaliando em cada uma delas número e tamanho de vacúolos, externalização de fosfatidilserina, caspase-3 ativa e TÚNEL.
Resultados/Discussão: Nos 3 marcadores de apoptose espermática avaliados, foi observada uma diminuição significativa na população eluída depois do uso de colunas (p< 0,05). Contudo, tanto o percentual de vacúolos, quanto o número-tamanho, não evidenciaram diferenças entre as frações estudadas. Na população aderida à coluna (altos níveis de apoptose) não se encontrou um predomínio de espermatozoides com vacúolos de maior tamanho como é referido na literatura.
Conclusão: Os níveis de apoptose espermática diminuem significativamente depois do uso de Colunas de Anexina V, mas não o percentual de espermatozoides vacuolados. Conforme os nossos resultados, não existe correlação entre o maior número e tamanho de vacúolos e altos níveis de apoptose espermática.
Palavras-chave: Teratozoospermia severa, vacúolos nucleares, apoptose, Colunas de Anexina V.
INTRODUCCIÓN
El análisis de la fragmentación del ADN aportó nuevas expectativas en la búsqueda de explicación a las fallas repetidas de FIV-ICSI. Se ha descrito la importancia de la estabilidad del núcleo espermático relacionado al éxito reproductivo en humanos. Así, el incremento significativo de los niveles de fragmentación del ADN estaría asociado a bajas tasas de fertilización, implantación embrionaria e incremento de abortos (Carrell et al., 2003; Seli et al., 2004; Virro et al., 2004; Lewis & Aitken, 2005; Meseguer et al., 2008; Aitken & De Iuliis, 2009; Sakkas & Alvarez, 2010).
Tantos factores físicos como metabólicos pueden inducir el daño del ADN espermático. Este puede ocurrir en la espermatogénesis o durante el tránsito por el epidídimo (Aitken et al., 2005, Aitken et al., 2006; Aitken RJ & De Iuliis, 2007; Banks et al., 2005). Asimismo, se han identificado factores de riesgo asociados al incremento de la fragmentación del ADN, como: varicocele, criptorquidia, edad avanzada, teratozoospermia severa, episodios de fiebre alta, radio y quimio terapia (Evenson et al., 2000; Angelopoulou et al., 2007; Delbes et al., 2007; Smith et al., 2007; Smit et al., 2010; Vagnini et al., 2007; Wu et al., 2009; Moskovtsev et al., 2009; Mehdi et al., 2009). El daño en el ADN puede ser de simple y/o de doble cadena, y ha podido ser evaluado por diversos métodos (Evenson et al., 1980; Gorczyca et al., 1993; Fernández et al., 2005; Chohan et al., 2006), destacando entre ellos la técnica de TUNEL (“deoxynucleotidyl-transferase-mediated-dUTP-nick-end-labeling”) (Sakkas & Alvarez, 2010; Sergerie et al., 2005; Greco et al., 2005; Boe-Hansen et al., 2006; Avendaño et al., 2009; Góngora & Fontanilla, 2010). Se ha reportado que la fragmentación del ADN puede estar asociada a eventos de apoptosis espermática (Wu et al., 2009; Sakkas et al., 2002; Sakkas et al., 2003; Oehninger et al., 2003; Singh et al., 2003; Moustafa et al., 2004). Al respecto, se han detectado marcadores de apoptosis en espermatozoides humanos, como: externalización de fosfatidilserina, caspasa 3 activa, etc. (Almeida et al., 2009; Glander & Schaller, 1999; Kotwicka et al., 2008; Paasch et al., 2003; Paasch et al., 2004; Shen et al., 2002). Por otro lado, otros autores han reportado la correlación positiva entre la fragmentación del ADN y la presencia de vacuolas nucleares que ocupan más del 50% de la superficie nuclear (Franco Jr et al., 2008; Nadalini et al., 2009; Oliveira et al., 2010). Sin embargo, otros reportes manifiestan que la presencia de vacuolas podría estar asociada al estado y/o anormalidades del acrosoma y no necesariamente a la fragmentación del ADN (Perdrix et al., 2011; Kacem et al., 2010).
La técnica de Columnas de Anexina V (CA-V) ha emergido como un método capaz de reducir los niveles de apoptosis espermática. Esta técnica se basa en la afinidad entre Anexina V y fosfatidilserina (marcador de apoptosis temprana). Existen publicaciones que demuestran la utilidad de este método en la reducción de la apoptosis espermática e incluso respecto a su uso en reproducción asistida (Said et al., 2005; Said et al., 2006; Dirican et al., 2008; Makker et al., 2008; Rawe et al., 2010; De Vantéry Arrighi et al., 2009; Polak de Fried & Denaday, 2010; Lee et al., 2010).
El presente trabajo tiene como objetivo evaluar los niveles de vacuolas nucleares y marcadores de apoptosis en las diferentes fracciones obtenidas durante el uso de CA-V y conocer si existe relación entre la tamaño-numero de vacuolas con la presencia de apoptosis espermática en pacientes con teratozoospermia severa.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Diseño experimental
Prospectivo de cohorte - doble ciego
2. Población de estudio
Fue considerado un grupo de 10 pacientes varones (Kruger ≤4%) cuyo nivel de fragmentación del ADN (TUNEL) fue mayor al 20%, teniendo una concentración mayor a 10x106/mL y movilidad progresiva mayor al 30% en el diagnóstico previo (no mayor a tres meses) al día del ensayo.
3. Preparación de la muestra
Las muestras fueron evaluadas y sometidas a separación espermática por gradiente de dos capas (ISOLATE-Irvine Scientific) según los criterios de la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1992). El pellet obtenido fue lavado con buffer de pegado (BP) (“Binding buffer”-Miltenyi Biotec) (FRACCION INICIAL-FI)
4.- Columnas de Anexina V
Protocolo adaptado a partir del “Death Cell Removal Kit” (Miltenyi Biotec). Brevemente, el ´pellet´ luego del gradiente fue resuspendido en las ´microbeads´ y se incubó por 25 minutos. Se introdujo la columna dentro del imán y se hidrató con 500 uL de BP. Seguidamente se adicionó la suspensión de espermatozoides y simultáneamente 500 µl del BP. El eluido se colectó en HTF modificado (Irvine Scientific) (FRACCIÓN NEGATIVA-FN). La FRACCIÓN POSITIVA-FP fue colectada retirando la columna del imán y con ayuda del embolo se eluyó bajo presión con BP. De cada fracción se procedió a tomar una alícuota ajustada a un máximo de 2 x106/mL para realizar el estudio de MSOME y la evaluación de marcadores de apoptosis.
5.- Evaluación de vacuolas nucleares-MSOME
La evaluación de los espermatozoides se realizó utilizando el microscopio invertido (Nikon (Eclipse TE 200-U) con contraste de fase diferencial (DIC) y un objetivo de 100X de inmersión. Por otro lado se utilizó un sistema secundario de magnificación que posibilitó evaluar los espermatozoides con una magnificación final de hasta 12600X. En las distintas fracciones luego de CA-V se evaluaron 200 espermatozoides, considerando los siguientes patrones: A) Sin vacuola, B) 1 vacuola menor al 25%, C) 2 vacuolas menores al 25%, D) 1 vacuola mayor al 25% y E) Otrosvarios (Fig. 1).6.- Evaluación de externalización de fosfatidilserina (EPS) En una alícuota de cada fracción se evaluó la EPS mediante el “Annexin V-FITC Apoptosis Kit” (Abcam). Brevemente, se lavó la muestra con PBS y el “pellet” se resuspendió en 500 uL del BP, se agregó 5 uL de “Annexin V-FITC” y 5 uL de Ioduro de propidio (IP) y se incubó por 5 minutos. La detección fue realizada mediante microscopía de fluorescencia. Se consideró los espermatozoides vivos (IP-/ Annexin V+) más no las células muertas (IP+/Annexin V+) (Fig.2).
7.- Evaluación de la Fragmentación del ADN (TUNEL) y caspasa-3 activa (C3A)
Las muestras se fijaron en PBS-Formaldehído al 2%. Seguidamente fueron lavadas y permeabilizadas con metanol frío. Se bloquearon los sitios inespecíficos con BSA 0,5% en PBS; se agregó el anticuerpo primario anti-C3A (Cell Signaling). Luego se agregó el anticuerpo secundario Alexa-Fluor-568 (Molecular Probes). Posteriormente, se incubó con la solución de TUNEL (Roche) para finalmente lavar y montar con Vectashield H-1000 (Vector Laboratories). Se contaron 500 espermatozoides de cada fracción. Los patrones observados son representados en la Fig. 3.
RESULTADOS
En la Tabla 1 se muestran los promedios del externalización de fosfatidilserina, caspasa 3 activa y TUNEL de cada fracción luego del uso de CA-V. Los niveles de EPS (marcador inicial de la apoptosis) disminuyeron significativamente de 28.7% en la FI hasta un 2.3% en la FN, presentando un valor de 57.2% en la FP (p=0.001). En relación a C3A, los valores disminuyeron de 14.8% en la FI hasta un 4% en la FN, y un valor de 28.4% en la FP (p=0.002). De igual manera, los valores de TUNEL en la FI disminuyeron significativamente de 32.3% hasta 9.56% en la FN (siendo este valor considerado como normal) (Sergerie et al., 2005). Mientras que la FP presentó niveles de 53.7% (p= 0.001).
La Tabla 2 muestra los porcentajes y tipos de vacuolas presentes en las fracciones establecidas. Se observa que el número de espermatozoides sin vacuolas (A) no varía significativamente entre las fracciones, encontrándose un 3.6% en la FI, 2.6% en la FN y un 3.6% en la FP. De igual manera los patrones B, C, D y E no evidenciaron variación significativa entre las fracciones estudiadas.
Fig. 1. Patrones evaluados por MSOME
Fig. 2. Patrones observados: A) IP-/Annexin V+ y B) IP+/Annexin V+
Fig. 3. Patrones observados: A) Normal, B) C3A+/TUNEL, C) C3A+/TUNEL+ y D) C3A-/TUNEL+
Tabla 1. Niveles de apoptosis espermática luego del uso de CA-V (* p<0.05)
Tabla 2. Niveles de vacuolas nucleares luego del uso de CA-V
DISCUSIÓN
Nuestros resultados se muestran acordes a lo reportado por otros autores en relación a la disminución de los niveles de apoptosis espermática y fragmentación del ADN luego del uso de Columnas de Anexina V (Said et al., 2005; Said et al., 2006; Dirican et al., 2008; Makker et al., 2008; De Vantéry Arrighi et al., 2009; Rawe et al., 2010; Lee et al., 2010). Sin embargo, nuestro trabajo a diferencia de otros, resalta el haber evaluado muestras con alteraciones severas en la morfología espermática (Kruger <4%).
Por otro lado, de acuerdo a la literatura, se ha expresado la correlación existente entre un mayor índice de fragmentación del ADN y la presencia de vacuolas de mayor tamaño (patrón D) (Franco Jr et al., 2008; Nadalini et al., 2009; Garolla et al., 2008; Oliveira et al., 2010). Sin embargo, nuestros resultados manifiestan que en una población enriquecida de espermatozoides con fragmentación del ADN (FP), se observó una presencia indistinta de espermatozoides con tamaño-numero de vacuolas. Por el contrario, en relación a lo referido anteriormente en la literatura, hubiésemos esperado una mayor cantidad de espermatozoides vacuolados del tipo D.
Somos conscientes que son necesarios más trabajos respecto a este tema en particular, sin embargo, creemos que nuestros resultados hasta el momento develan que en pacientes con alteraciones severas en la morfo-logía espermática, no existiría un predominio de mayor tamaño-numero de vacuolas en espermatozoides con altos niveles de apoptosis espermática. Por lo que probablemente estos pacientes no se beneficien “del todo” con la elección de espermatozoides seleccionados a mayor magnificación, con fines a elegir un espermatozoide no fragmentado en su ADN.
Finalmente comentar que la técnica de Columnas de Anexina V, se presentan como un método efectivo en la remoción de espermatozoides apoptóticos. Siendo que la FN presentó niveles normales de EPS, C3A y TUNEL y esta metodología podría ser empleada para optimizar los resultados de técnicas de reproducción asistida en casos de teratozoospermia severa y apoptosis espermática.
CONSLUSIONES
En pacientes con teratozoospermia severa, los niveles de apoptosis espermática disminuyen significativamente luego uso de CA-V, pero no de la misma manera el porcentaje de espermatozoides vacuolados. No necesariamente existe correlación entre el mayor número-tamaño de vacuolas con altos niveles de apoptosis espermática en este tipo de pacientes. Las CA-V podría considerarse como un método seguro para la reducción de apoptosis espermática en pacientes con teratozoospermia severa.