JBRA Assist. Reprod. 2011;15(3):18-21
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2011.15.3.04
Valor preditivo do Potencial de Implantação Embrionário pela Análise do Perfil Químico de Meios de Cultivo por Espectrometria de Massas (ESI-Q-ToF)
Embryo implantation prediction by culture media chemical profiling with ESI-Q-ToF mass spectrometry
1Associação Instituto Sapientiae - Centro de Estudos e Pesquisa em Reprodução Assistida, São Paulo, SP, Brasil
2Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas, Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP, Campinas, SP, Brasil
3Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Alfenas, Unifal-MG, Alfenas, MG, Brasil
4Fertility - Centro de Fertilização Assistida, São Paulo, SP, Brasil
5Departamento de Ginecologia e Obstetrícia - Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, Botucatu, SP, Brasil
RESUMO
Objetivo: Este estudo caso-controle aplicou a estratégia de análise do perfil químico de meios de cultivo de embriões humanos via espectrometria de massas para predição do potencial de implantação embrionário.
Métodos: O meio de cultivo foi coletado e armazenado após a transferência de 22 embriões de 13 pacientes submetidas à ICSI. As amostras foram classificadas de acordo com o resultado de implantação embrionária (100%, n =8 e 0%, n = 14). Estas foram diluídas e analisadas individualmente, por espectrometria de massas com ionização por eletrospray acoplada a um analisador de massas do tipo Quadrupolo-Tempo de Vôo (ESI-Q-ToF). Os espectros de massa obtidos foram normalizados em relação ao íon de maior intensidade. A análise multivariada dos dados foi realizada no programa MatLab versão 7.0, utilizando a ferramenta Partial Least Squares - Discriminant Analysis.
Resultados: Foram observados 3027 íons nos espectros. A partir dos perfis químicos dos meios de cultivo oriundos de embriões com 0% e 100% de implantação obtidos por ESI-Q-ToF-MS modelados por estatística multivariada, foi possível predizer os grupos de origem de cada amostra. A diferenciação das amostras de cada grupo foi realizada pelos íons presentes em baixas intensidades relativas em ambos grupos.
Conclusões: Os meios de cultivo de embriões com implantação positiva e negativa possuem diferenças significativas entre os perfis bioquímicos, as quais podem ser detectadas de maneira rápida, simples e não-invasiva pela metodologia proposta. Tais diferenças podem auxiliar na seleção de um único embrião para a transferência, visando diminuir o número de embriões transferidos e conseqüentemente, as gestações múltiplas.
Palavras-chave: embriologia, implantação embrionária, seleção de embriões.
ABSTRACT
Objective: This case-control study analyzed mass spectrometry fingerprinting patterns of culture media samples used for embryo culture to predict embryo implantation.
Methods: The culture medium harvested after embryo transfer of 22 embryos from 13 patients was used for the experiments. After embryo transfer, the remaining culture media were collected and samples were split in positive (n=8) and negative (n=14) implantation groups according to implantation outcomes (100% or 0% of implantation). Samples were individually diluted and injected directly to the Electrospray ionization (ESI) MS coupled to a Quadrupole Time-of-flight MS (Q-ToF-MS).Ions relative intensities of each spectrum were considered. Data analysis was conducted in MatLab 7.0 version using Partial Least Squares - Discriminant Analysis toolbox.
Results: There were 3027 observed ions at 100% and 0% implantation groups by ESI-Q-ToF-MS. The statistical model could categorize the samples in two clusters, based on their positive and negative implantation outcomes. Less intense ions present in the mass spectra with statistical significance have contributed to the major differences to group distinction.
Conclusions: Positive and negative implantation embryos showed a specific biochemical pattern present in culture media, which could be detected as a fast, simple and non-invasive way. This biochemical profile could help the selection of the most viable embryo, improving single embryo transfer and thus eliminating the risk and undesirable outcomes of multiple pregnancies
Key words: embryology, embryo implantation, embryo selection.
INTRODUÇÃO
A transferência de um grande número de embriões nas Técnicas de Reprodução Assistida (TRA) visando taxas de gestação satisfatórias conduz ao risco de gestações múltipas. Todavia, este resultado apresenta maiores riscos de morbidade e mortalidade materno-fetal. Desta forma, a seleção e transferência de um único embrião com alto potencial de implantação poderiam eliminar as chances de gestações múltiplas. Contudo, o sucesso de gestação com a transferência de um único embrião selecionado por critérios morfológicos é aproximadamente 30% menor quando comparada à transferência de dois embriões (Pandian et al., 2009; Roberts et al., 2011). A seleção embrionária baseada apenas em aspectos morfológicos e na velocidade de clivagem embrionária não são métodos precisos de predizer o sucesso de implantação. As limitações das estratégias baseadas em critérios morfológicos têm proporcionado a busca por tecnologias para avaliação não-invasiva da viabilidade embrionária (Katz-Jaffe et al., 2009; Aydiner et al., 2010).
Figura 1. ESI(-)-MS de amostras representativas dos meios de cultivo de um embrião com implantação negativa (A) e com 100% de implantação (B).
A identificação de biomarcadores não-invasivos, resultantes de estudos de proteômica, secretoma, do turnover de aminoácidos ou do perfil metabólico presente nos meios de cultivo de embriões têm se mostrado uma proposta promissora para a seleção de embriões mais viáveis e com maior sucesso de implantação. A identificação da viabilidade embrionária de uma forma rápida e não invasiva é um dos maiores desafios da Reprodução Humana Assistida (RHA) na atualidade (Bromer,Seli, 2008; Katz-Jaffe et al., 2009; Sturmey et al., 2009; Aydiner et al., 2010; Cortezzi et al., 2010; Seli et al., 2010).
A determinação do perfil químico por espectrometria de massas (também denominado de MS-fingerprinting) representa uma abordagem rápida para obtenção da “assinatura química” de uma amostra. Essa técnica foi aplicada em diversos modelos para estudos de controle de qualidade e adulteração de produtos, entre eles a própolis (Sawaya et al., 2004), perfumes (Marques et al., 2006), vinhos (Catharino et al., 2006), cachaça (de Souza et al., 2007a; de Souza et al., 2007b), óleos vegetais (Saraiva et al., 2009), veneno de cobras (Souza et al., 2008) e recentemente para o controle de qualidade de meios utilizados na produção in vitro de embriões bovinos (Ferreira et al., 2009).
O objetivo deste trabalho é aplicar a estratégia de MS-fingerprinting para obter o perfil químico de meios de embriões humanos. Por meio de uma abordagem retrospectiva, a assinatura química ou MS-fingerprinting foi obtido de meios de cultivo de embriões com implantação negativa ou com 100% de implantação. Os dados de m/z (massa-carga) dos íons presentes nos perfis químicos e os valores de intensidade relativa de cada um foram submetidos a análise de Partial Least Squares - Discriminant Analysis (PLS-DA) visando discriminar os dois grupos experimentais (Dill et al., 2010).
Figura 2. Gráfico da análise de PLS-DA mostrando os valores de loadings (valores de m/z mais significativos para a separação dos grupos) para a Componente Principal (CP) 1 (A), CP 2 (B) e CP 3 (C).
Este método é considerado o mais adequado para a classificação de dados complexos, proporcionando a identificação de valores de massa/carga (m/z) responsáveis pela separação dos grupos experimentais, proporcionando a geração de um modelo robusto e eficaz de classificação (Dill et al., 2010).
MATERIAL E MéTODOS
Pacientes
O estudo incluiu amostras de meio de cultivo de 22 embriões oriundos de 13 pacientes submetidas à injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As amostras foram classificadas de acordo com o resultado de implantação, sendo 8 amostras com 100% de implantação e 14 amostras com 0% de implantação. Foram obtidos termos de consentimento informado de todas as pacientes, na qual as mesmas concordavam com a divulgação de resultados de seus ciclos para fins de pesquisa.
Estimulação ovariana controlada
A estimulação ovariana controlada foi alcançada por bloqueio pituitário longo usando um agonista do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRHa - Lupron Kit™, Abbott S.A Societé Française des Laboratoires, Paris, France), seguido de estimulação ovariana com hormônio folículo estimulante (r-FSH - Gonal-F®, Serono, Genève, Switzerland) recombinante. As doses de FSH administradas foram ajustadas conforme a resposta folicular de cada paciente. A dinâmica folicular foi acompanhada por dosagens séricas de E2 e USG. Quando observado um folículo com diâmetro superior a 18mm ou dois folículos com diâmetro superior a 16mm a gonadotrofina coriônica humana recombinante (r-hCG - Ovidrel™, Serono, Genève, Switzerland) foi administrada para maturação folicular final. Trinta e seis horas após a administração do r-hCG, os oócitos foram coletados por folículo-aspiração transvaginal guiada por USG.
Preparação dos oócitos
Após a recuperação, os oócitos foram incubados em meio de cultura (Global® for Fertilization, LifeGlobal, Connecticut, USA) suplementado com 10% de albumina humana sintética (HSA, Irvine Scientific, Santa Ana, USA) e coberto por óleo mineral (Ovoil™ - Vitrolife, Kungsbacka, Sweden) por 5 horas a 37ºC e 6% de CO2. As células do cúmulus foram removidas por exposição durante 30s ao meio tamponado com HEPES contendo 80 IU/mL de hialuronidase (Irvine Scientific, Santa Ana, USA). Posteriormente, as células restantes do cúmulus foram cuidadosamente removidas por denudação mecânica usando pipetas Pasteur de vidro afiladas manualmente.Os oócitos denudados foram então avaliados quanto a sua maturação nuclear. Oócitos que apresentavam a extrusão do primeiro corpúsculo polar foram utilizados para ICSI. Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) Para a ICSI, os oócitos foram dispostos individualmente em gotas de 4µL de meio tamponado (Global® w/HEPES, LifeGlobal, Connecticut, USA), e os espermatozóides foram colocados em gotas centrais de PVP (PVP, Irvine Scientific, Santa Ana, USA), cobertos com óleo mineral (Ovoil™ - Vitrolife, Kungsbacka, Sweden).Avaliação da fertilização e transferência embrionária Os embriões foram mantidos em gotas de 50 µL de meio de cultivo (Global®, LifeGlobal, Connecticut, USA) suplementado por albumina humana sintética (HSA, Irvine Scientific, Santa Ana, USA) e coberto por óleo mineral (Ovoil™ - Vitrolife, Kungsbacka, Sweden) a 37ºC e 6% de CO2 até o momento da transferência, no terceiro dia do desenvolvimento.A avaliação da fertilização foi realizada 18 horas após a ICSI. Em seguida, o meio de cultivo foi renovado e os embriões cultivados por mais 48 horas. Após a transferência embrionária, o meio de cultivo restante foi individualmente coletado e armazenado a -20oC.
Preparo das amostras
Após o diagnóstico de implantação, as amostras de meios de cultivo foram divididas em grupos de implantação positiva (n=8) e negativa (n=14), de acordo com os resultados de implantação (100% ou 0% de implantação). As amostras foram armazenadas a -20 oC até a análise pelo Espectrômetro de Massas (MS) utilizando Ionização por Eletrospray (ESI -Electrospray ionization) acoplada a um analisador de massas do tipo Quadrupolo-Tempo de Vôo (Q-ToF - Quadrupole Time-of-Flight) (Waters, Manchester, UK). Para a obtenção do MS-fingerprinting, as amostras foram somente diluídas de modo individual em metanol/água 1:1 (v/v) + 0,1% de hidróxido de amônio. As amostras foram injetadas diretamente na fonte de ionização ESI utilizando uma bomba-seringa com fluxo de 10 μL/min. Os espectros foram adquiridos em modo negativo em uma faixa de m/z de 100 a 1.500 e normalizados em relação ao íon de maior intensidade, mantendo as intensidades relativas dos íons inalteradas.
Análise estatística
A planilha de dados foi organizada, processada e exportada utilizando o módulo XS (Extended Statistics) do software MarkerLynx (Waters, USA), com posterior análise multivariada utilizando o software Matlab 7.0 com PLS_toolbox (Eigenvector Co., Seattle, USA).
Resultados e discussão:
Para a obtenção do perfil químico ou MS-fingerprinting, utilizamos MS por infusão direta utilizando somente diluição para o preparo da amostra, em um espectrômetro do tipo ESI-Q-ToF. Essa abordagem tem como vantagens a rapidez, alta sensibilidade e alta resolução para ampla faixa de moléculas. A análise e interpretação do complexo conjunto de dados obtidos pela MS devem ser realizadas por técnicas estatísticas multivariadas para a classificação das amostras em grupos distintos. O método estatístico mais eficiente e empregado em dados MS é o PLS-DA (Dill et al., 2010).Embora a técnica de MS-fingerprinting tenha sido utilizada com sucesso em diversos modelos experimentais e para o controle de qualidade de meios de cultivo de embriões bovinos, em nosso melhor conhecimento, este é o primeiro relato de utilização desta abordagem na avaliação de biomarcadores para avaliação do potencial de implantação em embriões humanos.Nos espectros de MS-fingerprinting, foram observados 3027 diferentes íons. Para a realização da análise de PLS-DA, os espectros de massas foram divididos em conjunto de calibração e de validação. Por meio dessa abordagem, foi gerado um modelo multivariado para classificação utilizando-se quatro variáveis latentes, as quais descreveram mais que 87% dos dados de origem. Este modelo se mostrou eficiente (100%) na classificação das amostras do conjunto de calibração.Da mesma forma, o modelo estatístico gerado foi hábil em predizer com 100% de acerto os grupos de origem de cada amostra, no caso, o perfil químico de embriões com implantação negativa de embriões com implantação 100% positiva. Entretanto, a implantação é um processo orquestrado que requer a íntima associação entre fatores embrionários e fatores do endométrio materno, com adequada receptividade uterina (Achache,Revel, 2006). Portanto, além da qualidade embrionária, o efeito materno não pode ser descartado no resultado de implantação, apesar das pacientes incluídas no estudo apresentarem preparo endometrial adequado.Portanto, embora os meios de cultivo de embriões com implantação negativa e com 100% de implantação tenham apresentado perfis químicos semelhantes (Figura 1), por meio de íons presentes em pequena intensidade nos espectros, a análise por PLS-DA proporcionou a diferenciação dos grupos experimentais.A análise dos loadings permitiu observar os valores de m/z mais significantes para a separação entre os dois grupos (m/z 245, 203, 153, 143, e 109), sendo possível observar íons candidatos a biomarcadores, conforme Figura 2. Foi possível observar que os grupos são separados não apenas pela presença ou ausência de determinados íons, mas também pela sua intensidade relativa no perfil químico (m/z 268, 270, 281, 283, 508 e 538).As tecnologias não invasivas para como valor preditivo do potencial de implantação embrionário, como a ESI-Q-ToF MS entre outras, adicionadas à seleção baseada na morfologia e na taxa de clivagem, podem auxiliar na seleção do embrião mais competente e viável para a transferência, visando diminuir o número de embriões transferidos e conseqüentemente, as gestações múltiplas na RHA (Botros et al., 2008; Bromer,Seli, 2008; Aydiner et al., 2010).Estão sendo conduzidos novos experimentos para aumentar o número de amostra para melhor avaliação da eficiência de classificação do modelo estatístico proposto.
CONCLUSÕES
A estratégia de MS-fingerprinting de análise de meios de cultivo, a qual envolve mínimo preparo de amostra (diluição e injeção direta na técnica de ESI-Q-ToF MS) e avaliação dos perfis de íons por PLS-DA se mostrou promissora para predição da viabilidade embrionária. As diferenças observadas nos íons estão relacionadas às espécies moleculares proveniente do turnover de moléculas presentes no meio ou da atividade metabólica embrionária, sugerindo-se que existam diferenças significativas entre os perfis bioquímicos entre embriões viáveis e não-viáveis, os quais podem ser detectados de maneira rápida e simples pela metodologia proposta neste estudo. Esta abordagem pode ser realizada em alta velocidade por meio do uso de sistemas robotizados de nano-ESI (NanoMate, Advion), de forma a permitir sua incorporação na rotina das clínicas de RHA, como uma forma adicional de seleção embrionária além da análise morfológica e da velocidade de clivagem embrionária.
A identificação futura de íons marcadores e de suas funções biológicas permitirá também um maior entendimento do metabolismo embrionário e sua relação com o sucesso nos ciclos de RHA.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Achache H. and Revel A. 2006. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation. Hum Reprod Update. 12, 731-746.