JBRA Assist. Reprod. 2011;15(3):38-40
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2011.15.3.10
Emprego de oócitos de descarte como fonte de blastocistos partenotes para geração de linhagens de células-tronco embrionárias humanas com grau clínico.
1Departamento de Ciências Morfológicas, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2Laboratório de Biotécnicas da Reprodução Animal, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz, Porto Alegre, RS
4Laboratório de Hematologia e Células-tronco, Departamento de Análises, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil; Instituto de Pesquisa com Células-tronco
RESUMO
Em ciclos de reprodução assistida (RA) é comum a presença oócitos imaturos na coleta ou oócitos em MII que não foram fertilizados após inseminação, os quais serão descartados. Estes oócitos podem ainda responder a um estimulo externo levando à produção de embriões com capacidade de desenvolvimento limitada, mas capazes de gerar linhagens de células-tronco embrionárias humanas (CTEh). Esta estratégia de geração de embriões contorna problemas éticos envolvendo a utilização de embriões humanos gerados com fins reprodutivos para criação de linhagens de CTEh. Neste estudo, oócitos humanos descartados de ciclos de RA e oócitos bovinos obtidos de abatedouro e maturados in vitro foram ativados partenogenéticamente com SrCl2 ou com o ionoforo de Ca2+ . Em humanos, a ativação por 4 ou 22 hrs com SrCl2 levou a taxa de ativação de 9,7 e 8,3% e de desenvolvimento embrionário de 6,4 e 8,3%, respectivamente. A exposição de 7 oócitos ao ionoforo de Ca2+ resultou na ativação e clivagem de 2 partenotes. Em bovinos, a taxas de ativação e de desenvolvimento embrionário com Sr2+ ficaram entre 2,6 e 26,3%. Com o inonoforo de Ca2+ a ativação e o desenvolvimento embrionário ficaram entre de 47 e 69%, respectivamente. Dos embriões clivados, 23% atingiu o estágio de blastocisto após exposição ao ionoforo e 3,5hrs ao 6-DMAP. Esses resultados sugerem que o ionoforo de Ca2+ juntamente com o 6-DMAP é um agente mais eficiente para induzir a ativação partenogenética em oócitos humanos e bovinos e este sistema será doravante utilizado na ativação de oóctos humanos visando a criação de colônias de CTEh com grau clínico pré-GMP (good manufacturing practice) para futuro emprego em medicina regenerativa.
Palavras-chave: oócito, partenogênese, células-tronco embrionárias, medicina regenerativa.
ABSTRACT
The presence of immature or fail to fertilize oocytes is not uncommon in Assisted Reproduction (AR) cycles and they are usually discarded. These oocytes may still respond to an external stimulus to generate embryos with limited developmental capacity, but capable to give rise to human embryonic stem cell (hESC) lines. This strategy overcomes ethical problems involved in the use of human embryos generated for reproductive reasons to create hESClines. In the present study discarded human oocytes and bovine oocytes obtained from an abattoir and matured in vitro were parthenogenetically activated using SrCl2 or Ca2+ ionophore. Human oocytes cultured for 4 or 22hrs in presence of SrCl2 showed 9,7 and 8,3% of activation and 6,4 and 8,3% of embryonic development, respectively. The exposure of 7 oocytes to medium containing Ca2+ ionophore resulted in 2 activated and cleaved parthenotes. In bovines, activation and embryonic development after exposure to Sr2+ were 2.6 and 26.3%, respectively. Using the ionophore, activation and embryo development rates were 47 and 69%, respectively. Among the cleaved embryos, 23% of them reached the blastocyst stage after exposure to the ionophore followed by 3.5hrs in 6-DMAP. These results suggest us that Ca2+ ionophore together with 6-DMAP represents a better activating agent to induce embryo development in human and bovine oocytes. This system will be used now on to activate human and bovine oocytes aiming to establish a protocol for the creation of hESC colonies with clinical pre-GMP (good manufacturing practice) grade for future use in regenerative medicine.
Keywords: oocytes, parthenogenesis, embryonic stem cell, regenerative medicine.
INTRODUÇÃO
O oócito pode ser considerado a célula fonte de todas as células e tecidos de um novo organismo. Em ciclos de reprodução assistida (RA) é bastante comum a presença de oócitos imaturos em metáfase I (MI) ou vesícula germinativa (VG), no momento da coleta ou oócitos que não fertilizaram após inseminação por FIV ou ICSI. Geralmente, este material é descartado, mas se exposto a um estímulo adequado, capaz de acionar seu ciclo celular, ele tem ainda potencial de desenvolvimento embrionário. Tal processo é conhecido como partenogênese, uma modalidade de reprodução comum em alguns grupos animais. Em mamíferos, embriões partenotes não têm qualquer potencial de desenvolvimento fetal a termo. Entretanto, estes embriões podem ser utilizados como fonte de células pluripotentes para geração de linhagens de células-tronco embrionárias humanas (CTEh) que viriam a beneficiar uma significativa parcela da população, sem envolver dilemas éticos do emprego de embriões gerados com fins reprodutivos. A ativação partenogenética de oócitos murinos com o agente químico SrCl2 acarreta em um desenvolvimento embrionário bastante satisfatório até o estagio de blastocisto (Bos-Mikich et al.,1995;1997). Em humanos, ativação partenogenética de oócitos previamente criopreservados com ionomicina, um ionoforo de Ca2+ levou a índices de ativação de até 86% e 16.7% de formação de blastocistos (De Fried et al., 2008). Estes fatos justificam a utilização de agentes como o SrCl2, um agente indutor de ondas de Ca2+ intracitoplasmático semelhantes às observadas durante o processo de fertilização (Bos-Mikich et al., 1993) ou o ionoforo de Ca2+ (Brevini et al., 2011) para ativação partenogenética de oócitos humanos imaturos ou falhas de fertilização como alternativa para geração de célulastronco embrionárias humanas (CTEh). Este estudo objetivou testar dois sistemas de ativação partenogenética, pelo sal SrCl2 e pelo ionoforo de Ca2+ A 23187, em oócitos humanos descartados de ciclos de RA, para a elaboração de um protocolo eficaz de ativação e desenvolvimento embrionário partenogenético humano com a finalidade de derivação e formação de colônias de CTEh com grau clínico pré-boas práticas de manufatura (cGMP). Devido a relativa pequena disponibilidade de gametas humanos encaminhados à pesquisa e a facilidade de obtenção de ovários bovinos de abatedouro, o trabalho utilizou também este modelo animal para aumentar o numero amostral e a confiabilidade nos resultados alcançados. O modelo bovino foi escolhido por ser o que mais se aproxima da fisiologia ovariana e oocitária da mulher, sendo uma espécie mono-ovulatória, e com a formação de um folículo dominante, situações semelhantes àquelas encontradas em ovários humanos (Bianchi et al., 2010). Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (CEP-UFRGS).
Tabela I. Resultados de ativação e desenvolvimento embrionário de oócitos humanos após exposição ao SrCl2
MATERIAL E MÉTODOS
Oócitos humanos
Oócitos humanos imaturos (MI) ou maduros (MII) coletados em ciclos de estimulação hormonal controlada que não fertilizaram após inseminação por FIV ou ICSI foram encaminhados ao estudo após concordância e assinatura de um termo de consentimento livre e esclarecido por parte dos casais envolvidos em tratamentos de RA no Centro de Pesquisa e Reprodução Humana Nilo Frantz (CPRHNF).Os oócitos coletados imaturos em metáfase I foram expostos a 10mM de SrCl2+ (Sigma) em meio Human Tubal Fluid (HTF-Irvine) por 22hrs e cultivados por até 48hrs em meio HTF para observação de progresso além da MI e neste caso, encaminhados à meio HTF acrescido de 10mMSrCl2 e 5µg/ml de citocalasina D.Oócitos em MII que não mostraram sinais de fertilização até 24 a 30hrs após inseminação por FIV ou ICSI foram encaminhados á ativação em meio HTF contendo 10mM SrCl2+ por 4 ou 22 hrs ou em meio suplementado com 5mM de ionoforo de Ca2+ (A 23187, Sigma). Após a exposição ao meio de ativação, todos oócitos e potenciais zigotos partenotes foram cultivados em meio Global (LifeGlobal) até parada do desenvolvimento ou estágio de blastocisto. O desenvolvimento embrionário foi aferido a cada 24 horas.
Oócitos bovinos
Oócitos bovinos foram aspirados de ovários de abatedouro trazidos ao laboratório à aproximadamente 30-350C até 4hrs após o abate. Os complexos cumulus-oócito (COCs) de boa qualidade (células do cumulus compactas e ooplasma homogêneo) foram maturados por 24 horas em meio TCM 199 (Forell, 2008). Após o período de maturação, os oócitos foram expostos ao SrCl2 por 4, 8 e 20hrs. A seguir, comparou-se o melhor resultado obtido com o sal, com os resultados alcançados pelo tratamento por 5 minutos em meio contendo Ionoforo de Ca2+ (Wang et al., 2008) seguido de 3 ou 3.5 hrs em meio suplementado com 6-DMAP. Após as ativações, os COCs foram cultivados em meio Synthetic Oviduct Fluid (SOF) e avaliados às 48 e 168 hrs de desenvolvimento in vitro em atmosfera de 5% de CO2 a 38.5º.C. Devido a dificuldade de visualização dos pronúcleos em zigotos bovinos, as taxas de ativação basearam-se na constatação de clivagem, 48hrs após exposição ao agente ativador. Foram realizadas 3 ou 4 réplicas de cada experimento de ativação.
Tabela II. Resultados de ativação de oócitos bovinos com diferentes períodos de exposição ao SrCl2
Tabela III. Resultados comparativos de ativação de oócitos bovinos com SrCl2 e ionoforo de Ca2+ com diferentes períodos de exposição ao 6-DMAP
RESULTADOS
Dentre os 18 oócitos coletados em MI e deixados por 22hrs em presença do sal SrCl2 6 (33%) atingiram MII sem haver progresso à formação de pronúcleos e desenvolvimento embrionário, após subseqüente exposição ao SrCl2 acrescido de citocalasina D.
A Tabela I mostra os resultados de ativação de oócitos humanos em MII que falharam a fertilização e foram encaminhados à ativação partenogenética com SrCl2. Dentre o total de 46 oócitos, 36 provieram de falhas de fertilização por ICSI e deles foram gerados os partenotes. Dez oócitos provenientes de uma falha de fertilização por FIV não apresentaram quaisquer sinais de ativação. Subseqüentemente, sete oócitos, falhas de fertilização por ICSI foram expostos ao ionoforo de Ca2+ sendo que 2 destes apresentaram pronúcleos e clivagem até estádio de 2 e 4 células.
Na primeira fase dos experimentos com oócitos bovinos (Tabela II), 157 COCs foram maturados in vitro por 24 hrs. Destes, 139 COCs foram expostos à meio contendo 10mM SrCl2 por 3 diferentes períodos, conforme mostra a Tabela II. As taxas de clivagem foram progressivamente maiores, 2.6%, 15.9% e 26.3% conforme aumentou o período de cultura em presença do sal de 4 para 8 e 20 hrs, respectivamente. Houve a formação de 2 mórulas após 20hrs de exposição dos COCs ao meio contendo Sr2+, sem a formação de qualquer blastocisto (13.3% de desenvolvimento sobre o total ativado). Na segunda etapa dos experimentos (Tabela III), 41 COCs maturados in vitro por 24 hrs foram expostos ao meio contendo 10mM SrCl2 por 20hrs e 100 e 77 COCs foram ativados por exposição ao ionoforo de Ca2+ por 5min seguidos de 3 e 3.5hrs de exposição ao 6-DMAP, respectivamente. Nesta série de experimentos, o índice de ativação e clivagem até o estádio de mórula com SrCl2 foi de 31.4% e 27.2%, respectivamente. Os resultados com ionoforo de Ca2+ mostraram índices de ativação de 47 e 69% nos grupos seguidos de 3hrs e 3.5hrs de exposição ao 6 DMAP, respectivamente, resultados estatisticamente diferentes daqueles alcançados com o sal de Sr2+. Ainda, no grupo ativado com o ionoforo e exposto por 3hrs ao 6-DMAP, houve a formação de um blastocisto (2.2%) e no grupo exposto por 3.5hrs houve a formação de 12 blastocistos ou 23% dos oócitos que clivaram após ativação.
DISCUSSÃO
Os resultados de ativação e clivagem de oócitos humanos com o SrCl2 aqui descritos são inferiores àqueles apresentados por outros autores utilizando outros sistemas de ativação (De Fried et al., 2008), indicando que este talvez não seja o melhor método de indução do desenvolvimento partenogenético para oócitos humanos. Os experimentos com ionoforo de Ca2+ parecem mais promissores, apesar de que o número reduzido de oócitos expostos ao agente não nos permite concluir que este seja um sistema o melhor de ativação para humanos. Os resultados com oócitos bovinos corroboram os resultados com SrCl2 em humanos e reforçam a sugestão de que o ionoforo de Ca2+ seja o agente mais apropriado para induzir a partenogênese em oócitos humanos e bovinos. De Fried e colaboradores (2008) já haviam relatado a indução do desenvolvimento partenogenético de oócitos humanos utilizando a ionomicina, outro ionoforo de Ca2+ com resultados muito satisfatórios de ativação e desenvolvimento ao estágio de blastocisto. Entretanto, o SrCl2 foi utilizado com sucesso para induzir a formação de pronúcleos e desenvolvimento embrionário humano em casos de falha de fertilização por ICSI (Kyono et al., 2009), e em bovinos produziu índices de ativação e desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto entre 34 e 53% e entre 11 e 13% , respectivamente (Méo et al., 2005). Uma das possibilidades da dificuldade em ativar oócitos humanos com o sal seria a idade pós-coleta dos gametas no momento da ativação. Em murinos, a ativação ocorria 2 horas após a coleta dos oócitos (Bos-Mikich et al., 1997) e em bovinos 2hrs após 24 hrs de maturação in vitro dos gametas (Méo et al., 2005). Outra possibilidade para o baixo índice de ativação em oócitos humanos seria a presença de Ca2+ e Mg2+ no meio de ativação, conforme observaram Méo e colaboradores (2005), corroborando resultados apresentados anteriormente em murinos (Bos-Mikich et al., 1995; 1997).
Linhagens de CTEh partenogenéticas já foram descritas na literatura (Mai et al., 2007; Lin et al., 2007; Revazova et al., 2007). Estas linhagens, como a grande maioria das linhagens existentes de CTEh não têm potencial de uso clínico por terem sido geradas em presença de componentes animais no meio de derivação ou de proliferação e crescimento das colônias. A partir dos resultados alcançados com estas séries experimentais partiremos para a derivação em substrato definido visando a produção de linhagens de CTEh partenogenéticas livres de componentes animais para futuro emprego terapêutico em medicina regenerativa.
Referencias Bibliográficas
Bianchi P, Serafini P, Rocha AM, Hassun P, Motta E, Baruselli P, Baracat E. Folicular waves in the human ovary: a new physiological paradigm for novel ovarian stimulation Protocols. Reprod Sci. 2010; 17: 1135-1143.