JBRA Assist. Reprod. 2011;15(4):21-23
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2011.15.4.03
1Halitus Instituto Médico, Marcelo T. de Alvear 2084 (C1122AAF) Buenos Aires
2Fundación REPRO, Marcelo T. de Alvear 2086, 6to D (C1122AAF) Buenos Aires República Argentina
Contacto:
ines.carretero@halitus.com
Presentado como Poster - X Congreso General da Red Latinoamericana de Reproducción Asistida- Rio de Janeiro
RESUMEN
Objetivo: Comparar los resultados obtenidos en un programa de fertilización in vitro con embriones que fueron criopreservados en estadío de blastocisto, ya sea mediante criopreservación lenta o bien por vitrificación.
Pacientes: Se consideraron aquellos pacientes que durante los años 2009 y 2010 tuvieron ciclos de transferencia de embriones criopreservados en estadío de blastocisto.
Métodos: De nuestra base de datos se seleccionaron los ciclos que correspondían a las características mencionadas. Los resultados se analizaron con el programa Graph Pad InStat, mediante el test exacto de Fisher.
Resultados: Se registraron 133 ciclos que correspondían a transferencias de embriones criopreservados en estadío de blastocisto realizadas los años 2009 y 2010. De este total, 107 ciclos correspondían a blastocistos criopreservados por la técnica lenta (grL) y los restantes 26 fueron blastocistos vitrificados (grV). En el grL se descriopreservaron 3,28 ± 1,18 blastocistos por ciclo y en el grV 2,96 ± 1,77 siendo la media de blastocistos transferidos de 2,35 ± 0,90 (grL) y 2,30 ± 0,97 (grV) respectivamente. La diferencia en la recuperación de blastocistos viables entre ambos grupos no resultó significativa (P= 0.4315). En el grL se debieron suspender 11 transferencias (10,3%) mientras que en el grV 3 (11,5%) por falta de viabilidad de los embriones recuperados. En el grL se obtuvieron 39 (40.6%) embarazos clínicos y en el grV se lograron 13 (56,5%); la diferencia observada no resultó significativa (P= 0.2416).
Conclusiones: La criopreservación lenta en estadío de blastocisto se emplea en nuestro centro con resultados satisfactorios. En los últimos dos años se comenzó a explorar las posibles ventajas de utilizar la vitrificación, para determinar si ésta justificaría el cambio del protocolo lento en uso. Si bien los resultados muestran una tendencia a ser mejores con la vitrificación, el número de casos estudiado no permite aún obtener conclusiones con validez estadística.
Palabras clave: blastocisto, vitrificación, criopreservación, enfriamiento lento
RESUMO
Objetivo: comparar os resultados de um programa de fertilização in vitro com embriões criopreservado em estágio de blastocisto, por congelamento lento ou vitrificação.
Pacientes: foram considerados ciclos de transferência de embriões criopreservados como blastocistos durante os anos de 2009 e 2010.
Métodos: A partir do nosso banco de dados, foram selecionados os ciclos correspondentes às características acima. Os resultados foram analisados usando Graph Pad InStat, utilizando o teste exato de Fisher.
Resultados: 133 ciclos corresponderam à transferência de blastocistos criopreservados. Desse total, 107 ciclos pela técnica de lenta (grL) e os restantes 26 blastocistos foram vitrificados (grV). No grL foram 3,28 ± 1,18 blastocistos descongelados por ciclo e do GRV 2,96 ± 1,77 com uma média de blastocistos transferidos de 2,35 ± 0,90 (grL) e 2,30 ± 0 97 (grV), respectivamente. A diferença na recuperação de blastocistos viáveis entre os dois grupos não foi significativa (P = 0,4315). No grL houve 11 impossibilidade de transferências (10,3%), enquanto no grV 3 (11,5%) devido à falta de viabilidade de embriões recuperados. No grL foram obtidos 39 (40,6%) de gravidez clínica versus 13 (56,5%) no grV, diferença não significativa (P = 0,2416).
Conclusões: O congelamento lento de blastocistos é utilizado em nossa instituição com resultados satisfatórios. Nos últimos dois anos começamos a explorar possíveis vantagens da vitrificação para determinar se justificaría uma alteração de protocolos. Os resultados mostram uma tendência melhor da vitrificação, mas o número de casos estudados ainda não permite conclusões estatisticamente válidas.
Palavras-chave: blastocistos, criopreservação, congelamento lento, vitrificação
ABSTRACT
Objective: To compare the results of a program of in vitro fertilization with embryos cryopreserved at blastocyst stage, either by vitrification or slow cooling.
Patients: transfer cycles at blastocyst stage. were considered during the years 2009 and 2010.
Methods: From our database we selected the cycles corresponding to the above characteristics. The results were analyzed using Graph Pad InStat, using the Fisher exact test.
Results: There were 133 cycles corresponding to the transfer of cryopreserved embryos in blastocyst stage, 107 cycles corresponding to the slow technique (grL) and the remaining 26 blastocysts were vitrified (grV). In the grL group there were 3.28 ± 1.18 thawed blastocysts per cycle and the grV group had 2.96 ± 1.77 with an average of 2.35 ± 0.90 (grL) and 2.30 ± 0 97 (grV), respectively. The difference in the recovery of viable blastocysts between the two groups was not significant (P = 0.4315). In grL 11 were due to suspend transfers (10.3%) while the grV 3 (11.5%) due to lack of viability of embryos recovered. In grLthere were were 39 (40.6%) clinical pregnancies versus 13 in the GRV 13 (56.5%). The observed difference was not significant (P = 0.2416).
Conclusions: Slow Cryopreservation at blastocyst stage is used at our institution with satisfactory results. In the last two years we started to explore the possible advantages of vitrification to determine whether it would justify changing the slow protocol in use. While the results show a tendency to be better with vitrification, the number of cases studied does not yet allow statistically valid conclusions.
Keywords: blastocyst cryopreservation, vitrification, slow cooling
INTRODUCCIÓN
Las ventajas de prolongar el cultivo embrionario con el propósito de realizar la transferencia en estadío de blastocisto fueron inicialmente contrarrestadas por las dificultades que muchos grupos tuvieron para obtener resultados aceptables en la criopreservación de los blastocistos restantes. Sin embargo, estas dificultades parecen haberse superado ya que la mayoría de las publicaciones más recientes muestran tasas de embarazo que superan el 40% (Youssry et al, 2008).
En nuestro centro también se registraron algunos inconvenientes cuando se comenzó a descongelar blastocistos criopreservados siguiendo el protocolo lento (Menezo et al, 1996), pero han sido superados al introducir algunos cambios en la técnica que fueron oportunamente comunicados (Quintans et al, 1997). Nuestra experiencia posterior, realizando durante casi 15 años la técnica de criopreservación lenta fue satisfactoria.
La introducción de la vitrificación, técnica ultra rápida, creó la expectativa de obtener mejores resultados comparados con la criopreservación lenta (Youssry et al, 2008, Stehlik et al, 2005). Debido a ello durante los últimos dos años comenzamos a explorar las posibles ventajas de utilizar la vitrificación, para determinar si la misma justificaría el cambio del protocolo lento en uso.
En el presente trabajo se comunican nuestros primeros resultados con vitrificación en estadío de blastocisto, en forma comparativa con lo registrado utilizando criopreservación lenta.
MATERIALES Y MÉTODOS
El esquema general de estimulación fue realizado con la administración de anticonceptivos orales, supresión hipofisaria con agonista de GnRH (acetato de leuprolide) comenzando en día 20-22 del ciclo previo, y luego estimulación con FSH (hormona folículo estimulante) recombinante y hMG (gonadotrofina de mujer menopáusica) purificada dependiendo de la respuesta individual. La inyección de 10000 unidades de hCG (gonadotrofina coriónica humana) se indicó cuando ecográficamente se detectaba el desarrollo de más de 3 folículos de 18 mm. La punción folicular para la captación ovocitaria se realizó 34-36 horas después por vía transvaginal con control ecográfico.
La fertilización in vitro de los ovocitos maduros se efectuó en todos los casos por ICSI, el cultivo embrionario se llevó a cabo a 37º C, en atmósfera de aire saturado de humedad y con 5% de CO2. Como medio de cultivo se empleó SSM (Single Step Medium, Irvine Scientific Santa Ana CA, USA) suplementado con 10% de SSS (Serum Substitute Supplement, Irvine Scientific Santa Ana CA, USA).
La criopreservación lenta se realizó de día 5o a 6º utilizando la técnica abreviada de Menezo con glicerol y sacarosa (Quintans et al, 1997). Para la descongelación se empleó una modificación de la técnica original introducida por nosotros, que consiste en prolongar el período de cultivo de los blastocistos descongelados previo a la transferencia embrionaria durante 16-18 hs., en lugar de las 4-6 horas indicada por el autor.
La vitrificación y calentamiento se efectuaron mediante la técnica de Kuwayama (Kuwayama, 2007) con etilenglicol, dimetilsulfóxido, y sacarosa empleando como soporte una membrana de poliéster transparente. La única modificación introducida fue prolongar también en este caso el período de cultivo hasta la transferencia llevándolo a 14-16 horas en lugar de las 4 a 6 horas como indica el autor.
Para la transferencia de los embriones ya sea criopreservados o vitrificados, el endometrio de las pacientes se preparó con 6 mg diarios de valerianato de estradiol desde el día 2º al 5º del ciclo, continuando con 8 mg/ diarios hasta el día del análisis de β hCG. También se suministró progesterona micronizada a razón de 800 mg por día desde 4 días previos a la transferencia hasta la 12va semana si se producía el embarazo.
La transferencia embrionaria se realizó utilizando un catéter blando (Frydman soft) por vía transcervical y bajo control ecográfico.
RESULTADOS/DISCUSIÓN
En el período considerado (años 2009 y 2010) se programaron 133 ciclos que correspondían a transferencias de embriones criopreservados en estadío de blastocisto. De este total, 107 ciclos de transferencia correspondían a blastocistos criopreservados con la técnica lenta y los 26 ciclos restantes a transferencia con blastocistos vitrificados. La media de edad de las pacientes que recibieron blastocistos criopreservados por la técnica lenta fue de 37,58 ± 5,34 años y en el grupo que recibió blastocistos vitrificados fue de 37,38 ± 5,51, no mostrando diferencias significativas (P= 0.8685) .
Se recuperaron 226 (63,5%) de un total de 356 blastocistos descongelados pertenecientes a 96 ciclos en condiciones adecuadas para ser transferidos, mientras que en 11 ciclos (10,3%) la transferencia debió suspenderse puesto que los blastocistos no resultaron aptos.
Se desvitrificaron un total de 77 blastocistos, resultando aptos para transferirse 53 de ellos (68,8%) correspondientes a 23 ciclos. En los 3 ciclos restantes (11,5%) la transferencia debió suspenderse por no haberse recuperado blastocistos viables.
En las 96 transferencias de congelación lenta realizadas se transfirió un promedio de 2,34 ± 0,89 embriones (rango de 1 a 4), mientras que en las 23 de vitrificación los embriones transferidos fueron 2,30 ± 0,97 (rango de 1 a 4).
Se lograron 39 embarazos clínicos (40.6%) por transferencia de embriones descongelados mientras que por desvitrificación se observaron 13 embarazos clínicos (56,5% por transferencia).
Los resultados en cuanto a número de embriones descriopreservados por ciclo, su sobrevida al tratamiento, y número de embriones transferidos no mostraron diferencias significativas entre ambos grupos. La tasa de embarazo clínico por transferencia parecería ser superior en el grupo de blastocistos vitrificados respecto al de criopreservación lenta; sin embargo estas diferencias no resultan estadísticamente significativas (P= 0.2416).
Según otras publicaciones en donde se comparan los resultados luego de criopreservar con ambas técnicas, la utilización de la vitrificación resultaría más eficaz que el congelamiento lento (4). Sin embargo aún cuando los resultados mediante la técnica de vitrificación no parecieran diferir de los aquí presentados (50% y 56% de embarazo clínico/transferencia respectivamente), la tasa de embarazo que obtienen luego de transferir blastocistos por congelación lenta es muy inferior a la reportada por nuestro centro (16.7 % vs 40,6 %, P= 0,004). Esto sugiere que la diferencia que observan podría deberse más a una baja eficacia en el manejo de la criopreservación lenta que a una real ventaja atribuible a la vitrificación.
En una revisión de trabajos donde se compara la eficacia de ambas técnicas (1), la mayoría de estas publicaciones corresponden al uso de una sola técnica. Esto hace dificultosa la comparación puesto que las poblaciones podrían ser bien diferentes entre sí, observándose una gran variabilidad entre los resultados analizados.
CONClUSIONES
Nuestros resultados muestran una tendencia a ser mejores cuando se utiliza la vitrificación, sin embargo el número de casos estudiado no nos permite aseverar que las diferencias observadas sean estadísticamente significativas. La diferencia encontrada, a favor de los resultados obtenidos con la vitrificación, sugiere la conveniencia de proseguir con el desarrollo del estudio con el objeto de determinar si al aumentar el número de casos dicha diferencia se mantiene hasta alcanzar significación estadística.
Si bien existen publicaciones (1) donde se muestra casuística de criopreservación de blastocistos, ya sea por técnica lenta o bien mediante vitrificación, esos datos no permiten decidir cual de las dos técnicas de criopreservación sería la más exitosa, ya que no en todas las citas de dicha revisión se compara la aplicación de ambas técnicas en poblaciones semejantes de un mismo centro en igual período de tiempo.
REFERENCIAS
1. Kuwayama M. (2007) Theriogenology. 67(1):73-80.
5. Youssry M, Ozmen B, Zohni K, Diedrich K, Al-Hasani S.(2008) Reprod Biomed Online. 16 (2) 311-320.