JBRA Assist. Reprod. 2011;15(4):31-34
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2011.15.4.06
Utilização de Corantes do Tipo Diff-Quik para Avaliação da Integridade da Cromatina Espermática Humana e sua Relação com Processamento Seminal, Taxas de Fertilização, Clivagem Embrionária e Gravidez.
Use of Dyes Like Diff-Quik to Assess the Integrity of Sperm Chromatin and its Relation to Human Sperm Processing, Fertilization, Cleavage and Pregnancy.
Embryolife - Instituto de Medicina Reprodutiva, São José dos Campos, SP, Brasil
Trabalho apresentado no X Congresso Geral da RED Latinoamericana de Reprodução Assistida - Rio de Janeiro - Maio /2011
Resumo
Objetivo: No presente estudo, os autores procuraram testar uma técnica simples e factível, a qual mensura a incidência de espermatozóides com cromatina íntegra numa amostra.
Material e método: Emprega kit de corante do tipo Diff-Quik, rotineiramente utilizado na análise da morfologia espermática, baseando-se na intensidade da pigmentação originada pelo corante na cabeça dos espermatozóides. Foram analisadas as possíveis relações entre a incidência de espermatozóides com cromatina fragmentada e a fertilização, clivagem e gravidez.
Resultados: Corroborando com trabalhos anteriores, relações significativas foram observadas nas taxas de fertilização e clivagem, obtendo-se o patamar de 30% como limite de espermatozóides com cromatina fragmentada na amostra.
Conclusão: Esta metodologia mostrou-se viável para ser empregada na rotina de laboratório, tornando rápida e barata a analogia de um parâmetro seminal de importância preditiva e sua plausível influência nos resultados de RHA.
Palavras-chave: Cromatina, Espermatozóide, Fertilização, Clivagem, Diff-Quik.
Summary
Objective: In this study, the authors sought to test a simple and feasible technique, which measures the incidence of sperm with intact chromatin in a sample.
Material and method: The tecnnique employs the type of dye kit Diff-Quik, routinely used in the analysis of sperm morphology, based on the intensity of pigmentation caused by the dye on the head of the sperm. We analyzed possible relationships between the incidence of sperm with fragmented chromatin and fertilization, cleavage and pregnancy.
Results: Corroborating previous studies, significant relationships were observed in the rates of fertilization and cleavage, yielding a level of 30% as the limit of sperm with fragmented chromatin in the sample.
Conclusion: This methodology was feasible to be used in routine laboratory, making it faster and cheaper the analogy of a predictive importance of seminal parameter and its plausible influence on the results of AHR.
Keywords: Chromatin, Sperm, Fertilization, Cleavage, Diff-Quik.
INTRODUÇÃO
O papel do espermatozóide como um gameta funcional depende de vários fatores, entre os quais, a integridade do DNA nuclear, que é necessária para a transmissão da informação genética paterna. Estudos diversos têm indicado que existe uma relação entre a integridade do DNA espermático e os resultados de fertilização (Agarwal & Allamaneni, 2004; Sharma et al., 2004; O’brien & Zini, 2005; Spano et al., 2005; Li et al., 2006; Shamsi et al., 2008).
A fragmentação do DNA, tem sido apontada como um importante marcador de infertilidade masculina (Evenson et al., 2002; Bungun et al., 2004; Erenpreiss et al., 2008) e amostras seminais de homens inférteis, parecem apresentar níveis de danos no DNA significativamente mais altos em relação a doadores férteis (Chohan et al., 2006). Os danos no DNA espermático, têm sido detectados utilizando-se uma variedade de ensaios (Evenson et al., 2002; Sharma et al., 2004; Agarwal & Allamaneni, 2005), tais como Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) (Evenson et al., 1980), teste de Laranja de Acridina (Tejada et al., 1984), Single Cell Gel Electrophoresis Assay (COMET) (Aravindan et al., 1997), in situ Nick Translation Assay (Gorczyca et al., 1993), e Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUDP Nick-End Labelling Assay (TUNEL) (Sailer et al., 1995). Através destes testes, têm sido feitas tentativas para estabelecer valores limites para a porcentagem de espermatozóides com danos no DNA, acima dos quais a fertilidade seria afetada. A avaliação do status do DNA, aparenta ser de importância para uma estimativa completa da qualidade espermática. No entanto, a maioria destas técnicas, consomem tempo e/ou envolvem protocolos elaborados, reagentes e equipamentos sofisticados (microscopia de fluorescência e citometria de fluxo) os quais não são comuns nos laboratórios de andrologia padrão.
Embora casos específicos possam justificar uma análise mais detalhada, é improvável que a maioria dos laboratórios introduza a avaliação do status do DNA espermático como um parâmetro de rotina na avaliação seminal (Perreault et al., 2003).
Recentemente foi desenvolvido um método simples e rápido de monitorar o status da cromatina espermática em animais selvagens em condições de campo (Mota et al., 2006). Este ensaio utilizava um corante do tipo Diff-Quik, baseando-se nos níveis de pigmentação nuclear. Espermatozóides com a cabeça/núcleo normal, apresentavam pigmentação na cabeça/núcleo leve, enquanto espermatozóide com fragmentação do DNA, apresentavam a cabeça/ núcleo com uma pigmentação mais escura. Embora haja diversos kits desse tipo de corantes disponíveis no mercado, o protocolo sempre consiste na fixação pelo metanol, seguido de uma exposição à eosina, e por fim à tiazina.
Por este motivo, o presente estudo foi conduzido com propósito de avaliar a integridade da cromatina espermática, através de uma técnica simples e factível em todo laboratório de andrologia padrão, relacionando seus achados com as taxas de fertilização, clivagem e gravidez.
METODOLOGIA
As amostras de esperma humano, foram obtidas de pacientes durante o tratamento pela técnica de ICSI em nossos laboratórios. Um total de 47 casos foram avaliados. Para a coloração das lâminas, foram utilizados corantes do tipo Diff-Quik®, de acordo com o seguinte protocolo: fixação pelo metanol, seguido de uma exposição seqüencial à eosina e o corante tiazina. A preparação das lâminas, consistiu em 10µl da amostra espermática em esfregaço, e posterior exposição ao ar para secagem. Posteriormente, foram imersas nos corantes, seqüencialmente por 10 a 20 segundos em cada solução do kit e em seguida transpostas rapidamente na água, para remover o excesso de corante.
Foram preparadas lâminas com amostra seminal inicial (a fresco) e também com o sêmen pós-processado, através da técnica de gradiente de densidade
O estudo de cada lâmina foi feito, levando-se em conta duas categorias de espermatozóides corados: a (Ctg.a) - espermatozóides com a cabeça/núcleo normal, ou seja, os que apresentavam pigmentação na cabeça/núcleo leve e B (Ctg.B) - espermatozóides com cabeça/núcleo com fragmentação no DNA, na qual a cabeça/núcleo apresentava uma pigmentação intensa (FIG. 1). Duzentas células foram contadas em cada lâmina, separando-se os espermatozóides em uma das duas categorias descritas acima. Os dados estatísticos foram examinados com auxílio do software SPSS 8.0®, sendo empregadas análises de dispersão e regressão linear.
Figura 1. Espermatozóides com pigmentação cabeça/núcleo leve (A), espermatozóides com pigmentação cabeça/núcleo intensa (B).
RESULTADOS
De acordo com a tabela 1, a incidência de espermatozóides Ctg.B, é maior nas amostras estudadas a fresco do que nas amostras estudadas após o processamento seminal. No geral, houve diminuição de 31,2% de espermatozóides Ctg.B na amostragem pós processamento.
Tabela 1. Incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B) na amostragem pré processamento (%) X Incidência de espermatozóides com cromatina não integra na amostragem pós processamento (%)
O gráfico 1 ilustra no eixo x, a incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B), em analogia às taxas de oócitos fertilizados (eixo y).
Gráfico 1. Incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B) (%) X Fertilização (%)
De acordo com o teste de regressão linear mostrado acima, há uma relação negativa entre taxas altas de fragmentação do DNA espermático e fertilização oocitária, ou seja, quando a incidência de espermatozóides Ctg.B foi menor, houve um aumento nas taxas de fertilização.
Nota-se ainda que, em casos onde a incidência de espermatozóides Ctg.B ficou ao redor de 20%, a fertilização atingiu taxas próximas a 80%. A partir dos 30% de espermatozóides Ctg.B, as taxas de fertilização se apresentam progressivamente piores e declinantes no gráfico.
O gráfico 2 mostra no eixo y, a incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B), em analogia às taxas de clivagem embrionárias (eixo x).
Gráfico 2. Incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B) (%) X Clivagem (%)
De acordo com o teste de dispersão ilustrado, há uma relação negativa entre taxas altas de fragmentação do DNA espermático e clivagem embrionária. É possível notar uma concentração de pontos circunscritos em área representativa, onde a baixa incidência de espermatozóides Ctg.B indicam melhores taxas de clivagem.
Evidencia-se também que, valores da Ctg.B abaixo de 20%, correspondem a taxas de clivagem próximas a 100%. Ou seja, quando a incidência de espermatozóides Ctg.B foi menor, a clivagem embrionária aumentou.
O gráfico 3 mostra no eixo y, a incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B), em relação às gravidezes ( eixo x), sendo 0 não-grávidas e 100 grávidas. De acordo com este teste estatístico de dispersão, não houve uma relação significativa entre taxas de fragmentação do DNA espermático e gravidez. Pode-se observar que a distribuição dos pontos em área representativa se equiparam nos dois grupos (grávidas e não-grávidas).
Gráfico 3. Incidência de espermatozóides com cromatina não integra (Ctg.B) (%) X Gravidez
DISCUSSÃO
Os parâmetros seminais usualmente avaliados na rotina de laboratório de Andrologia em clínicas de Reprodução Humana Assistida (RHA), não examinam o status da cromatina espermática portanto, homens com DNA espermático anormal, podem apresentar espermograma normal (Agarwal & Allamaneni, 2004; Alvarez, 2003). Assim, não está sendo avaliado um importante parâmetro seminal, certamente relevante para o monitoramente da gametogênese e com possível influência nos resultados em RHA. (O’brien & Zini, 2005; Spano et al., 2005; Li et al., 2006). Diversos estudos têm utilizado testes para analisar a integridade do DNA (Sharma et al., 2004, Evenson et al., 2002; Agarwal & Allamaneni, 2005; Fernandez et al., 2003), embora o que esteja sendo monitorado, pode ser mais bem definido como ‘status da cromatina’ ao invés de ‘status do DNA’. Apesar dos seus possíveis valores clínicos, as técnicas para este tipo de análise são caras, consomem tempo, envolvem protocolos complexos, reagentes e equipamentos não disponíveis na maioria das clínicas de RHA. Portanto, para que seja possível o recrutamento desse tipo de análise rotineiramente, os laboratórios terão de contar com metodologia simples e factível (Perreault et al., 2003). O presente estudo sugere um simples, barato e rápido método que avalia o status da cromatina espermática, utilizando qualquer corante do tipo Diff-Quik, empregado no estudo da morfologia espermática.
Foi observado durante a pesquisa deste trabalho, a diminuição da incidência de espermatozóides com cromatina fragmentada, após o processamento seminal por gradiente de densidade. Este achado, reforça a eficiência e os benefícios do emprego do processamento seminal na melhora dos parâmetros seminais (WHO, 1999), inclusive na seleção de gametas seguros para casais sorodiscordantes (Queiroz, 2008).
Uma correlação significativa foi notada nas taxas de fertilização e clivagem embrionária em relação à incidência de espermatozóides com cromatina integra, divergindo de alguns estudos (Souza et al., 2009; Host et al., 2000; Larson-Cook et al., 2003, Henkel et al., 2004) e corroborando com outros trabalhos diversos (Sun et al., 1997; Lopes et al., 1998; Benchaib et al., 2007; Velles et al., 2007). Levando-se em conta que o genoma paterno é somente ativado 2 dias após a fertilização (Braude et al., 1988), o status do DNA espermático não deveria influenciar neste evento. No entanto, confirmando achados anteriores (Morris et al., 2002; Tesarik et al., 2004), houve neste trabalho uma associação negativa entre a porcentagem de Ctg B. e desenvolvimento embrionário. De acordo com os resultados obtidos, amostras seminais que apresentavam até 30% de espermatozóides com cromatina não-íntegra (Ctg. B), mostraram-se bons para fertilização e clivagem embrionária. Este parâmetro de 30% observado em nosso estudo, corrobora com pesquisas científicas anteriores (Evenson et al., 2002; Souza et al., 2009; Bungun et al., 2007). Múltiplos parâmetros para integridade da cromatina espermática têm sido propostos, nos termos de sua possível capacidade preditiva em RHA. Por exemplo, um limite de 20% ou mais para ‘TUNEL-espermatozoide positivo’ ( ~ Ctg.B), foi proposto para distinguir homens férteis de inférteis (Sergerie et al., 2005), e assim definir um mal prognóstico de gravidez (Benchaib et al., 2003). Este valor corresponde matematicamente a uma linha de corte de ~32% observado em trabalhos anteriores (Souza et al., 2009), também notado em nosso estudo. É claro que vários aspectos deverão ser validados por mais trabalhos. Outra questão importante, diz respeito ao fato de que todas as observações de microscopia óptica, podem ter algum grau de subjetividade de acordo com os critérios técnicos de leitura. Mesmo em ensaios como TUNEL, é necessário um padrão adequado para distinguir manchas genuínas do corante, de artefatos não-específicos (Souza et al., 2009). Nossa observação indicou não haver significância entre taxas de gravidez e espermatozóides com cromatina íntegra, discordando de alguns trabalhos (Tomlison et al., 2001, Benchaib et al., 2003). Este achado pode ser decorrente das múltiplas variáveis que envolvem o processo de implantação embrionária.
Em síntese, o presente estudo procurou mostrar uma técnica simples que, utilizando corantes to tipo Diff-Quik, torna possível a avaliação rotineira do status da cromatina espermática humana, avaliando sua verdadeira importância como marcador da infertilidade masculina.
AGRADECIMENTOS
Nossos agradecimentos a Luis Guilherme Franco Pires de Campos, pela consultoria matemática e estatística, essencial para realização do presente estudo.
O’brien J, Zini A. Sperm DNA integrity and male infertility. Urology 2005; 65: 16-22.