Apoptose e expressão de proteína bcl-2 nos implantes de endométrio ectópico de pacientes portadoras de endometriose

Liv Braga de Paula; Luciana Moro; Núbia Pereira Braga; Marcos Mendonça; Selmo Geber

JBRA Assist. Reprod. 2011;15(5):18-21
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2011.15.5.02

Apoptose e expressão de proteína bcl-2 nos implantes de endométrio ectópico de pacientes portadoras de endometriose

Apoptosis and bcl-2 expression in ectopic endometrium of patient with endometriosis

Liv Braga de Paula¹, Luciana Moro², Núbia Pereira Braga³, Marcos Mendonça⁴, Selmo Geber⁴

¹Programa Saúde da Mulher UFMG. Rua Sergipe 330 apto601 Funcionários Belo Horizonte, MG, CEP 30130 170, TEL 31 84545431/ 32263638,
²Departamento de Patologia do Instituto de Ciencias Biologicas da UFMG
³Programa de patologia do Instituto de Ciencias Biologicas da UFMG
⁴Departamento de Ginecologia e Obstetricia da Faculdade de Medicina da UFMG

Received April 28, 2011
Accepted June 14, 2011

RESUMO
Objetivo: Avaliar a apoptose e a expressão do oncongene Bcl-2 nos implantes de endométrio ectópico de pacientes portadoras de endometriose e no endométrio eutópico de pacientes não portadoras dessa doença.
Pacientes e métodos: Entre março de 2007 e janeiro de 2008, foram selecionadas 16 pacientes que foram divididas em dois grupos, com endometriose pélvica (n=8) e sem endometriose (n=8). A coleta do material para análise foi feita durante cirurgias e os fragmentos de útero eutópico e de implantes ectópicos foram fixados em formol tamponado a 10% e processados para inclusão em parafina. Cortes de 4µm foram corados em Hematoxilina-eosina e submetidos à morfometria para cálculo do índice apoptótico. Alguns fragmentos foram submetidos à reação de TUNEL para a marcação “in situ” da apoptose e à imunoistoquímica para avaliar a expressão da proteína Bcl-2.
Resultados: Observou-se que o índice apoptótico foi significativamente menor no endométrio ectópico das pacientes com endometriose, quando comparado ao endométrio tópico das mulheres sadias independente da fase do ciclo menstrual. A expressão de bcl-2 foi maior no endométrio ectópico das pacientes com endometriose.
Conclusão: Os presentes resultados sugerem que os implantes ectópicos apresentam deficiência do processo de morte celular via apoptose. Conseqüentemente, essas células apresentam maior sobrevida e mais chance de colonizar e se desenvolver em sítios ectópicos. Esse fator parece ser fundamental na patogenia da endometriose.

Palavras-chave: apoptose, endometriose, Bcl-2

ABSTRACT
This study evaluated and compared spontaneus apoptosis and Bcl-2 expression in eutopic endometrium from women without endometriosis and ectopic endometrium of women with the disease. Between March 2007 and December 2008, 16 women who underwent to a ginecology surgery in HC UFMG participated in this study: 8 with endometriosis and 8 controls. The specimens collected were analysed for apoptosis and expression of Bcl-2. Apoptotic cells were detected with the use of dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay. Bcl-2 expression was assessed with the use of the immunohistochemical technique. Spontaneous apoptosis was significantly lower in ectopic endometrium from patients with endometriosis, compared with eutopic endometrium of controls and was independent of the cycle phase. The expression of Bcl-2 was increased in ectopic endometrium of women with endometriosis, mainly in secretory phase. In conclusion, the present study indicates that ectopic endometrium from patients with endometriosis is less susceptible to apoptosis than endometrium from controls due to a higher expression of Bcl-2. So, these cells present increased survival ability that results in continuous growth into ectopic locations. This factor would be fundamental to the pathogenesis of the disease.

Key words: apoptosis, endometriosis, Bcl-2

INTRODUÇÃO
Endometriose é o termo que define a presença de tecido glandular e/ou estroma endometrial funcionante fora do útero (Harada et al., 2004; Orazi et al., 2001; Bulun, 2009). É uma afecção benigna, progressiva e dependente de estrógeno que acomete 2 a 18% das mulheres da população geral e 5 a 50% das mulheres com dor pélvica crônica e/ou infertilidade (Missmer & Crammer, 2003). Apesar da alta prevalência da endometriose e da sua primeira descrição ter sido feita há três quartos de século (Sampson,1927), o conhecimento sobre a etiologia e fisiopatologia da mesma é incerto.
Com relação à etiopatogenia, três teorias principais têm sido propostas para o desenvolvimento do tecido endometrial: metaplasia celômica; remanescentes mullerianos e implante de células endometriais advindas de fluxo menstrual retrógrado (Orazi et al., 2001; Bulun, 2009; Osteen et al., 2005; Laschke & Menger; 2007). A teoria da menstruação retrógrada é também descrita como teoria da implantação ou de Sampson. Esta propõe que o tecido endometrial viável reflui através das trompas uterinas durante a menstruação e se implanta no peritônio ou órgãos pélvicos (Seli et al., 2003). A teoria da menstruação retrógrada, apesar de bem embasada por diversos estudos, não responde a algumas questões essenciais, quais sejam: por que somente 10 a 15% das mulheres da população apresentam a endometriose se 100% delas têm fluxo retrógrado durante a menstruação? Por que existe diferença entre os graus de apresentação da doença?.
Após a disseminação das células na cavidade peritoneal, para que a endometriose progrida, devem ocorrer os seguintes estágios: adesão, proteólise, proliferação, angiogênese e cicatrização. Para tanto, Vinatier (2001) sugeriu que além da presença das células endometriais ectópicas, outros fatores devem estar associados ao desenvolvimento da endometriose. Possíveis alterações nos implantes de endométrio ectópico seriam responsáveis pelo aumento da resistência à defesa peritoneal local. Em pacientes portadoras de endometriose encontram-se alterações no endométrio, também observadas nos implantes ectópicos. Uma das alterações evidenciadas tanto nos implantes ectópicos quanto no endométrio eutópico de pacientes com endometriose é a alteração na regulação da apoptose (Kennedy et al., 2005; Sharpe-Timmis, 2005).
Há indícios de que a deficiência da apoptose esteja envolvida com a maior sobrevivência das células endometriais presentes na cavidade abdominal após refluxo menstrual. Um possível responsável pelo aumento da sobrevida dessas células seria o aumento da expressão de algum membro anti-apoptótico da família de proteínas Bcl-2 (Harada et al., 2004; Missmer & Crammer, 2003; Ulukus et al 2006; Meresman et al., 2000; Suganuma et al., 1997; Tao et al., 1998; Jones et al., 1998; Szymanowisk, 2007). O objetivo de nosso estudo foi determinar o índice apoptótico e a expressão da proteína bcl-2 em implantes de endométrio ectópico de pacientes portadoras de endometriose e comparar com os índices encontrados nas amostras de endométrio tópico das pacientes sem endometriose.

PACIENTES E MÉTODOS
No período de Março de 2007 a Janeiro de 2008, foram selecionadas para o estudo 19 mulheres, que após obtenção de consentimento informado foram divididas em dois grupos: grupo de casos - onze pacientes com endometriose e grupo controle - oito pacientes sem a doença. O grupo de casos constituiu-se de 8 pacientes portadoras de endometriose submetidas à vídeolaparoscopia no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da UFMG. Durante o procedimento cirúrgico foram obtidos fragmentos histológicos das lesões suspeitas de endometriose.
O grupo controle foi composto de 8 pacientes submetidas a cirurgias ginecológicas na mesma instituição, cujos procedimentos cirúrgicos permitiam a realização de coleta da amostra de endométrio e não apresentavam suspeita de endometriose.
Foram excluídas da análise: pacientes com ciclos menstruais irregulares (<25 ou >35 dias), pacientes após a menopausa, pacientes em uso de anticoncepcionais ou terapia de reposição hormonal, pacientes cujo exame histológico não confirmou a endometriose, pacientes que apresentaram a endometriose, confirmada à histologia, mas que suas lâminas não preenchiam o número mínimo de campos necessários previamente definido para análise estatística.
As secções de 4µm dos fragmentos histológicos obtidos foram coradas pelo método de Hematoxilina e eosina sendo submetidas a estudo morfológico em microscopia de luz para identificação e contagem das células e corpos apoptóticos. Após definição do número mínimo de campos necessários foi realizada a contagem, em cada campo microscópico, do número total de células e o número de células sem apoptose. Os números de células apoptóticas obtidos em cada lâmina foram somados e este resultado foi divido pela soma do número total de células obtido em todas as lâminas. Esse valor foi multiplicado por 100 resultando assim no índice apoptótico.
A análise da expressão de bcl-2 foi realizada através de estudo imunoistoquímico. A marcação positiva do Bcl-2 foi definida como identificação de coloração marrom citoplasmática. A presença e a intensidade da marcação foram avaliadas em 30 campos de cada corte. A imunoreatividade foi expressa como a porcentagem de células exibindo a imunomarcação. A intensidade foi descrita como (-) negativa se <3 células marcadas por campo, (+) positiva entre 3 e 8 células marcadas por campo e (++) fortemente positiva quando observadas mais de 8 células marcadas por campo.
Reações de TUNEL foram realizadas para validar critérios morfológicos empregados para identificação e quantificação da apoptose no endométrio e implantes de endometriose. Utilizou-se um kit comercial para a detecção in situ da fragmentação do genoma (CALBIOCHEM - TDT - FragEL DNA fragmentation detection kit, QIA33. Além da marcação específica - grumos amarronzados, revelados pela DAB, eram considerados características morfológicas de apoptose: enrugamento celular com projeções digitiformes da membrana, formação de corpos apoptóticos, convolução e fragmentação da membrana nuclear e compactação da cromatina em massas densas uniformes alinhadas no lado interno da membrana nuclear.
Para a análise estatística dos dados obtidos foi utilizado o SPSS 15.0 e Minitab 15. Resultados com distribuição paramétrica foram comparados pelo Teste t de Student para avaliar eventuais diferenças entre as amostras.
Resultados com distribuição não paramétrica foram comparados pelo teste de Mann Whitney. Os valores de p<0,05 foram considerados significativos.

RESULTADOS
A caracterização das pacientes segundo a idade e características clínicas - dor pélvica crônica, dismenorréia e infertilidade encontra-se descrita na tabela 1. Ao se comparar o IA dos implantes de endométrio ectópico das pacientes portadoras de endometriose (1,35 +- 0,82) com o IA do endométrio eutópico das pacientes do grupo controle (7,5 +-2,02), observou-se que houve diferença significativa (p=0,001) entre os grupos (Gráfico 1).

Tabela 1. Características das pacientes

GRÁFICO 1. Comparação do IA no endométrio de pacientes sem a doença e nos implantes de endométrio de portadoras de endometriose

Quando avaliadas as fases do ciclo menstrual e os índices apoptóticos, foi observado maior IA nas pacientes não portadoras, em ambas as fases. Os índices da fase secretora foram superiores aos da fase proliferativa em ambos os grupos, e houve menor variação dos índices nas pacientes portadoras.
Ao comparar a expressão de Bcl-2 entre as pacientes portadoras de endometriose (27 +-1,93) e as pacientes sem a doença (23 +- 1,56) não se observou diferença significante entre os grupos p> 0,05 ().

GRÁFICO 2. Avaliação do IA nas pacientes portadoras de endometriose e sem a doença nas fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual

DISCUSSÃO
Nas últimas décadas, diversos estudos sobre a fisiopatologia da endometriose têm sido realizados. Motivados pelo impacto na qualidade de vida à qual estão submetidas as pacientes com a doença, estes estudos buscam superar as limitações das opções terapêuticas disponíveis atualmente. Em 1998, foi avaliada, pela primeira vez, a apoptose no endométrio eutópico de mulheres sem endometriose e nos implantes ectópicos de pacientes portadoras da doença. Constatou-se que a susceptibilidade do tecido endometrial das pacientes com endometriose à apoptose era significativamente menor que nas pacientes sem a doença (Braun et al., 2007). O presente estudo teve como objetivo final a comparação da apoptose e a expressão da proteína Bcl-2 (Inibidora de apoptose) nos implantes de endométrio de pacientes portadoras de endometriose com o endométrio de pacientes sadias.
O grupo de casos foi considerado não homogêneo com relação à idade p=0,01. Para a avaliação de um evento endometrial regulado pelos esteróides sexuais, como a apoptose, a presença de ciclos menstruais regulares e ausência de uso de medicações hormonais são os fatores de maior relevância para a comparação da homogeneidade entre os grupos. A exclusão das pacientes em uso de medicamentos como anticoncepcionais orais, terapia de reposição hormonal e inibidores de aromatase é indispensável. O uso dos mesmos encontra-se associado à diminuição da proliferação celular e aumento da apoptose nas pacientes (Meresman et al 2002; Meresman et al 2005). Os grupos das pacientes selecionadas apresentavam ciclos regulares e não faziam uso de nenhuma medicação hormonal, não havendo restrição para sua comparação. Entre as pacientes portadoras de endometriose, 6 (75%) mulheres encontravam-se na fase secretora do ciclo menstrual e 2 (25%) na fase proliferativa. A seleção de maior número de mulheres portadoras de endometriose na fase secretora do ciclo menstrual é sugerida, uma vez que na fase proliferativa encontram-se apenas esporádicas células apoptóticas e na fase secretora esse número aumenta consideravelmente (Jones et al., 1998; Szymanowisk, 2007).
Foi demonstrada a maior prevalência dos sintomas de dor pélvica crônica, dismenorréia e infertilidade no grupo das pacientes portadoras de endometriose. Tais sintomas são descritos como de prevalência aumentada nas portadoras de endometriose por diversos autores (Orazi et al., 2001; Bulun, 2009; Seli et al., 2003; Kennedy et al., 2005)
Em presente estudo, o índice apoptótico do endométrio eutópico das pacientes sadias foi maior que o encontrado nos implantes ectópicos. Desta forma, constatou-se menor susceptibilidade dos implantes de endométrio ectópico à apoptose. Gebel et al. (1998) e Béliard et al. (2004) demonstraram que a apoptose dos implantes ectópicos foi significativamente menor que a encontrada no endométrio tópico do grupo controle. Contrariamente, Jones et al. (1998), ao avaliar a apoptose, não identificou diferença significativa entre implantes ectópicos de portadoras de endometriose e amostras de endométrio eutópico de pacientes sadias. Este autor descreve que foi possível avaliar a apoptose em apenas 3/30 (10%) dos implantes ectópicos, o que pode ter dificultado sua análise estatística.
No grupo das portadoras de endometriose, os implantes ectópicos não apresentaram diferença significativa do índice apoptótico entre as fases do ciclo. Esse resultado sugere que, talvez, o controle da apoptose não esteja relacionado apenas com os níveis hormonais nos implantes endometrióticos. Para a descrição da expressão de Bcl-2, utilizou-se a avaliação semi-quantitativa, como descrita por outros autores (Meresman et al., 2000; Braun & Dmowski, 1998). Foi identificada maior expressão de Bcl-2 no grupo das pacientes portadoras de endometriose, embora sem diferença significativa.
Com base nos resultados apresentados constatou-se que os implantes de endométrio ectópico de pacientes com endometriose apresentam alteração na regulação da apoptose. Porém, não houve diferença significativa na expressão de Bcl-2 entre os grupos. A diminuição da ocorrência da apoptose pode resultar em sobrevivência anormal das células endometriais, sendo um dos fatores associados à patogênese da endometriose (Braun & Dmowski, 1998; Donnez et al., 2003; Roberts & Rock, 2003).