JBRA Assist. Reprod. 1997;01(01):12-15
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.1.03
Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira, Ribeirão Preto, Brasil
Resumo
Introdução: A terapêutica do fator masculino pode ser realizada pelas técnicas de reprodução assistida: inseminação artificial com esperma do marido (IAEM), fertilização ““in vitro”” (FIV) e injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI). Esse estudo avalia as três técnicas.
Material e Métodos: Os homens incluidos neste trabalho apresentaram oligoastenozoospermia segundo os critérios de OMS (1992), na amostra de esperma colhida no dia do procedimento. Assim sendo, foram realizados 126 casos de IAEM em ciclos estimulados com gonadotrofinas. Em seguida, foi efetuada uma inseminação por ciclo no período de 36 a 38 horas após a administração da gonadotrofina coriônica humana. No mesmo período foram efetuados 152 ciclos de FIV convencional e 303 ciclos de ICSI. Para a ICSI o complexo cumulus-corona foi removido, sendo a injeção dos espermatozóides realizada em microscópio Olympus IMT-2 equipado com contraste Hoffman e acoplado com manipulador automático MM-88 (Narishige, Japan). O controle das micropipetas de injeção e a fixação dos oócitos foi realizada por micromanipuladores hidraulicos MO-202 (Narishige, Japan). Usou-se uma solução de polivinilpirrolidina 10% para a imobilização dos espermatozóides. O preparo dos espermatozóides foi realizado com dois gradientes de Percoll (40%, 90%) quando possível.
Resultados: A taxa de gravidez por ciclo foi de 7.9% para IAEM, 16.4% para FIV e de 31.3% para o ICSI Os resultados obtidos demonstraram uma superioridade da ICSI sobre a IAEM (p < 0.01) e sobre a FIV convencional (p<0.01).
Conclusão: A ICSI é a técnica de reprodução assistida de escolha para o tratamento da oligoastenozoospermia quando se analisa apenas a eficiência do método.
Unitermos: oligoastenozoospermia, tratamento, inseminação artificial, fertilização “in vitro”, injeção intracitoplasmática de espermatozóides
Abstract
Introduction: The male factor can be treated with assisted reproduction techniques, i.e., artificial insemination with husband’s sperm (AIHS), “in vitro” fertilization (IVF), and intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
Material and Methods: The men included in the study presented oligoasthenozoospermia according to WHO (1992) criteria in the sperm sample collected on the day of the procedure. A total of 126 AIHS procedures were carried out in cycles stimulated with gonadotropins. One insemination per cycle was then perform ed 36 to 38 hours after administration of human chorionic gonadotropin. A total of 152 Standard IVF cycles and 303 ICSI cycles were performed. For ICSI the cumulus-corona complex was removed and spermatozoa were injected under an Olympus IMT-2 microscope equipped with Hoffman contrast and coupled to an automatic MM-88 manipulator (Narishige, Japan). MO-202 hydraulic manipulators (Narishige, Japan) were used to control the injection micropipettes and oocyte fixation. A solution of 10% polyvinylpyrrolidone was used to immobilize the spermatozoa. When possible, the spermatozoa were washed on a Percoll gradient (40%, 90%).
Results: The pregnancy rate per cycle was 7.9% for AIHS, 16.4% for IVF and 31.3% for ICSI. The results demonstrate the superiority of ICSI over AIHS (p < 0.01) and over standard IVF (p < 0.01).
Conclusion: ICSI is the assisted reproduction technique of choice for the treatment of oligoasthenozoospermia when only the efficiency of the method is considered.
Keywords: oligoasthenozoospermia, treatment, artificial insemination, “in vitro” fertilization, intracytoplasmic sperm injection
Introdução
Atualmente, várias técnicas de reprodução assistida são oferecidas ao casal infértil com fator masculino presente. A inseminação artificial com espermatozóides do marido (IAEM) tornou-se um método popular, por sua simplicidade, custo operacional baixo e caráter ambulatorial.
Por outro lado, nos primórdios do seu desenvolvimento a fertilização “in vitro” (FIV) visava corrigir os problemas de infertilidade das mulheres com lesões tubárias. Entretanto, com a simplificação da técnica, e a melhoria dos resultados, tornou-se evidente que seus horizontes poderiam ser extendidos para outros casos de infertilidade, inclusive nas situações de comprometimento do fator masculino.
Em 1992, Palermo et al. descreveram o emprego da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) em 47 oócitos pré-ovulatórios (metáfase II), verificando que 38 permaneceram intactos após a microinjeção, fertilizaram 31 (taxa de fertilização de 66%) e foram transferidos para o útero 15 embriões. Um total de 4 gestações foram obtidas após 8 ciclos de tratamento (duas gestações únicas, uma gemelar, e um aborto pré-clínico). Desde este momento, a ICSI tornou-se uma técnica de grande valia na abordagem do fator masculino.
O objetivo deste estudo foi comparar as técnicas de reprodução assistida: IAEM, FIV e ICSI, como terapêutica do fator masculino.
Material e Métodos
Os homens incluidos neste estudo apresentaram no dia do procedimento, um espermograma anormal segundo os critério da OMS (WHO, 1993). No período de abril de 1995 a agosto de 1996 foram realizados 126 ciclos de IAEM, 152 ciclos de FIV convencional e 303 ciclos de ICSI.
A estimulação ovariana para IAEM foi realizada com FSH-HP (Metrodin-HP, Serono) na dose de 75 UI a 150 UI (a seleção da dose inicial depende do peso e idade da paciente) aplicada com intervalos de 48 horas, tendo início no 3º dia do ciclo menstrual. Em geral, procurou-se obter um lote com 2 a 4 folículos. A dose de FSH-HP necessária para cada paciente é cuidadosamente avaliada pelo seguimento do desenvolvimento folicular através de ultra-sonografia vaginal seriada. Uma dose de gonadotrofina coriônica humana (hCG) de 10.000 UI (Profasi- HP, Serono) foi administrada quando um ou mais dos folículos líderes apresentarem diâmetro maior que 17mm, e o fator de sincronia ovariano, esteve o mais próximo possível de 0,70 (Franco Jr et al., 1991; Franco Jr et al., 1994).
Atualmente, realiza-se apenas uma inseminação por ciclo entre 36 a 38 horas após o emprego da hCG. O volume do material inseminado foi fixado em 0.5 ml, suficiente para caracterizar uma inseminação como do tipo tubo-uterina (Franco Jr et., 1992).
O processo de estimulação ovariano para a FIV e para a ICSI foi realizado com o acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) associado com FSH-HP (Metrodin-HP, Serono) ou hMG (Pergonal, Serono) como medicações de primeira escolha. Inicia-se o bloqueio no 21º dia do ciclo menstrual anterior ao procedimento. Após 15 dias, desde que a menstruação tenha ocorrido, gonadotrofinas na dose de 150 UI a 300 UI por dia foram empregadas durante 7 dias. No 8º dia começava o controle do processo de estimulação ovariana somente pela ultra-sonografia vaginal.
Por outro lado, nas pacientes com baixo recursos econômicos usou-se um esquema denominado de semiprogramado (esquema de Viena) que consta de um bloqueio com anticoncepcional de baixa dosagem (etinilestradiol 30 μg e gestodene 75 μg) desde o primeiro dia do ciclo menstrual precedente ao da estimulação ovariana, e mantido por um período mínimo de 21 dias e máximo de 28 dias, sendo que a última pílula foi tomada sempre numa segunda-feira. Obrigatoriamente, a estimulação ovariana terá início no 5º dia após o término da pílula (sempre num sábado), com citrato de Clomifene na dosagem de 100 mg por dia durante 5 dias, FSH-HP (Metrodin-HP) ou hMG (Pergonal) na dose de 150 UI em dias alternados, e dexametasona 0.5 mg por dia.
Geralmente quando três ou mais folículos atingiram o maior diâmetro de 17 mm, foi administrado 10.000 UI de hCG e a coleta dos oócitos efetuada 34 a 36 horas por punção transvaginal guiada por ultra-som.
Em geral, a manutenção da fase lútea para todas as três técnicas de reprodução assistida foi realizada com hCG nas doses de 1000 UI no 4º, 6º, 8º e 10º dia após a rotura folicular, ou por progesterona, via intramuscular na dose de 50mg/dia ou via oral ou vaginal na dose de 300-600 mg/dia (Utrogestan, Besins Iscovesco, França) durante 14 dias.
Para o preparo do esperma para a IAEM, FIV e a ICSI utilizou-se o método dos gradientes de Percoll da seguinte forma:
1 - Prepara-se uma solução isotônica de Percoll (SI) com 9 ml de Percoll mais 1 ml de Harn F-10 (10x concentrado). Ajusta-se a osmolaridade para 280 mOsm/Kg H2O. Em seguida, adiciona-se penicilina na dose de 60 mg/l. Filtra-se a solução em 0.22 μm e estocada-se até 30 dias à 4ºC.
2 - O preparo dos gradientes de Percoll é realizado com as seguintes diluições :
1. Solução 90%: 1.35 ml de SI + 0.15 ml de meio de cultura com 30% de soro inativado (MC-30).
2. Solução 40%: 0.6 ml de SI + 0.9 ml de MC-30.
Assim sendo, coloca-se 1.5 ml dos diferentes gradientes em tubo cônico de 15 ml (Corning). Acima do gradientes de 40% deposita-se um volume até 3 ml de sêmen liquefeito. Centrif uga-se em 200 g por 20 minutos, no caso de amostras viscosas aumentar o tempo de centrifugação. Após a centrifugação remover o plasma seminal e a camada do gradiente de 40%. Finalmente, lava-se o sedimento formado no fundo do tubo, e a camada correspondente ao gradiente de 90% com 10 ml de MC-30, uma vez em 200 g por 10 minutos. O sedimento é ressuspenso no volume desejado com MC-30. Nesse ponto, na execução da técnica de FIV, realiza-se um “swim-up” no último sedimento com adição de 0.5 ml de MC-30, e incubação por 15 minutos em atmosfera de CO2 a 5% na temperatura de 37ºC. Em seguida, acerta-se a concentração de espermatozóides para a inseminação dos oócitos.
A técnica do processo de FIV e transferência de embriões utilizada foi descrita anteriormente (Franco Jr et al., 1995).
Na ICSI o líquido folicular é depositado em placas de cultura (Corning, New York). Em seguida, os oócitos são identificados, e com o auxílio de pipetas Pasteur transferidos para placas de cultura de Nunc (Roskilde, Denmark), contendo o meio de cultura IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden).
Posteriormente, o complexo cumulus-corona é removido pela exposição em hialuronidase (80 UI/ml - Sigma Chemical Co., St Louis, USA) diluída no meio GAMETA-100 (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden). O tempo de exposição na hialuronidase é variável, sendo os oócitos completamente desnudados através de sucessivas passagens em pipeta Pasteur estiradas. O procedimento de desnudação foi executado em placas de Nunc. Os oócitos desnudados foram incubados no meio IVF-50 até o momento da ICSI. Apenas os oócitos com o primeiro corpúsculo polar (metáfase II) foram in jetados.
As amostras de esperma foram coletadas por masturbação e em seguida, depositadas em placas de cultura (Corning, New York) mantidas na temperatura de 37ºC. Após a liquefação, os materiais foram analisadas em microscópio de contraste de fase, sendo a contagem dos espermatozóides executada na câmara de Makler (Sefi-Medical Instruments, Haifa, Israel). O critério de normalidade da amostra de esperma foi o estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS).
A ICSI foi realizada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com um sistema de lentes Hoffman, e acoplado com um micromanipulador automático MM-88. Os discos de cultura permaneceram na temperatura de 37ºC, com o auxílio de uma placa de aquecimento (Swemed Lab, Västra Frölunda, Sweden). O controle da micropipeta (diâmetro interno de 4.8 μm a 5.6 μm, e externo, de 6.8 μm a 7.6 μm, com angulação de 30º) de transporte e injeção do espermatozóide foi realizado por micromanipulador hidráulico MO 202 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Uma micropipeta (diâmetro interno de 18 μm a 25 μm, e externo 80 μm a 150 μm, com angulação de 30º) foi usada para fixação do oócito sendo guiada para essa função por um manipulador MN-155 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Os microinjetores usados foram do tipo IM6B (Narishige Co, Tokyo, Japan).
O óleo mineral (Sigma Chemical Co, St Louis, USA) usado para evitar alterações importantes do pH no sistema foi lavado por duas vezes com água ultrapurificada (Sistema Milli-Q UF, Millipore CO, São Paulo, Brasil) e incubado com 10ml do meio de cultura Menezo B2 por uma noite, numa atmosfera com CO2 a 5% e temperatura de 37ºC.
Em seguida, utiliza-se uma solução de polivinilpirrolidina (PVP, Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden) (concentração de 10%, diluída em IVF-50) para a imobilização dos espermatozóides. A solução viscosa de PVP é produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas. A solução de PVP foi estocada na temperatura de 4ºC, até o momento do uso quando foi equilibrada na temperatura ambiente. Uma pipeta Eppendorf (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) equipada com ponteira estéril (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) não pirogênica, livre de DNA, RNAse e ATP, deposita um gota de 5μl de GAMETA-100 no centro da placa de cultura, e quatro gotas ao redor. As gotas devem ser cobertas imediatamente com óleo mineral pré-equilibrado para evitar evaporação. Antes de iniciar o procedimento de ICSI a gota central é removida, e substituída por PVP no volume de 5μl. Em seguida, adiciona-se uma pequena gota de esperma (1μl) no centro da gota de PVP. O espermatozóide é sugado na periferia da gota de PVP.
Para a execução da ICSI, usa-se o aumento de 200x. A micropipeta de ICSI deve ser posicionada na periferia da solução de PVP, e um espermatozóide morfologicamente normal é imobilizado por passagens sucessivas na micropipeta e capturado por sucção para o procedimento.
A micropipeta contendo o espermatozóide é removida desta gota, e transferida para a gota que contem o oócito. O oócito deve ser delicadamente sugado com a micropipeta de fixação. O primeiro corpúsculo polar é posicionado na posição de 6 ou 12 horas, e a micropipeta com o espermatozóide, introduzida horizontalmente na posição de 3 horas dentro do ooplasma. Uma gentil sucção é aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema, e para evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide (não na invaginação do oolema).
O espermatozóide imobilizado é inserido junto com o ooplasma sugado, com um mínimo de volume possível de PVP. A pipeta de ICSI deve ser delicadamente removida, e o oócito liberado. Os oócitos injetados devem ser lavados em IVF-50, e transferidos para o novo IVF-50 suplementado com soro inativado da paciente a 10%.
Os oócitos são observados após 16 a 18 horas do procedimento, para verificar a presença, ou não, de pronúcleos. O processo de fertilização normal é definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido do aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização.
Resultados
A taxa de gravidez por ciclo foi de 7.9% para IAH (10 gestações em 126 ciclos), 16.4% para FIV (25 gestações em 152 ciclos) e de 31.3% (95 gestações em 303 ciclos) para o ICSI. Os resultados obtidos demonstraram uma superioridade da ICSI sobre a IAH (p< 0.01) e sobre a FIV convencional (p < 0.01).
Discussão
Segundo revisão da literatura realizada por Dodson & Haney (1991) os índices de gravidez por ciclo usando-se a IAEM intra-uterina para correção da infertilidade de causa masculina variaram em ciclos não estimulados de 0% até 21%, nos ciclos estimulados por citrato de Clomifene de 3% até 12%, naqueles com gonadotrofinas de 3% até 25%. Os dados obtidos no presente estudo de 7.9% de gestação/ciclo com a IAEM concordam com esta revisão.
Burr et al. (1996) verificaram que o grau de teratozoospermia presente na amostra de esperma pode afetar os resultados da IAEM. No grupo com morfologia normal ≥10%, a taxa de gestação foi de 18.2%, entretanto naquele com morfologia ≤10%, a taxa de gestação foi de 4.3%.
Em 1985, Hewitt et al. referem que a IAEM intrauterina foi tão eficiente quanto a fertilização “in vitro” no tratamento dos casos de oligozoospermia pura.
No momento, a indicação da FIV para a correção do fator masculino está sendo totalmente substituída pela ICSI, desde que o processo de estimulação da ovulação e os riscos do procedimento de captação dos óvulos são os mesmos nas duas técnicas de reprodução assistida.
Por outro lado, Van Steirteghem et al. (1993) confirmaram o sucesso do uso da ICSI no tratamento de 150 pacientes que não conseguiram fertilização dos oócitos em ciclos prévios de FIV e/ou não foram aceitas no programa FIV convencional, pois não havia uma quantidade suficiente de espermatozóides. Um total de 1409 oócitos em metáfase II foram inseminados sendo que 8.3% deles foram lesados durante o procedimento. Após 18 horas, 64.2% dos oócitos inseminados apresentaram pronúcleos. As taxas de fertilização não foram influenciadas pelas características do sêmen. Apenas 15 pacientes (10%) não tiveram embriões para transferência. O resultado final foi de gestação clínica por punção de 35.3% e por transferência embrionária de 39.2%.
No presente estudo as taxas de gestação clínica obtidas com a aplicação da ICSI foram superiores aquelas obtidas com a IAEM e com a FIV.
Em conclusão, a ICSI é a técnica de reprodução assistida de escolha para o tratamento da oligoastenozoospermia quando se analisa apenas a eficiência da metodologia.