JBRA Assist. Reprod. 1997;01(01):16-19
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.1.04
Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira - Ribeirão Preto - SP
Resumo
Introdução: A coleta de espermatozóides do epidídimo seguida da aplicação da técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é uma solução eficiente para casos de azoospermia obstrutiva. Esse trabalho analisa essa conduta em nossa unidade.
Material e Métodos: Um total de 25 pacientes com azoospermia obstrutiva (agenesia congênita do deferente, obstrução por infecção, vasectomia ou insucesso após correção) e outras causas (ejaculação retrógada, problemas para coletar a amostra de esperma) foram submetidos com suas esposas ao programa de ICSI com espermatozóides colhidos do epidídimo. A idade da população masculina foi de 38 ± 7.9 anos, sendo a feminina de 30.2 ± 5.4 anos.
A estimulação ovariana foi realizada com bloqueio ovariano de 2ª fase com acetato de leuprolide seguido de FSH puro (Metrodin-HP, Serono). A coleta dos espermatozóides do epidídimo foi efetuada com técnica de aspiração microcirúrgica (MESA) em 3 ciclos, e por punção aspirativa com agulha (PESA) em 25 ciclos. Em todos os procedimentos coletaram-se espermatozóides.
Resultados: Um total de 248 oócitos foram coletados, sendo 207 oócitos em metáfase II (83.4%). O número médio de oócitos foi de 8.86±5. 7, a taxa de fertilização normal de 63.8 ±28 e o número médio de embriões transferidos de 2.93 ±1.1. A falha total de fertilização ocorreu em dois ciclos (7%). A taxa de gravidez por punção foi de 42.8%, e a de gravidez por transferência de 46%. Observou-se um total de 7 gestações únicas e 5 gestações múltiplas. Um total de 13 pacientes congelaram amostras para futuros procedimentos.
Conclusão: A coleta de espermatozóides do epidídimo seguida de ICSI foi um método eficiente para solucionar os casos de infertilidade por azoospermia obstrutiva.
Unitermos: espermatozóides, epidídimo, injeção intracitoplasmática, ICSI
Abstract
Introduction: Sperm collection form the epididymis followed by application of the technique of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is an efficient solution for cases of obstructive azoospermia. We report here on the results obtained with this technique at our unit.
Material and Methods: A total of 25 patients with obstructive azoospermia (congenital agenesis of the vas deferens, obstruction due to infection, vasectomy or lack of success afier correction, etc.) and others causes (retrograde ejaculation, problems to collect the sperm sample) were submitted to an ICSI program together with their wives using sperm collected from the epididymis. The age of the male population was 38±7.9 years, and the age of the female population 30.2±5.4 years. Ovarian stimulation was performed by 2nd phase ovarian blockade with leuprolide acetate followed by pure FSH (Metrodin-HP, Serono). Sperms were collected from the epididymis by the microsurgical aspiration technique (MESA) in 3 cycles and by aspirative needle puncture (PESA) in 25 cycles. Sperms were collected in all procedures.
Results: A total of 248 oocytes were collected, 207 of them in metaphase II (83.4%). Mean oocyte number was 8.86±5.7, the rate of normal fertilization was 63.8±28, and the mean number of embryos transferred was 2.93±1. 1. Total failure of fertilization occurred in two cycles (7%). The pregnancy rate per puncture was 42.8% and the pregnancy rate per transfer was 46%. Seven singleton pregnancies and 5 multiple pregnancies were observed. A total of 13 patients froze samples for future procedures.
Conclusion: Sperm collection from the epididymis foliowed by ICSI was an efficient method for the solution of cases of infertility due to obstructive azoospermia.
Keywords: sperms, epididymis, intracytoplasmic injection, ICSI
Introdução
As duas principais causas de infertilidade masculina com espermatogênese normal são a agenesia congênita bilateral dos deferentes, e a azoospermia obstrutiva sem possível correção cirúrgica. O protocolo básico para a solução destes casos consistia na aspiração microcirúrgica do epidídimo proximal (MESA), e subsequente, aplicação da técnica de FIV. Algumas gestações foram obtidas com esse procedimento (Temple-Smith et al., 1985), entretanto, a taxa de fertilização com espermatozóides obtidos do epidídimo era baixa e os índices de gravidez não excediam a 9%.
Recentemente, Tournaye et al. (1994) realizaram MESA acompanhada da ICSI em 40 pacientes com ausência congênita bilateral do ducto deferente, obtendo por ciclo de aspiração um índice de gestação clínica de 39%.
Em seguida, diversos grupos de reprodução assistida começaram a indicar a coleta de espermatozóides do epidídimo seguida da ICSI, mesmo em caso de azoospermia obstrutiva após vasectomia, onde a correção cirúrgica é realizada com elevado sucesso. Além disso, algumas situações de urgência podem necessitar de uma abordagem do epidídimo como fonte de espermatozóides.
A finalidade deste estudo foi avaliar a performance no programa de ICSI de pacientes em que a coleta dos espermatozóides foi obtida do epidídimo.
Material e Métodos
Um total de 25 pacientes em 28 ciclos de estimulação de suas esposas realizaram coleta de espermatozóides do epidídimo para solução da infertilidade masculina, no Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira até dezembro de 1996.
A azoospermia obstrutiva após vasectomia ou insucesso na sua correção foi a indicação principal em dez pacientes (40%). A agenesia congénita do deferente esteve presente em seis pacientes (24%), sendo obrigatória a avaliação dos genes para fibrose cística no casal. O diagnóstico de azoospermia obstrutiva por infecção ocorreu em quatro pacientes (16%) e por trauma em um paciente (4%). Por outro lado, dois pacientes com oligozoospermia grave (8%), não apresentaram espermatozóides no dia da coleta do esperma para o procedimento de ICSI, sendo submetidos à punção do epidídimo. Um paciente sem alterações prévias da função espermática (4%), não conseguiu coletar a amostra de esperma por masturbação no dia da punção oocitária. Finalmente, um paciente apresentou ejaculação retrógada (4%).
A idade média da população masculina foi de 38.04±7.9, e a feminina de 30.25±5.39.
O esquema de estimulação ovariana preferencial foi o do bloqueio da 2ª fase com acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) seguido FSH puro (Metrodin-HP, Serono) na dosagem de 150 UI a 300 UI. O controle do desenvolvimento folicular foi executado apenas por ultra-sonografia vaginal, sendo realizada a administração da gonadotrofina coriônica humana (Profasi-HP), quando se observou um mínimo de 3 folículos com 17mm. Após a punção folicular por ultra-som vaginal, o líquido folicular foi depositado em placas de cultura (Corning, New York). Em seguida, os oócitos foram identificados, e com o auxílio de pipetas Pasteur transferidos para placas de cultura de Nunc (Roskilde, Denmark), contendo o meio de cultura IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden).
Posteriormente, o complexo cumulus-corona foi removido pela exposição em hialuronidase (80 UI/ml - Sigma Chemical Co., St Louis, USA) diluída no meio GAMETA-100 (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden). O tempo de exposição na hialuronidase foi variável, sendo os oócitos completamente desnudados através de sucessivas passagens em pipeta Pasteur estiradas. O procedimento de desnudação foi executado em placas de Nunc. Os oócitos desnudados foram incubados no meio IVF-50 até o momento da ICSI. Apenas os oócitos com o primeiro corpúsculo polar (metáfase II) foram in jetados.
As amostras de esperma foram coletadas por MESA (3 ciclos) ou através de punção percutânea do epidídimo (PESA) com agulhas de 21G a 23G (25 ciclos). Em seguida, depositadas em placas de cultura (Corning, New York) mantidas na temperatura de 37ºC. O material foi analisado em microscópio de contraste de fase, sendo a contagem dos espermatozóides executada na câmara de Makler (Sefi-Medical Instruments, Haifa, Israel) quando em número significativo.
A separação dos espermatozóides do fluido seminal foi realizada através de gradientes descontínuos de Percoll com 1.5ml das frações de 40% e 90% de Percoll (diluições preparadas com meio IVF-50). Após centrifugação em 200 g por 20 minutos, a camada de 90%, e o sedimento, são transferidos para um novo tubo e ressuspensos em IVF-50. Após nova centrifugação em 200 g por 10 minutos, o sobrenadante é desprezado, e 1 ml de IVF-50 é adicionado ao sedimento. Nessa ocasião, a amostra de espermatozóides é analisada, e estocada em cultura com CO2 a 5% até o momento do uso para ICSI.
A ICSI foi realizada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com um sistema de lentes Hoffman, e acoplado com um micromanipulador automático MM-88. Os discos de cultura permaneceram na temperatura de 37ºC, com o auxílio de uma placa de aquecimento (Swemed Lab, Västra Frölunda, Sweden). O controle da micropipeta (diâmetro interno de 4.8 μm a 5.6 μm, e externo, de 6.8 μm a 7.6 μm, com angulação de 30º) de transporte e injeção do espermatozóide foi realizado por micromanipulador hidráulico MO 202 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Uma micropipeta (diâmetro interno de 18 μm a 25 μm, e externo 80 μm a 150 μm, com angulação de 30º) foi usada para fixação do oócito sendo guiada para essa função por um manipulador MN-155 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Os microinjetores usados foram do tipo IM6B (Narishige Co, Tokyo, Japan).
O óleo mineral (Sigma Chemical Co, St Louis, USA) usado para evitar alterações importantes do pH no sistema foi lavado por duas vezes com água ultrapurificada (Sistema Milli-Q UF, Millipore CO, São Paulo, Brasil) e incubado com 10ml do meio de cultura Menezo B2 por uma noite, numa atmosfera com CO2 a 5% e temperatura de 37ºC (tempo de conservação máximo: 7 dias).
Em seguida, utiliza-se uma solução de polivinilpirrolidina (PVP, Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden) (concentração de 10%, diluída em IVF-50) para a imobilização dos espermatozóides. A solução viscosa de PVP foi produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas. A solução de PVP foi estocada na temperatura de 4ºC, até o momento do uso quando foi equilibrada na temperatura ambiente. Uma pipeta Eppendorf (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) equipada com ponteira estéril (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) não pirogênica, livre de DNA, RNAse e ATP, deposita um gota de 5 μl de GAMETA-100 no centro da placa de cultura, e quatro gotas ao redor. As gotas devem ser cobertas imediatamente com óleo mineral pré-equilibrado para evitar evaporação. Antes de iniciar o procedimento de ICSI a gota central foi removida, e substituída por PVP no volume de 5 μl. Em seguida, adiciona-se uma pequena gota de esperma (1 μl) no centro da gota de PVP. O espermatozóide foi sugado na periferia da gota de PVP.
Para a execução da ICSI, usa-se o aumento de 200x. A micropipeta de ICSI deve ser posicionada na periferia da solução de PVP, e um espermatozóide morfologicamente normal foi imobilizado por passagens sucessivas na micropipeta e capturado por sucção para o procedimento.
A micropipeta contendo o espermatozóide foi removida desta gota, e transferida para a gota que contem o oócito. O oócito deve ser delicadamente sugado com a micropipeta de fixação. O primeiro corpúsculo polar foi posicionado na posição de 6, e a micropipeta com o espermatozóide, foi introduzida horizontalmente na posição de 3 horas dentro do ooplasma. Uma gentil sucção foi aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema, e para evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide (não na invaginação do oolema).
O espermatozóide imobilizado foi inserido junto com o ooplasma sugado, com um mínimo de volume possível de PVP. A pipeta de ICSI deve ser delicadamente removida, e o oócito liberado. Os oócitos injetados devem ser lavados em IVF-50, e transferidos para o novo IVF-50 suplementado com soro inativado da paciente a 10%.
Os oócitos são observados após 16 a 18 horas do procedimento, para verificar a presença, ou não, de pronúcleos, sendo o processo de fertilização normal definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido do aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização. Um máximo de 4 embriões são transferidos após 48 horas de cultura, sendo os excedentes criopreservados.
Resultados
A coleta de espermatozóides do epidídimo foi realizada em 28 ciclos, sendo 25 ciclos por punção aspirativa e 3 ciclos com abordagem cirúrgica. Uma concentração de espermatozóides suficiente para execução da ICSI foi obtida em todos os casos.
Por outro lado, um total de 248 oócitos foram coletados sendo 207 oócitos em metáfase II (83.4% dos oócitos coletados). O número de oócitos colhidos por paciente foi de μ = 8.86±5.7, sendo o de oócitos em metáfase II de μ = 7.39±5.0. A taxa de fertilização normal foi de 63.8±28 e o número de embriões transferidos de 2.93± 1.1. Falha total de fertilização ocorreu em dois ciclos (7% dos ciclos). A taxa de gravidez por punção foi de 42.8% e a de gravidez por transferência de 46%. Observou-se um total de 7 gestações únicas e 5 gestações múltiplas (quatro gemelares e uma trigemelar).
Além disso, 13 pacientes congelaram amostras de esperma para futuros procedimentos.
Discussão
Nosso grupo realizou um total de 25 ciclos com a coleta de espermatozóides do epidídimo por PESA, e 3 ciclos por MESA (logo no início do programa de ICSI).
Silber et al. (1995) referiram um total de 16 consecutivos ciclos de MESA obtendo uma taxa de fertilização de 45%.
Tsirigotis et al. (1994) descreveram os primeiros resultados com a técnica de PESA, onde conseguiram colher por punção um número suficiente de espermatozóides para a aplicação posterior da ICSI. Em seguida, diversos trabalhos do mesmo grupo demonstraram a eficiência deste método na solução de casos de azoospermia obstrutiva (Craft & Shrivastav, 1994; Shrivastav e et al., 1994; Tsirigotis et al., 1995; Craft et al., 1995). O mérito destes trabalhos foi a comprovação de que técnicas menos invasivos na coleta dos espermatozóides do epidídimo funcionaram com a mesma eficácia do que a abordagem cirúrgica.
Nosso trabalho demonstrou que a taxa de fertilização dos oócitos (63.8%) com espermatozóides do epidídimo não é diferente da habitualmente conseguida em nosso grupo com espermatozóides do ejaculado (Franco Jr et al., 1995 a,b, 1996). Tsirigotis et al. (1996) obtiveram fertilização normal em 52.6% dos oócitos de um total de 59 ciclos, que envolveram 54 pacientes com azoospermia obstrutiva e onde os espermatozóides foram coletados por meio de punção aspirativa do epidídimo com agulha. Entretanto, Silber et al. (1995) num total de 72 casos relataram taxas baixas de fertilização dos oócitos (46%) quando empregaram espermatozóides colhidos do epidídimo através de abordagem microcirúrgica (MESA) versus as observadas habitualmente no programa de ICSI do mesmo grupo.
A elevada taxa de gravidez clínica por punção de 42.8% pode em parte ser explicada pela baixa faixa etária das pacientes. Por outro lado, deve-se cuidar para evitar a alta incidência de gestações múltiplas como a obtida em nosso serviço (41.6%).
Finalmente, a coleta de espermatozóides através de punção aspirativa do epidídimo seguida da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) firmou-se como uma abordagem importante para a correção da infertilidade masculina por azoospermia obstrutiva com espermatogênese conservada.
Referências
Craft I., Shrivastav P. - Treatment of male infertility. Lancet., 344: 191-192, 1994.