JBRA Assist. Reprod. 1997;01(01):20-23
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.1.05
Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira - Ribeirão Preto - SP
Resumo
Introdução: A obtenção de espermatozóides do testículo seguido da técnica de injeção intracito plasmática de espermatozóides (ICSI) seria a conduta ideal no caso de azoospermia não obstrutiva, ou de azoospermia obstrutiva porém com falha na coleta do gameta do epidídimo. A finalidade deste trabalho é analisar o resultado do programa de ICSI nessas duas situações.
Material e Métodos: Um total de 29 pacientes foram submetidos ao processo de coleta de espermatozóides no testículo. A azoospermia não obstrutiva foi a principal indicação (55.2%), seguida da azoospermia obstrutiva (37.9) originada pela vasectomia ou falha na sua correção. Em dois casos, diagnosticou-se criptozoospermia (6.8%). A idade média da população masculina foi de 38.3 ± 9.4 anos e a feminina de 32.6 ± 5.48 anos. A estimulação ovariana foi realizada com bloqueio ovariano de 2ª fase com acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) seguido de FSH puro (Metrodin-HP, Serono). A biópsia testicular foi efetuada em 26 coletas, e a punção aspirativa em 3 coletas com agulha de 21G a 23G.
Resultados: Um total de 29 coletas de espermatozóides do testículo e subsequente ICSI foi realizado, obtendo-se 8.1 ± 5.6 óvulos por paciente sendo 6.62 ± 4.3 óvulos em metáfase II. A taxa de fertilização normal foi de 47 ± 30%, e o número de embriões transferidos 2.68 ± 1.52 por paciente. Os espermatozóides foram obtidos em 22 coletas (75.8%), e ausente em 7 (24.1%). Houve falha total de fertilização em 2 ciclos (6.8%). A taxa de implantação foi de 13.5%, a taxa de gravidez por punção de 20.6%, e a por transferência embrionária de 30%. Observou-se um total de 4 gestações únicas e 2 gestações múltiplas.
Conclusão: Os dados atestam a aplicabilidade da técnica de ICSI com espermatozóides obtidos do testículo.
Unitermos: azoospermia, biópsia testicular, injeção intracito plasmática de espermatozóides, ICSI
Abstract
Introduction: Obtaining sperms from the testicles for use in the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique would be the ideal conduct in cases of nonobstructive azoospermia in which the gamete cannot be collected from the epididymis. The objective of the present paper was to analyze the results of an ICSI program in these two situations.
Material and Methods: A total of 29 patients were submitted to sperm collection from the testicles. Nonobstructive azoospermia was the major indication (55.2%), followed by obstructive azoospermia (37.9%) caused by vasectomy or by failure to correct it. Cryptozoospermia was detected in two cases (6.8%). Mean age of the male population was 38.3 ± 9.4 years and mean age of the female population was 32.6 ± 5.48 years. Ovarian stimulation was performed by 2nd phase ovarian blockade with leuprolide acetate followed by pure FSH (Metrodin-HP, Serono). A testicular biopsy was performed in 26 collections and aspirative puncture with a 21 G to 23 G needle in 3 collections.
Results: A total of 29 sperm collections from the testicle and subsequent ICSI were carried out and 8.1 ± 5.6 eggs were obtained per patient, 6.62 ± 4.3 of them being in metaphase II The normal fertilization rate was 47 ± 30% and the number of transferred embryos was 2.68 ±1.52 per patient. The sperms were obtained in 22 collections (75.8%) and were absent in 7 (24.1%). There was total fertilization failure in 2 cycles (6.8%). The implantation rate was 13.5%, the pregnancy rate per puncture was 20.6% and the pregnancy rate per embryo transfer was 30%. A total of 4 singleton pregnancies and 2 multiple pregnancies were observed.
Conclusion: The data demonstrate the applicability of the ICSI technique using sperms obtained from the testicles.
Keywords: azoospermia, testicular biopsy, intracytoplasmic sperm injection, ICSI
Introdução
Em 1992, surgiram os primeiros resultados de sucesso da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) no tratamento da oligoastenoteratozoospermia (Palermo et al., 1992).
Em agosto de 1993, a escola belga iniciou o uso da ICSI na solução de casos de azoospermia em pacientes com insuficiência testicular. Em 1994, Devroey et al. publicaram os primeiros resultados de fertilização de oócitos com espermatozóides colhidos do testículo.
Em 1995a, Silber et al. afirmaram que os resultados de gestação após a ICSI são independente da etiologia da obstrução (agenesia congênita do deferente ou falha na reversão da vasectomia) e do local de coleta dos espermatozóides (epidídimo ou testículo) porém dependentes da idade da paciente.
No Brasil, Franco Jr. et al. (1995a, 1995b) analisaram o uso da ICSI no tratamento da infertilidade masculina grave. Nessa ocasião, realizou-se a técnica de ICSI em cinco pacientes com azoospermia após a retirada de espermatozóides do testículo, obtendo-se três gestações. Essas foram as primeiras no Brasil, e provavelmente na América-Latina, obtidas com espermatozóides coletados do testículo.
A finalidade deste trabalho foi avaliar os problemas atuais do programa de ICSI com espermatozóides obtidos do testículo.
Material e Métodos
O programa de ICSI com espermatozóides coletado do testículo teve início em nossa unidade no segundo semestre de 1994. Desde essa época, um total de 29 pacientes foram submetidos ao processo de coleta de espermatozóides do testículo.
A azoospermia não obstrutiva foi a principal indicação (55.2%) em 16 casos (parada da maturação espermática, síndrome das células de Sertoli sómente ou hipoespermatogênese). A azoospermia obstrutiva originada pela vasectomia ou falha na sua correção, infecção, agenesia congênita do deferente foi observada em 11 casos (37.9%). Em dois casos, identificou-se uma criptozoospermia (6.8%).
A idade média da população masculina foi de 38.3 ± 9.4, e a feminina de 32.6 ± 5.48. O esquema de estimulação ovariana foi o de bloqueio da 2ª fase com acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) seguido FSH puro (Metrodin-HP, Serono). O controle do desenvolvimento folicular foi executado apenas por ultra-sonografia vaginal, sendo realizada a administração de gonadotrofina coriônica humana (Profasi-HP), quando se observou um mínimo de 3 folículos com 17mm de diâmetro maior. Após a punção folicular por ultra-som vaginal, o líquido folicular foi depositado em placas de cultura (Corning, New York). Em seguida, os oócitos foram identificados, e com o auxílio de pipetas Pasteur transferidos para placas de cultura de Nunc (Roskilde, Denmark), contendo o meio de cultura IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Sweden). Posteriormente, o complexo cumulus-corona foi removido pela exposição em hialuronidase (80 UI/ml - Sigma Chemical Co., USA) diluída no meio GAMETA-100 (Scandinavian IVF Science AB, Sweden). O tempo de exposição na hialuronidase foi variável, sendo os oócitos completamente desnudados através de sucessivas passagens em pipeta Pasteur estirada. O procedimento de desnudação foi executado em placas de Nunc. Os oócitos desnudados foram incubados no meio IVF-50 até o momento da ICSI. Apenas os oócitos com o primeiro corpúsculo polar (metáfase II) foram injetados.
As amostras de material testicular foram coletadas por biópsia em 26 ciclos, ou através de agulha de 21G a 23G em 3 ciclos. Em seguida, depositadas em placas de cultura (Corning, New York) mantidas na temperatura de 37°C. O material foi analisado em microscópio de contraste de fase com dissecção do tecido com agulhas.
A separação dos espermatozóides do fluido seminal foi realizada através de gradientes descontínuos de Percoll com 1.5ml das frações de 40% e 90% de Percoll. Após centrifugação em 200 G por 20 minutos, a camada de 90%, e o sedimento, são transferidos para um novo tubo e ressuspensos em IVF-50. Após nova centrifugação em 200 G por 10 minutos, o sobrenadante é desprezado, e 1 ml de IVF-50 foi adicionado ao sedimento. Nessa ocasião, a amostra de esperma foi analisada, e estocada em cultura com CO2 a 5% até o momento do uso para ICSI.
A ICSI foi realizada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com um sistema de lentes Hoffman, e acoplado com um micromanipulador automático MM-88. Os discos de cultura permaneceram na temperatura de 37°C, com o auxílio de uma placa de aquecimento (Swemed Lab, Västra Frölunda, Sweden).
O controle da micropipeta (diâmetro interno de 4.8 μm a 5.6 μm, e externo, de 6.8 μm a 7.6 μm, com angulação de 30°) de transporte e injeção do espermatozóide foi realizado por micromanipulador hidráulico MO 202 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Uma micropipeta (diâmetro interno de 18 μm a 25 μm, e externo 80 μm a 150 μm, com angulação de 30°) foi usada para fixação do oócito sendo guiada para essa função por um manipulador MN-155 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Os microinjetores usados foram do tipo IM6B (Narishige Co, Tokyo, Japan).
O óleo mineral (Sigma Chemical Co, USA) foi lavado por duas vezes com água ultrapurificada (Sistema Milli-Q UF, Millipore CO, São Paulo, Brasil) e incubado com 10ml do meio de cultura Menezo B2 por uma noite, numa atmosfera com CO2 a 5% e temperatura de 37°C.
Em seguida, utiliza-se uma solução a 10% de polivinilpirrolidina (PVP, Scandinavian IVF Science AB, Sweden) para a imobilização dos espermatozóides. A solução viscosa de PVP foi produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas. A solução de PVP foi estocada na temperatura de 4°C, até o momento do uso quando foi equilibrada na temperatura ambiente. Uma pipeta Eppendorf (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) equipada com ponteira estéril (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) não pirogênica, livre de DNA, RNAse e ATP, deposita um gota de 5μl de GAMETA-100 no centro da placa de cultura, e quatro gotas ao redor. As gotas devem ser cobertas imediatamente com óleo mineral pré-equilibrado para evitar evaporação. Antes de iniciar o procedimento de ICSI a gota central foi removida, e substituída por PVP no volume de 5μl. Em seguida, adiciona-se uma pequena gota de esperma (1μl) no centro da gota de PVP. O espermatozóide foi sugado na periferia da gota de PVP.
Para a execução da ICSI, usa-se o aumento de 200x. A micropipeta de ICSI deve ser posicionada na periferia da solução de PVP, e um espermatozóide morfologicamente normal foi imobilizado por passagens sucessivas na micropipeta e capturado por sucção para o procedimento.
A micropipeta contendo o espermatozóide foi removida desta gota, e transferida para a gota que contem o oócito. O oócito deve ser delicadamente sugado com a micropipeta de fixação. O primeiro corpúsculo polar foi colocado na posição de 6 horas, e a micropipeta com o espermatozóide, foi introduzida horizontalmente na posição de 3 horas dentro do ooplasma. Uma gentil sucção foi aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema, e evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide (não na invaginação do oolema).
O espermatozóide imobilizado foi inserido junto com o ooplasma sugado, com um mínimo de volume possível de PVP. A pipeta de ICSI deve ser delicadamente removida, e o oócito liberado. Os oócitos injetados devem ser lavados em IVF-50, e transferidos para o novo IVF-50 suplementado com soro inativado da paciente a 10%.
Os oócitos são observados após 16 a 18 horas do procedimento, para verificar a presença, ou não, de pronúcleos, sendo o processo de fertilização normal definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido do aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização. Um máximo de 4 embriões são transferidos após 48 horas de cultura, sendo os excedentes criopreservados.
Resultados
Um total de 29 coletas de espermatozóides do testículo e subsequente ICSI foi realizado. O número de oócitos colhidos por paciente foi de μ = 8.10±5.6, sendo o de oócitos em metáfase II de μ = 6.62±4.3. A taxa de fertilização normal foi de 47± 30%, e o número de embriões transferidos de 2.68±1.52. Os espermatozóides foram obtidos em 22 coletas testiculares (75.8%), e ausentes em 7 casos (24.1%). A falha total de fertilização ocorreu em 2 ciclos. A taxa de implantação foi de 13.5%. A taxa de gravidez por punção foi de 20.6%, sendo a de gravidez por transferência embrionária de 30%. Observouse um total de 4 gestações únicas e 2 gestações múltiplas (dois gemelares).
Discussão
Em 1994, vários autores confirmaram a possibilidade de espermatozóides do testículo fertilizarem o oócito humano através da técnica de ICSI e algumas gestações clínicas foram descritas (Devroey et al., 1994, Schoysman et al., 1994).
Em 1995, Devroey et al. relataram gestações após a execução da ICSI com retirada de espermatozóides do testículo em casos de azoospermias não obstrutivas. Um total de 15 casos foram realizados, obtendo-se espermatozóides em 13 pacientes (86% dos casos), 182 oócitos em metáfase II foram injetados obtendo-se uma taxa de fertilização normal de 47.8%. Uma taxa de gestação clínica de 25% por transferência e uma taxa de implantação de 18%.
Kahraman et al. (1996) realizaram biópsia testicular para coleta de espermatozóides em 16 casos de azoospermia obstrutiva, e 16 casos de azoospermia nãoobstrutiva. As taxas de fertilização na azoospermia obstrutiva foi de 33.9%, e na azoospermia não obstrutiva de 65.3%, sendo as taxas de gravidez de clínica na azoospermia obstrutiva de 43.7% e na azoospermia não obstrutiva de 33.3%. Além disso, taxas de implantação elevadas foram obtidas tanto na azoospermia obstrutiva (30%) quanto na azoospermia não obstrutiva (26%).
Silber et al. (1995b) mostraram após 12 biópsias de testículo (nesses casos não foram obtidos espermatozóides do epidídimo) e subsequente ICSI, uma taxa de fertilização oócitária normal de 46% e uma taxa de gestação de 43%.
Tournaye et al. (1996) descreveram uma série de 124 pacientes que coletaram espermatozóides do testículo e realizaram a ICSI. Todos os pacientes com diagnóstico anatomopatológico prévio de espermatogênese normal ou hipoespermatogênese apresentaram espermatozóides na preparação a fresco. O índice de recuperação dos espermatozóides foi de 84%, nos casos de parada de maturação e aplasia incompleta das células germinativas. A taxa de fertilização normal foi de 57.8%. A taxa de implantação foi de 20.3%. A proporção de gravidez por procedimento foi de 39.5%.
No Brasil, Franco Jr et al. (1995a, 1995b, 1996) analisaram o uso da ICSI no tratamento da infertilidade masculina grave. Um total de 51 ciclos foram realizados sendo naquela ocasião, a taxa média de fertilização foi de 53.6%. O índice de gestação por punção foi de 31.3% e por transferência de 34.7%. A taxa de implantação nessa população foi de 16.1%. Entretanto, em cinco casos, onde os espermatozóides foram retirados do testículo, obtevese após a ICSI uma taxa de fertilização dos oócitos de 45%, sendo a taxa de gestação clínica por punção de 60% (três gestações) e a taxa de implantação de 40%.
Os dados desta série sugerem que a taxa de fertilização normal dos oócitos é inferior a obtida com espermatozóides do ejaculado, pelo menos em nossa unidade. Tal fato, já foi descrito por Nagy et al. (1995).
A taxa de implantação embrionária não diferiu das séries anteriores de ICSI com espermatozóides do ejaculado.
Contudo, a ausência do gameta maculino na biópsia testicular em aproximadamente 24% dos casos, alterou os resultados finais de gravidez. Esse fato foi significativo, nos casos de azoospermia não obstrutiva do tipo parada completa da espermatogênese, e na síndrome de Sertoli sómente.
Na mesma linha de pensamento, Kahraman et al. (1996) numa série 16 casos de azoospermia não obstrutiva observaram falha total de fertilização em 25% dos casos (3 casos de um total de 6 pacientes com parada da maturação espermática; 1 caso de um total de 2 pacientes com síndrome de Sertoli somente).
Em conclusão, os dados desse trabalho mostraram a viabilidade da aplicação da ICSI com espermatozóides obtidos do testículo. A fonte testicular firmou-se como local final da procura do gameta masculino em caso de falha na abordagem do epidídimo. Entretanto, algumas dificuldades ficam evidentes nos casos de azoospermia não obstrutiva (ausência de espermatozóides ou falha da fertilização), especialmente com parada completa da maturação testicular e na síndrome de Sertoli somente. Tesarik et al. (1995) relataram o nascimento de crianças sadias pela aplicação da ICSI com espermátides, procedimento de solucionaria o problema da falta de espermatozóides. Entretanto, a maioria dos grupos, ainda permanece resistente ao seu emprego, desde que não há estudos em animais, que identifiquem esse procedimento de reprodução assistida, como de baixo risco para problemas genéticos.