JBRA Assist. Reprod. 1997;01(01):28-31
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.1.07
Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira, Ribeirão Preto, Brasil
Resumo
Introdução: A finalidade deste trabalho foi avaliar a performance de mulheres acima de 40 anos submetidas com seus esposos a um programa de ICSI e comparar seus dados com outras faixas etárias.
Material e Métodos: Um total de 330 pacientes cujos maridos apresentaram o fator masculino alterado foram submetidas ao programa de ICSI e agrupadas em diferentes faixas etárias (Grupo I: ≤29 anos, Grupo II: 30-34 anos, Grupo III: 35-39 anos e Grupo IV: ≥40 anos).
Resultados: O número de oócito coletados, a taxa de fertilização e o número de embriões transferidos foi similar entre os quatro grupos. A taxa de implantação (TI) no grupo I foi de 20.5%, no grupo II de 15.3, no grupo III de 13.4 e no grupo IV de 8.3. Não houve diferença significativa entre a taxa de implantação nos grupos I e II (p > 0.08). Entretanto, ocorreu uma diferença significativa da TI entre o I e III (p = 0.03) e o I e IV (p < 0.01). A taxa de gestação por transferência (TGT) no grupo I foi de 38.8%, no grupo II de 30%, no grupo III de 32.4% e no grupo IV de 26.3%. A TGT não foi significativamente diferente entre os quatro grupos. Finalmente, a taxa de parto por punção no grupo I foi de 35.7%, no grupo II de 25.4%, no grupo III de 28.7% e no grupo IV de 17.8%.
Conclusão: Houve um declínio nas taxas de implantação embrionária, fato que se inicia aos 35 anos, acentuando-se após os 40 anos.
Unitermos: idade, quarenta anos, taxa de implantação, ICSI
Abstract
Introduction: The objective of the present study was to evaluate the performance of women over 40 submitted to an ICSI program with their husbands and to compare their data with those obtained for other age ranges.
Material and Methods: A total of 330 patients whose husbands presented an altered male factor were submitted to the ICSI program and divided into different age ranges (Group I: ≤ 29 years, Group II: 30-34 years, Group III: 35-39 years, and Group IV: ≥ 40 years).
Results: The number of oocytes collected, the fertilization rate and the number of embryos transferred were similar for the four groups. The implantation rate (IR) was 20.5% in group I, 15.3 in group II, 13.4 in group III, and 8.3 in group IV. No significant difference in implantation rate was observed between group I and group 11 (p>0.08). However, a significant difference in IR occurred between group I and group III (p = 0.03) and between group I and group IV (p< 0.01). The pregnancy rate per transfer (PRT) was 38.8% in group I, 30% in group II, 32.4% in group III, and 26.3% in group IV. PRT did not differ significantly between groups. Finally, the rate of delivery per puncture was 35. 7% in group I, 25.4% in group 11, 28. 7% in group 111 and 17.8% in group IV.
Conclusion: There was a decline in embryo implantation rate starting at 35 years, which became more marked after 40 years.
Keywords: age, forty years, implantation rate, ICSI
Introdução
Comumente, nos programas de reprodução assistida a idade da paciente é aceita como um fator prognóstico na taxa de gestações. A queda nos resultados, nas pacientes acima dos 40 anos, ocorreria pelos seguintes fatores: redução nas taxas de implantação, aumento nos índices de aborto espontâneo, resposta baixa ao processo de estimulação ovariana, e uma diminuição da qualidade dos oócitos coletados (Franco Jr. et als., 1993).
Em 1990, Piette e cols. estudaram a influência da idade da mulher em 5590 ciclos de FIV, observando para a paciente abaixo de 25 anos uma taxa de gestação por procedimento de 19.8% versus uma de 9% para as pacientes com idade ≥ 40 anos. Além disso, referiram uma produção significativamente aumentada de oócitos (p < 0.01) entre as mulheres com idade ≤ 25 anos (média de oócitos = 4.3 ± 2.8) comparadas com aquelas de idade ≥ 40 anos (média de oócitos = 3.3 ± 2.1), assim como uma redução nos índices de implantação, fato que era independente do número de embriões transferidos. Em 1991, o sistema de registro das clínicas de FIV na França (FIVNAT, 1991) analisou 67000 ciclos de FIV e 5000 gestações, observando que a taxa de gestação diminuía após os 37 anos, ocorrendo gestações a termo em apenas 3% dos ciclos de FIV após 41 anos.
O objetivo deste estudo foi avaliar a performance das pacientes acima dos 40 anos num programa de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) e comparala com as demais faixas etárias.
Material e Métodos
Durante os anos de 1995 e 1996, um total de 330 pacientes cujos maridos apresentaram o fator masculino alterado foram submetidas ao programa de ICSI e agrupadas em diferentes faixas etárias (Grupo I: ≤ 29 anos, Grupo II: 30-34 anos, Grupo III: 35-39 anos e Grupo IV: ≥ 40 anos).
O esquema de estimulação ovariana preferencial utilizado foi o de bloqueio da 2ª fase com acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) seguido FSH puro (Metrodin-HP, Serono). O controle do desenvolvimento folicular foi executado apenas por ultra-sonografia vaginal, sendo realizada a administração da gonadotrofina coriônica humana, quando se observou um mínimo de 3 folículos com 17mm. Após a punção folicular por ultra-som vaginal, o líquido folicular foi depositado em placas de cultura (Corning, New York). Em seguida, os oócitos foram identificados, e com o auxílio de pipetas Pasteur transferidos para placas de cultura de Nunc (Roskilde, Denmark), contendo o meio de cultura IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Gõteborg, Sweden).
Posteriormente, o complexo cumulus-corona foi removido pela exposição em hialuronidase (80 UI/ml -Sigma Chemical Co., St Louis, USA) diluída no meio GAMETA-100 (Scandinavian IVF Science AB, Gõteborg, Sweden). O tempo de exposição na hialuronidase foi variável, sendo os oócitos completamente desnudados através de sucessivas passagens em pipeta Pasteur estiradas. O procedimento de desnudação foi executado em placas de Nunc. Os oócitos desnudados foram incubados no meio IVF-50 até o momento da ICSI. Apenas os oócitos com o primeiro corpúsculo polar (metáfase II) foram injetados.
As amostras de esperma foram coletadas por masturbação, aspiração cirúrgica do epidídimo, ou por masceração do tecido de biópsia testicular. Em seguida, depositadas em placas de cultura (Corning, New York) mantidas na temperatura de 37°C. Após a liquefação, os materiais foram analisadas em microscópio de contraste de fase, sendo a contagem dos espermatozóides executada na câmara de Makler (Sefi-Medical Instruments, Haifa, Israel). O critério de normalidade da amostra de esperma foi o estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS).
A separação dos espermatozóides do fluido seminal foi realizada através de gradientes descontínuos de Percoll (osmolaridade entre 280-290 mOsm/KgH2O) preparados em tubos cônicos de 15ml (Corning, New York) com 1.5ml das frações de 40% e 90% de Percoll (diluições preparadas com meio IVF-50). Após centrifugação em 200 G por 20 minutos, a camada de 90%, e o sedimento, são transferidos para um novo tubo e ressuspensos em 10 ml de IVF-50. Após nova centrifugação em 200 G por 10 minutos, o sobrenadante é desprezado, e 1 ml de IVF-50 é adicionado ao sedimento. Nessa ocasião, a amostra de esperma é analisada, e estocada em cultura com CO2 a 5% até o momento do uso para ICSI.
A ICSI foi realizada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com um sistema de lentes Hoffman, e acoplado com um micromanipulador automático MM-88. Os discos de cultura permaneceram na temperatura de 37°C, com o auxílio de uma placa de aquecimento (Swemed Lab, Västra Frölunda, Sweden). O controle da micropipeta (diâmetro interno de 4.8 μm a 5.6 μm, e externo, de 6.8 μm a 7.6 μm, com angulação de 30°) de transporte e injeção do espermatozóide foi realizado por micromanipulador hidráulico MO 202 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Uma micropipeta (diâmetro interno de 18 μm a 25 μm, e externo 80 μm a 150 μm, com angulação de 30°) foi usada para fixação do oócito sendo guiada para essa função por um manipulador MN-155 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Os microinjetores usados foram do tipo IM6B (Narishige Co, Tokyo, Japan).
O óleo mineral (Sigma Chemical Co, St Louis, USA) usado para evitar alterações importantes do pH no sistema foi lavado por duas vezes com água ultrapurificada (Sistema Milli-Q UF, Millipore CO, São Paulo, Brasil) e incubado com 10ml do meio de cultura Menezo B2 por uma noite, numa atmosfera com CO2 a 5% e temperatura de 37°C (tempo de conservação máximo: 7 dias).
Em seguida, utiliza-se uma solução de polivinilpirrolidina (PVP, Scandinavian IVF Science AB, Gõteborg, Sweden) (concentração de 10%, diluída em IVF-50) para a imobilização dos espermatozóides. A solução viscosa de PVP é produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas. A solução de PVP foi estocada na temperatura de 4°C, até o momento do uso quando foi equilibrada na temperatura ambiente. Uma pipeta Eppendorf (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) equipada com ponteira estéril (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) não pirogênica, livre de DNA, RNAse e ATP, deposita um gota de 5μl de GAMETA-100 no centro da placa de cultura, e quatro gotas ao redor. As gotas devem ser cobertas imediatamente com óleo mineral pré-equilibrado para evitar evaporação. Antes de iniciar o procedimento de ICSI a gota central é removida, e substituída por PVP no volume de 5μl. Em seguida, adiciona-se uma pequena gota de esperma (1 μl) no centro da gota de PVP. O espermatozóide é sugado na periferia da gota de PVP.
Para a execução da ICSI, usa-se o aumento de 200x. A micropipeta de ICSI deve ser posicionada na periferia da solução de PVP, e um espermatozóide morfologicamente normal é imobilizado por passagens sucessivas na micropipeta e capturado por sucção para o procedimento. Alguns preconizam a quebra da cauda dos espermatozóides, antes da sua injeção no ooplasma (Gerris et al.., 1995; Vanderzwalmen et al., 1996).
A micropipeta contendo o espermatozóide é removida desta gota, e transferida para a gota que contem o oócito. O oócito deve ser delicadamente sugado com a micropipeta de fixação. O primeiro corpúsculo polar é posicionado na posição de 6 horas, e a micropipeta com o espermatozóide, introduzida horizontalmente na posição de 3 horas dentro do ooplasma. Uma gentil sucção é aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema, e evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide (não na invaginação do oolema).
O espermatozóide imobilizado é inserido junto com o ooplasma sugado, com um mínimo de volume possível de PVP. A pipeta de ICSI deve ser delicadamente removida, e o oócito liberado. Os oócitos injetados devem ser lavados em IVF-50, e transferidos para o novo IVF-50 suplementado com soro inativado da paciente a 10%.
Os oócitos são observados após 16 a 18 horas do procedimento, para verificar a presença, ou não, de pronúcleos. O processo de fertilização normal é definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido do aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização. Um máximo de 4 embriões são transferidos após 48 horas de cultura, sendo os excedentes criopreservados.
Resultados
A média de oócitos por punção (OP) no grupo I foi de 8.61 ± 4.8, no grupo II de 7.40 ± 4.3, no grupo III de 6.74 ± 4.2 e no grupo IV de 4.68 ± 3.3. A média de OP foi maior no grupo I em relação aos grupos II, III, IV (p < 0.05). Não houve diferença significativa entre a média de OP nos grupos II e III (p = 0.38). Entretanto, no grupo III a média OP foi significativamente maior (p = 0.02) que o IV.
A taxa média de fertilização normal (FN) no grupo I foi de 62.64% ± 29.7% no grupo II de 60.93% ± 25.6%, no grupo III de 67% ± 26.5% e no grupo IV de 55.2% ± 38.3%. Não houve diferenças significativa entre as taxas de FN nos diversos grupos (p > 0.05).
A média de embriões transferidos (ET) no grupo I foi de 3.18±1.1, no grupo II de 3.29±1.3, no grupo III de 3.35±1.8 e no grupo IV de 3.79±1.7. Não houve diferença significativa entre a média de ET nos quatro grupos etários (p > 0.05).
A taxa de implantação (TI) no grupo I foi de 20.5%, no grupo II de 15.3, no grupo III de 13.4 e no grupo IV de 8.3. Não houve diferença significativa entre a taxa de implantação nos grupos I e II (p > 0.08). Entretanto, ocorreu uma diferença significativa da TI entre o I e III (p = 0.03) eoIe IV(p< 0.01).
A taxa de gestação por transferência (TGT) no grupo I foi de 38.8%, no grupo II de 30%, no grupo III de 32.4% e no grupo IV de 26.3%. A TGT não foi significativamente diferente entre os quatro grupos. A taxa de gravidez por punção (GP) no grupo I foi de 36.8%, no grupo II de 27.6%, no grupo III de 31.5% e no grupo IV 17.8%. Não houve diferença significativa quanto a taxa de GP entre os quatro grupos, contudo a avaliação estatística entre os grupos I e IV apresentou um p = 0.06 (borderline).
Finalmente, a taxa de parto por punção no grupo I foi de 35.7%, no grupo II de 25.4%, no grupo III de 28.7% e no grupo IV de 17.8%.
Discussão
A preocupação em correlacionar os resultados do programa de ICSI com a idade tem despertado interesse de outros grupos, Abdelmassih et al. (1996) demonstraram que apesar da idade não afetar a taxa de fertilização houve uma redução significativa das taxas de gestação e da implantação em mulheres acima dos 35 anos de idade.
Oehninger et al. (1995), demonstraram que a idade foi o fator determinante nos resultados do ICSI, neste estudo as taxas de implantação embrionária nos grupos etários de ≤ 34 anos, de 35 a 39 anos e ≥ 40 anos foi respectivamente de: 21.2%, 7.2% e de 1.4%, sendo estas diferenças estatisticamente significantes (p=0.003).
Tucker et al. (1995) destacam que a idade materna é um dos fatores mais importante no prognóstico de gestação num programa de ICSI.
Por outro lado, Navot et al. (1991) surgeriram que os embriões resultantes de oócitos de mulheres com idade mais avançada teriam uma menor capacidade de implantação.
No presente estudo não foi observado uma diferença significativa entre os números de oócitos coletados, taxa de fertilização e número de embriões transferidos entre as diversas faixas etárias. Entretanto, ocorreu uma diferença significativa da taxa de implantação entre as pacientes com ≤ 29 anos e aquelas entre 35 e 39 anos (p = 0.03) e ≥ 40 anos (p < 0.01). Por outro lado, a taxa de parto/punção também apresenta uma tendência a queda com o aumento da faixa etária (no grupo I de 35.7%, no grupo II de 25.4%, no grupo III de 28.7% e no grupo IV de 17.8%) apesar desta diferença não ser significante do ponto de vista estatístico, o que poderia ser explicado pelo número de casos apresentados até o momento.
Em conclusão, a indicação da ICSI como correção da infertilidade masculina não deve ser postergada, desde que há um declínio nas taxas de implantação embrionária, fato que se inicia após os 35 anos de idade da mulher.
FIVNAT - Age des femmes et fecondation “in vitro”. Contracept. Fertil. Sex., 19: 567-569, 1991.