JBRA Assist. Reprod. 1997;01(02):62-64
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.2.04
As características e desenvolvimento de oócitos imaturos no procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)
The characteristics and outcome of imature oocytes in intracytoplasmic sperm injection (ICSI) procedure
Fertility - Centro de Fertilização Assistida Vídeo Endoscopia Pélvica - São Paulo - SP
Resumo
Introdução: Durante a superovulação ovariana, uma “corte” de oócitos é recrutada, sendo determinado seu estágio de maturidade, imediatamente antes da microinjeção. Pouco se sabe a respeito da viabilidade dos oócitos imaturos, de seu potencial de fecundação e de sua importância nos resultados da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Nosso objetivo foi estudar, nos procedimentos de ICSI, a freqüência de oócitos imaturos humanos, a probabilidade de maturação e de fertilização “in vitro”. Analisou-se prospectivamente o número de oócitos em prófase (PI), metáfase I (MI) e metáfase II (MII), estabelecendo correlações entre as taxas de maturação e fertilização “in vitro” e o impacto sobre os resultados de gravidez.
Material e Métodos: No período de nove meses, analisamos 100 ciclos de ICSI, nos quais foram injetados espermatozóides ejaculados. Após retirada da zona pelúcida por acão da hialuronidase, os oócitos foram classificados e os imaturos cultivados em meio HTF com 15% de soro da paciente. A checagem dos oócitos foi feita aproximadamente a cada 4 horas, até 24 horas da aspiração, sendo micromanipulados aqueles que extrusaram o 1º corpúsculo polar. Taxas de fertilização e clivagem foram determinadas nos dias +1 e + 2 da aspiração, respectivamente.
Resultados: Classificamos 1339 oócitos, sendo 1120 MII (83,6%). Oócitos imaturos foram encontrados em 60 casos, sendo 121 PI (9,1%) e 98 MI (7,3 %). As taxas de fertilização e clivagem para os oócitos MII foram de 67,4% e 86,5%, respectivamente. As taxas de maturação, fertilização e clivagem dos oócitos MI foram 71,4%, 52,5% e 62,4%, respectivamente [estatisticamente diferentes (p<0,05) daquelas obtidas para os PI (46,3%, 31,1% e 42,8%, respectivamente)]. Não houve diferença no protocolo de estímulo ou níveis de estradiol, quando comparados pacientes que tiveram oócitos imaturos com aqueles que somente apresentaram oócitos MII.
Conclusões: Oócitos imaturos foram encontrados em 60% dos casos, sem nenhuma correlação com qualquer parâmetro clínico das pacientes. Quanto maior o grau de imaturidade, menor a probabilidade de fecundação e divisão. Em princípio, é possível a fertilização de oócitos imaturos, ocorrendo ganho adicional no número final de embriões. Se tais embriões “carregam” risco maior de alterações genéticas, isto ainda precisa ainda ser determinado.
Unitermos: maturação oocitária, ICSI, índices de fertilização e clivagem
Abstract
Introduction: During the ovarian stimulation, a oocyte cohort is captured, and its maturity stage was determined right before the microinjection. Very little is known about the immature oocytes viability, its fecundation potential and its importance on ICSI results.
Our objective was to study the frequency of human immature oocytes and the probability of maturation and fertilization in vitro, under ICSI procedures.
A prospective analysis was carried, where the oocytes number in prophase (PI), metaphase I (MI) andmetaphase II (MII) were studied, in order to establish correlation among the in vitro maturation percentage, comparative MII fertilization and percentage and the impact on number of embryos to transfer.
Materials and Methods: During a nine months period, one hundred ICSI cycles were analyzed in which ejaculated sperm was injected. The oocytes were classified after being treated with hyaluronidase and the immature ones were cultivated in HTF media with 15% patient’s serum. Observations were carried on every 4 hours interval, during the first 24 hours from aspiration, with micromanipulation of those which extruded the first polar body. Fertilization and cleavage rates were checked on days: +1 and +2, respectively.
Results: We classified 1339 oocytes and found 1120 MII (83.6%). In 60 cases we had immature oocytes, as follows: 121 PI (9.1%) and 98 MI (7.3%). The fertilization and cleavage rate for the MII oocytes were 67.4% and 86.5% respectively. The maturation, fertilization and cleavage rate for MI oocytes were 71.4%, 52.5% and 62.4% respectively and, statistically different (p<0.05) from the PI oocytes (46.3%, 31.1% and 42.8% respectively). At day +2, we had 45 embryos derived from immature oocytes. We found no difference on the stimulation protocol or the estradiol levels, in the comparison between patients that had immature oocytes and those that had only shown MII oocytes.
Conclusions: Immature oocytes were found in 60% of the cases, showing no correlation with any clinical parameter of the patients. The higher the immaturity grade, the lower the probability of fecundation and division. In principle, the immature oocytes fertilization is possible, as an additional gain in the final embryos number. It is still to be determined if those embryos carry a higher risk of genetic alterations.
Keywords: oocyte maturation, ICSI, fertilization and cleavage rate
Introdução
A maturação do oócito é processo que envolve sua habilidade em completar a meiose, poder ser fertilizado e preparar o desenvolvimento embrionário “in vivo”. O processo de maturação acompanha o desenvolvimento folicular, ambos dependentes de FSH, LHe estradiol. Alguns eventos são observados, tanto no cultivo “in vitro”, como a maturação nuclear, espelhada na “quebra” da vesícula germinativa e na formação do corpúsculo polar (Sakkas et al., 1994).
Os cromossomos do oócito permanecem em fase de diplóteno até o pico de LH, onde é reassumida a meiose, passando rapidamente pelas fases de diacinese, metáfase I, anáfase I, telófase I e metáfase II com a ovulação (Wu, 1995; Hinduja et al., 1996).
Na avaliação laboratorial, os oócitos são usualmente classificados de acordo com a presença ou ausência da vesícula germinativa e dos corpúsculos polares: profase I (PI) - vesícula germinativa presente; metáfase I (MI) -vesícula germinativa e primeiro corpúsculo polar ausentes; metáfase II (MII) - vesícula germinativa ausente e primeiro corpúsculo polar presente.
Durante a estimulação ovariana, uma corte de oócitos é recrutada. Na injeção intracitoplasmática de espennatozóides (ICSI), a maturidade oocitária é determinada imediatamente antes da microinjeção. Pouco se sabe a respeito da viabilidade dos oócitos imaturos, do seu potencial de fecundação e de sua importância nos resultados de ICSI. Nosso objetivo foi estudar a frequência de oócitos imaturos humanos, a probabilidade de maturação e de fertilização “in vitro” nos procedimentos de ICSI.
Material e Métodos
No período de março a dezembro de 1995, foram estudados 100 casos de ICSI, nos quais foram injetados espennatozóides presentes no ejaculado. Todas as pacientes foram bloqueadas com o GnRH agonista (GnRH-a, acetato de leuprolide, Lupron, Abbott), por pelo menos 14 dias. Para estimular o crescimento folicular, as pacientes receberam o FSH puro (Metrodin HP, Serono) ou o FSH puro associado ao hMG (Pergonal, Serono). Gonadotrofina coriônica humana (Profasi HP, Serono) foi administrada quando pelo menos dois folículos tinham diâmetro médio ≥ 18 mm.
A punção folicular foi realizada por ultra-sonografia transvaginal, sendo os complexos “cumulus-corona” submetidos à retirada da zona pelúcida pela hialuronidase (tipo VIII, Sigma), 80 U/ml, por no máximo 1 minuto. Os oócitos em MII passaram por período de pré-incubação que variou entre de 2 a 6 horas, antes da micromanipulação. Os oócitos imaturos foram cultivados em meio HTF (Human Tubular Fluid - Irvine, 9962), acrescidos de 15% do soro da paciente, e observados a cada 4 horas, durante as primeiras 24 horas da aspiração. Um único espermatozóide foi injetado no ooplasma, segundo técnica já descrita (Van Steirteghen et al., 1993 a,b), sendo micromanipulados aqueles oócitos que extrusaram o primeiro corpúsculo polar no período de 12 a 20 horas após a coleta (agora classificados como oócitos MII).
Os oócitos foram checados quanto a presença dos dois pronúcleos (2PN) (D+1 =Dia +1), sendo feita transferência intra-uterina de no máximo quatro embriões com 2 a 8 células, 24 horas mais tarde (D+2 = Dia + 2).
As análises estatísticas foram feitas pelo teste ‘t’ de Student, sendo considerados valores estatisticamente significativos para as amostras com p < 0,05.
Resultados
Foram coletados 1339 oócitos, sendo 1120 MII (83,6%). Oócitos imaturos foram encontrados em 60 casos, sendo que 121 oócitos se encontravam em PI (9,1%) e 98 em MI (7,3%). Quando considerados somente esses 60 casos, o número total de oócitos foi de 862, com os imaturos (MI+PI) representando 25,4% (219/862) do total.
O número de MII intactos após a injeção, comparados com os MII intactos derivados de oócitos imaturos (MII D+1), não mostrou diferença significativa (sobrevivência média de 93%).
As taxas de fertilização e clivagem para os oócitos MII foram de 67,4% e 86,5%, respectivamente. As taxas de maturação, fertilização e clivagem dos oócitos MI foram 71,4%, 52,5% e 62,4%, respectivamente, estatisticamente diferentes daquelas obtidas para os PI (46,3%, 31,1% e 42,8%, respectivamente). Então, quando comparados o comportamento dos oócitos maduros e imaturos cultivados “in vitro”, verificou-se que as probabilidades de fertilização e clivagem foram menores, quanto mais imaturo fosse o oócito. O mesmo aconteceu na capacidade de maturação “in vitro”, onde os MI apresentaram melhor desempenho que os PI (Figura I). Não houve diferença no protocolo de indução ovulatória, níveis de estradiol (E2) ou gestação, quando comparadas pacientes que tiveram oócitos imaturos com aquelas que apresentaram somente oócitos MII (Tabela I).
Figura I: Distribuição percentual da maturação, fertilização e clivagem embrionária de acordo com a maturidade oocitária.*
Tabela I. Protocolo de indução ovulatória, níveis de estradiol e gestações de acordo com a maturidade oocitária.
Discussão
O processo de maturação oocitária “in vitro”, como é geralmente descrito em roedores e primatas, é a progressão do estágio de diplóteno da meiose (estágio de vesícula germinativa - PI), passando por duas divisões meióticas, com parada na segunda redução meiótica (MII) até a fertilização (Barnes et al., 1996).
Uma maneira de inferir a qualidade oocitária antes da punção é o acompanhamento do crescimento folicular associado aos níveis de estradiol sérico. Mesmo com os oócitos imaturos, sua probabilidade de atingir a fase de blastocisto (bom prognóstico para implantação e gravidez), é maior quanto mais desenvolvido estiver o folículo aspirado (Tsuji. et al., 1985).
Oócitos obtidos por punção folicular não são homogêneos no grau de maturidade ou na capacidade de ativação. Sabe-se, contudo, que os eventos moleculares e citológicos da maturação, “in vivo” ou “in vitro”, são semelhantes. A maturação oocitária “in vivo” é dependente de gonadotropinas. A estimulação hormonal com FSH e LH induz a maturação e a ativação de receptores dos oócitos dentro dos folículos ovarianos (Hinduja et al., 1996).
As condições laboratoriais necessárias para a maturação “in vitro” ainda não são totalmente conhecidas. Os cultivos, condições laboratoriais com meios de cultivos especiais, sem dúvida alguma vieram melhorar a obtenção e o selecionamento de embriões com maior probabilidade de implantação (Menezzo et al., 1990, 1992).
Nesse estudo, procurou-se estabelecer o comportamento dos oócitos imaturos, cultivados em condições laboratoriais idênticas àquelas empregadas no procedimento padrão de ICSI, isto é, com os mesmos meios de cultivo.
Em principio, a fertilização de oócitos imaturos é possível, proporcionando ganho adicional ao número final de embriões. Deveremos ainda determinar se estes embriões carregam risco maior de alterações genéticas e seu verdadeiro poder de implantação.
Em conclusão, oócitos imaturos foram encontrados em 60% dos casos, perfazendo 16,4% de todos os oócitos recuperados e sem nenhuma correlação com os parâmetros clínicos das pacientes e com as taxas de gravidez. Por outro lado, quanto maior o grau de imaturidade oocitária, menor será a probabilidade de fecundação e clivagem.