JBRA Assist. Reprod. 1997;01(02):71-74
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.2.07
Método ultra-rápido efetivo para criopreservação de embrião humano
Effective ultrarapid method for human embryo cryopreservation
Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira - Ribeirão Preto - S.P
Resumo
introdução: O congelamento ultra-rápido é técnica simples e de baixo custo utilizada para a criopreservação de embriões humanos. Este estudo demonstra nossa experiência com esta técnica e o sucesso obtido após sua modificação.
Material e Métodos: Cerca de 60 pacientes que obtiveram embriões excedentes após os procedimentos de fertilização “in vitro “ e/ou inseminação intracitoplasmática de espermatozóides foram divididas em dois grupos para o congelamento dos embriões. No grupo I, 33 pacientes congelaram e descongelaram 145 embriões com a técnica de congelamento ultra-rápido e descongelamento em um único “step”. Após o descongelamento, os embriões ficaram em cultura por 1 hora. Os embriões que apresentaram blastômero intacto foram transferidos. No grupo II, 36 pacientes congelaram e descongelaram 205 embriões com a técnica de congelamento ultra-rápido e descongelamento em 3 “steps”. Após o descongelamento, os embriões ficaram em cultura por 24 horas. Apenas os embriões que continuaram a clivagem foram transferidos.
Resultados: A idade média das pacientes foi de 31,71 ±4,13 no Grupo I e 31,42±4,29 no Grupo II. Não houve diferença significativa (p=0.64). A média de embriões transferidos (ET) no grupo I foi de 3,09±1,63 e no grupo II de 3,23±1,27. Não houve diferença significativa entre o número de embriões transferidos (p=0.46). A taxa de gravidez por transferência embrionária foi significativamente maior no Grupo II (p=0,022), em relação ao Grupo I (31,8% versus 6%).
Conclusão: A técnica de congelamento ultra-rápido modificada com três “steps” de sucrose, assim como o critério de seleção dos embriões para transferência são condutas efetivas para o programa de criopreservação de embriões humanos.
Unitermos: criopreservação, congelamento ultra-rápido, embrião humano
Abstract
Introduction: The ultrarapid method is a simple and low cost technique to human embryos cryopreservation. This paper shows our experience using this technique and the success after ultra rapid modified method.
Material and Methods: A total of 60 patients whose had exceeding embryos after “in vitro fertilization” (IVF) and/or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were divided in two groups to freeze embryos. Group I: 33 patient s frozen and thawed 145 embryos with ultrarapid method and only one step thawing method. After thawed, the embryos were cultured for 1 hour and embryos with at least one intact blastomere were transferred. Group II: 36 patients frozen and thawed 205 embryos with ultrarapid method and three steps thawing method. After thawed, the embryos were cultured for 24 hours and embryos which following development were transferred.
Results: The age of patients was 31.71±4.13 in Group 1 and 31.42±4.29 in Group II. did not differ significantly (0.64). The mean of embryos transferred was 3.09±1.63 in Group I and 3.23±1.27 in Group II. It did not differ significantly between the number of embryos transferred (p=0.46). The pregnancy rate per transfer was significantly higher in Group II (p=0.022) compared to Group I. 31.8% versus 6%. respectively.
Conclusion: Ultrarapid modified method, as well as selection rule to transfer embryos are proceeding effective for human cryopreservation program.
Keywords: cryopreservation, ultrarapid freezing, human embryo
Introdução
A criopreservação de embriões humanos tem mostrado considerável evolução desde o primeiro sucesso relatado por Trounson e Mohr (1983), quando os autores congelaram embriões de 3 a 8 células com dimetil-sulfóxido (DMSO). Posteriormente, métodos de criopreservação foram desenvolvidos para o congelamento de zigotos usando o propanodiol (PROH) como crioprotetor (Lassalle et al., 1985), ou para o congelamento de blastocisto com glicerol (Cohen et al., 1986). Entretanto, a maioria destas técnicas de criopreservação envolvem congelamento lento, que requer uso de equipamentos caros.
Trounson et al. (1987) descreveram o método de congelamento ultra-rápido em camundongos, que requer apenas rápida exposição dos embriões (2 a 2,5 minutos) em alta concentração de crioprotetor DMSO (3 a 4M) e 0,25M de sucrose, seguida pela imersão em nitrogênio líquido e descongelamento rápido em solução de 0,25M de sucrose, em banho-maria à 37ºC.
O método ultra-rápido de congelamento de embriões é simples e barato. Entretanto, seus resultados atingiram no máximo taxa de gestação por transferência embrionária de 10% (Barg et al., 1990).
Por outro lado, elevadas concentrações de DMSO poderiam ser tóxicas para os embriões humanos, tornando a retirada do crioprotetor fator fundamental para o sucesso deste método. Dessa forma, a técnica original descrita por Trounson et al. (1987), foi modificada, utilizando-se, no processo de descongelamento, a retirada gradativa do crioprotetor com três soluções de sucrose.
A finalidade deste estudo foi comparar a eficiência da criopreservação e descongelamento de embriões com o protocolo original versus o novo protocolo que introduziu o descongelamento com três passagens dos embriões em concentrações de sucrose gradativamente menores.
Materiais e Métodos
O total de 60 pacientes que obtiveram embriões excedentes, após os procedimentos de fertilização “in vitro” convencional e/ou injeção intracitoplasmática de espermatozóides, foi dividido em dois grupos e seus embriões submetidos ao processo de congelamento ultra-rápido.
No Grupo I (protocolo original), 33 pacientes, com idade média de 31,71 ± 4,13, congelou-se 150 embriões. O método de congelamento ultra-rápido utilizado foi aquele com DMSO 3,0M e sucrose 0,25M (Trounson et al., 1987). Inicialmente, foram preparadas duas soluções: I - solução de cultura (SC), composta de meio de cultura IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), com 20% de soro inativado da paciente; II - solução de DMSO, constituída de 3 935 ml de SC e DMSO (14 079M), no volume de 1.065 ml. Em seguida, preparou-se solução de congelamento (SCo) onde a concentração de sucrose (0,4278g) foi adicionada ao volume final de 5,0ml de solução de DMSO. A SCo possui DMSO 3,0M e sucrose 0,25M, sendo filtrada através de membrana com 0,22 um, gaseificada com mistura N2 90%, CO2 5% e O2 5%, e mantida à temperatura de 4ºC por período mínimo de 24 e máximo de 72 horas.
No procedimento de congelamento, os embriões são transferidos da SC à temperatura de 37ºC para a SCo em temperatura ambiente, introduzidos em “paillettes” identificadas, que são seladas numa extremidade por algodão embebido pela SCo. Os embriões ficam em contato com a SCo na temperatura ambiente por período de 2,5 minutos, sendo em seguida mergulhados em recipientes contendo nitrogênio líquido (N2L) à temperatura de -196ºC.
No procedimento de descongelamento, prepara-se solução de descongelamento (SD) com 0,4278g de sucrose a qual é diluída com SC para volume final de 5,0 ml, no dia do descongelamento. A SD possui 0,25M de sucrose, é filtrada através de membrana com 0,22 um, gaseificada com mistura N2 90%, CO2 5% e O2 5% e mantida em temperatura ambiente.
As “paillettes” contendo os embriões congelados são retiradas do N2L, mergulhadas em banho-maria à 37ºC, por seis segundos; depois de enxutas, corta-se uma de suas extremidade, e colocam-se os embriões na SD pelo período de dez minutos em temperatura ambiente. Os embriões sobreviventes são transferidos para SC à temperatura de 37ºC e mantidos em atmosfera de CO2 5% por período mínimo de 60 minutos, após este período os embriões que apresentam no mínimo 01 blastômero intacto são transferidos para as paciente.
No grupo II (protocolo novo), um total de 36 pacientes com idade média de 31,4 ± 4,29 congelaram 225 embriões. O procedimento de congelamento foi igual ao do grupo I, porém no procedimento de descongelamento foram feitas algumas modificações. A SD (0,25M de sucrose) foi diluída em três diferentes concentrações: SD1 constituída de SD na proporção de 2 (SD): 1 (SC) (solução final de sucrose de 0,166M); SD2 constituída de SD na proporção de 1 (DS): 1 (SC) (solução final de sucrose de 0,125M) e SD3 constituída de SD na proporção de 1 (DS): 2 (SC) (solução final de sucrose de 0,083M).
Assim sendo, as “paillettes” contendo embriões congelados são retiradas do N2L, deixadas por vinte segundos em temperatura ambiente, mergulhadas em banho-maria à 30ºC por 30 segundos, e após serem enxutas, os embriões são transferidos para as 3 etapas de diluições de sucrose (SD1, SD2 e SD3) consecutivamente por período de dez minutos em cada solução à temperatura ambiente. Após este período os embriões são colocados em SC à temperatura ambiente por 5 minutos, e em seguida, em microgotas de SC cobertas por óleo à temperatura de 37ºC, e mantidos em atmosfera de CO2 5%, por período mínimo de 24hr. Após este período, os embriões são analisados quanto ao desenvolvimento embrionário, apenas os embriões que apresentaram nova clivagem embrionária foram transferidos para a paciente.
No processo de transferência de embriões descongelados foram utilizados dois esquemas: ciclo natural e ciclo substitutivo. No ciclo natural, o controle do desenvolvimento folicular é realizado por ultra-sonografia vaginal seriada a partir do 11º dia do ciclo. A dose de 5 000 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) é administrada quando o folículo apresenta diâmetro de cerca de 18mm, sendo o descongelamento realizado no 4º dia após a hCG (injeção do hCG = dia nº 1). Sempre a transferência foi executada no 5º dia após a hCG. No ciclo substitutivo, administra-se do 1º ao 13º dia do ciclo, valerianato de estradiol (VE), na dose diária de 4 a 6 mg. A progesterona é introduzida no 14º dia, via intramuscular, na dose de 50 mg/dia, desde que a espessura endometrial seja superior a 6mm. O descongelamento é realizado após 4 dias do uso de progesterona e a transferência no 5º dia de progesterona.
Resultados
Na Tabela I, estão dispostos os dados comparativos entre os dois protocolos de criopreservação ultra-rápida de embriões. A idade média das pacientes no Grupo I (31,71 ± 4,13) não foi significativamente diferente da do Grupo II de 31,4 ± 4,29. No Grupo I, a média de embriões congelados (4,55 ± 2,71) não foi significativamente diferente (0,13) do Grupo II (6,25 ± 4,51). No Grupo I, a média de embriões descongelados (4,39 ± 2,40) não foi significativamente diferente (p=0,25) do Grupo II (5,50 ± 3,53). A sobrevida dos embriões após o descongelamento foi de 75,79% para o Grupo I e de 37,17% para o Grupo II (critérios de sobrevida diferentes).
Tabela I. Comparação dos resultados obtidos com dois protocolos de congelamento ultra-rápido de embriões.
A média de embriões transferidos (ET) no Grupo I foi de 3,09 ± 1,63 e no Grupo II de 3,23 ± 1,27: não houve diferença significativa entre o número de embriões transferidos (p=0,46). No Grupo I, todas as pacientes receberam pelo menos um embrião após o descongelamento, enquanto no Grupo II, 61% das pacientes receberam no mínimo 01 embrião.
A taxa de gravidez por transferência foi significamente maior (p=0,022) no Grupo II (31,8%), em comparação com o Grupo I (6,0%). O mesmo aconteceu com as taxas de implantação que foram de 2,0% no Grupo I, e 12,7% no Grupo II (p=0,008). Essas diferenças podem ser explicadas, em parte, pelos critérios diferentes de seleção dos embriões em condições de serem transferidos em ambos os grupos.
Por outro lado, apesar da taxa de gravidez no Grupo II (19,4%) ser maior que a do Grupo I (6,0%), esses valores ainda não são significativamente diferentes. As taxas de aborto foram 50% no Grupo I e 16% no Grupo II: não houve diferença significativa (p=0,41).
Discussão
Do ponto de vista experimental, diversos trabalhos em animais estudam a aplicabilidade e segurança da criopreservação ultra-rápida de embriões. Assim, Trouson et al. (1987) relataram pela primeira vez idêntico sucesso com um método ultra-rápido de congelamento de embriões de camundongo, quando comparado com técnicas convencionais de congelamento lento de embriões.
Em 1988, Bongso et al. realizaram análises cromossômicas de embriões de camundongo com duas células criopreservados através de método lento e ultra-rápido, usando dois diferentes tipos de agentes crioprotetores (PROH e DMSO). Três métodos foram realizados: lento com PROH, ultra-rápido com DMSO e ultra-rápido com PRHO. A análise cromossômica, realizada em embriões de 1 e 2 células, mostrou incidência de aneuploidia e poliploidia nos embriões congelados-descongelados pelos três métodos, não sendo significativamente diferente do controle constituído por embriões não congelados.
Aigner et al. (1992) afirmaram que o congelamento ultra-rápido com 3,5M de DMSO foi mais eficiente em preservar o fuso meiótico de oócitos de camundongo, quando comparado com o processo lento de criopreservação, com 1,5M de DMSO.
Kang et al. (1994) afirmaram que blastômeros isolados de duas células de camundongos, quando criopreservados por método ultra-rápido, apresentaram nível de desenvolvimento idêntico ao controle, após o descongelamento. Entretanto, Liu et al. (1993) referem melhores resultados com o congelamento de embriões de camundongo através de métodos lentos de criopreservação, usando os crioprotetores PROH ou DMSO, quando comparado com o uso de método ultra-rápido com DMSO.
Noto et al. (1993) referem que não é alterada a distribuição do padrão mitocondrial após a criopreservação ultra-rápida de embriões humanos entre 2 e 4 células.
Do ponto vista clínico, ainda são poucas as unidades que utilizam o método ultra-rápido no processo de congelamento de embriões humanos excedentes.
Em 1988, Trounson et al. descreveram pela primeira vez que onze de doze embriões humanos com 3 a 8 blastômeros, que sobreviveram ao processo de congelamento e descongelamento com método ultra-rápido, usando breve exposição ao dimetil sulfóxido (DMSO), na concentração de 2 a 3,5M e 0,25M de sucrose. Entretanto, nenhuma gestação foi obtida.
Em 1990, Gordts et al. descreveram o resultado da criopreservação ultra-rápida de embriões humanos no estágio de pronúcleo, obtendo, após o processo de descongelamento, 94% de características morfológicas normais e 79% de clivagem. Total de 34 embriões descongelados e clivados foi transferidos para 20 pacientes durante ciclos espontâneos, obtendo-se 4 gestações (taxa de gravidez de 20%).
Em 1991, Feichtinger et al. relataram sua experiência com método ultra-rápido de congelamento. Total de 181 embriões foi congelado e descongelado, obtendo-se taxa de sobrevida de 61% (110 embriões), com 50-100% de blastômeros intactos. A taxa de gravidez foi de 9,8%, ocorrendo um caso de aborto e um caso de prenhez ectópica. Além disso, afirmaram que seus resultados foram similares aos obtidos em sua unidade com método de congelamento lento usando propanodiol.
Em 1996, Lai et al. referem sua experiência com o método ultra-rápido de congelamento de embriões humanos. Total de 63 embriões foi descongelado, dos quais 83% (52 embriões) sobreviveram com pelo menos um blastômero intacto. Assim, 19 transferências foram realizadas com média de embriões transferidos de 2,7, obtendo-se duas gestações de termo (taxa de gestação de 10,5%). Um aborto ocorreu com oito semanas de gestação.
Em 1994, Franco Jr et al. descreveram a primeira gravidez por criopreservação ultra-rápida de embriões em nosso meio. Entretanto, nessa primeira fase, os resultados com o método ultra-rápido ainda eram desanimadores (Grupo I). Recentemente, a retirada do crioprotetor em 3 etapas, com concentrações gradativamente menores de sucrose, foi introduzida no método ultra-rápido (Grupo II). Há evidências experimentais de que a retirada gradativa do crioprotetor pode melhorar a “performance” do método de congelamento ultra-rápido. Em 1992, Vasuthevan et al. não observaram diferenças significativas em relação às taxas de implantação e formação fetal, quando embriões de camundongo tiveram o crioprotetor removido, em procedimento de uma etapa, versus a retirada em duas etapas. Entretanto, os blastocistos formados após a retirada em uma etapa apresentaram baixa contagem de células internas, quando comparados com aqueles obtidos com duas etapas.
Os dados preliminares deste trabalho (taxa de implantação embrionária de 12,7%; taxa de gravidez por paciente submetida ao processo de descongelamento de 19,4%) sinalizam para possível aumento da eficácia do método de criopreservação ultra-rápido de embriões com a retirada lenta do crioprotetor em 3 etapas de concentrações decrescentes de sucrose.