JBRA Assist. Reprod. 1997;01(03):100-104
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.3.03
Análise da taxa de implantação embrionária em fertilização “in vitro” e injeção intracitoplasmática de espermatozóides: correlação com a faixa etária e qualidade embrionária
Analysis of the embryo implantation rate in “in vitro” fertilization and intracitoplasmic sperm injection: correlation with the age range and embryo quality
Unidade de Reprodução Humana do Hospital Israelita Albert Einstein
Resumo
Introdução: O desenvolvimento das técnicas de reprodução assistida tem possibilitado a obtenção de gestações em pacientes com várias causas de infertilidade, entretanto, a idade das pacientes e a qualidade dos embriões transferidos continuam sendo as maiores limitações. A introdução da injeção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI) poderia proporcionar melhor implantação embrionária pela manipulação da zona pelúcida.
Material e Métodos: Foram avaliadas, retrospectivamente, as taxas de implantação embrionária (TI) de 54 pacientes submetidas à fertilização “in vitro” (FIV) e de 59 pacientes submetidas à ICSI. Em cada grupo, foram analisadas as TI das pacientes com menos de 30 anos, entre 30 e 35 anos e com mais de 35 anos. Também foram avaliadas as TI das pacientes que receberam pelo menos 1 embrião classe I ou II e das pacientes que receberam apenas embriões classe III, IV ou V.
Resultados: A análise estatística não mostrou diferença significativa entre as TI das mulheres submetidas à FIV ou à ICSI (11,6×9,0), ou ainda, entre as diferentes faixas etárias avaliadas (FIV: 17,2 × 13,1 × 4,1 e ICSI: 12,5 × 9,7 × 7,8). Em ambos os grupos, também não houve variação significativa entre as mulheres que receberam pelo menos um embrião classe 1 ou II (FIV: 14,1 × 10,5). Entretanto, não houve implantação em nenhuma das pacientes que receberam apenas embriões com classe III, IV ou V.
Conclusões: A TI foi semelhante entre as técnicas de FIV e ICSI; a idade das pacientes não influenciou a TI entre as técnicas de FIV e ICSI e a transferência de pelo menos um embrião de classe I ou II foi fundamental para a obtenção de gestação nas técnicas de FIV e ICSI.
Unitermos: fertilização “in vitro”, injeção intracitoplasmática de espermatozóides, taxa implantação embrionária
Abstract
Introduction: The development of assisted reproduction techniques has improved the treatment of infertile couples. However, the age of the women and embryo quality have been the limitations for better results. Intracitoplasmic sperm injection could improve embryo implantation because of zona pellucida manipulation.
Material and Methods: Embryo implantation rate (TI) of 54 patients submitted to IVF and 59 patients submitted to ICSI were retrospectively studied. In each group were reviewed the TI of patients younger than 30, between 30 and 35, and older than 35; also were evaluated the TI of patients to whom were transfered at least 1 grade I or II embryo and those who received only garde III, IV or V embryos.
Results: Statistical analysis did not show significant differences neither between TI of both groups (IVF-I1.6 × ICSI-9.0) nor the differents age groups (IVF: 17.2 × 13.1 × 4.1 e ICSI: 12.5 × 9.7 × 7.8). Also there were no significant variations between the groups when at least 1 grade I or II embryos were transfered. However, there no implantation’s when only grade III, IV or V embryos were transfered.
Conclusion: TI was similar between FIV and ICSI; age of the patient did not influence TI in both groups and transfer of at least one morphological good embryo was important for pregnancy in FIV and ICSI.
Keywords: “in vitro” fertilization, intracitoplasmic sperm injection, embryo implantation rates
Introdução
O tratamento da infertilidade conjugal sofreu grandes modificações nos últimos anos, tendo como grande marca a década de 70, quando as técnicas de reprodução assistida tiveram seu desenvolvimento desencadeado (Ng et al., 1990). Lanzendorf et al. (1988) descreveram, pela primeira vez, a fertilização obtida pela injeção de espermatozóide dentro do citoplasma do oócito. Van Steirteghem et al. (1993) publicaram as primeiras gestações em humanos obtidas por esta técnica que recebeu o nome de Injeção Intracitoplasmática de espermatozóide (intracytoplasmatic sperm injection - ICSI). A partir de então, a técnica de ICSI tem possibilitado tratar a infertilidade de casais onde o homem possui número reduzido de espermatozóides (Palermo et al., 1992). Embora o avanço tecnológico tenha ampliado os limites do tratamento da infertilidade conjugal, ainda assim não resolveu todos os problemas neste campo.
A diminuição da taxa de fecundidade (oportunidade mensal da concepção) aumenta com o avanço da idade (Stovall et al., 1991; Van Noord-Zaadstra et al., 1991). Este declínio é maior entre os 35 e 40 anos e as taxas de fertilização e implantação são quase nulas a partir dos 45 anos (Menken et al., 1986). Este fenômeno ocorre mesmo na presença de ciclos ovulatórios aparentemente normais, decorrendo da diminuição da receptividade uterina (Paulson et al., 1990) ou da deterioração do oócito conseqüente ao envelhecimento (Ducot et al., 1988).
Causas específicas de infertilidade podem afetar a qualidade dos embriões, influenciando diretamente sua capacidade de implantação (Roseboom et al., 1995). Nos casos de infertilidade masculina, a taxa de fertilização é menor que nos casos onde a causa é feminina (Hull, 1995).
Também tem sido demonstrado que, em casos de espermograma alterado, observa-se diminuição da taxa de formação de blastocistos (Janny & Menezo, 1995).
Mesmo nos procedimentos de fertilização “in vitro” (FIV) e ICSI, em que se obtêm índices de fertilização bastante elevados, por vezes próximos a 100% (Calderon et al., 1995), as taxas de gestação permanecem ao redor de 25% a 30%. Esta diferença decorre da falha de implantação da maioria dos embriões que são transferidos para a paciente.
Alguns fatores já conhecidos influenciam a implantação uterina dos embriões. Paulson et al. (1990) demonstraram que a qualidade dos embriões transferidos é diretamente proporcional à taxa de implantação.
Um dos fenômenos importantes para a implantação do embrião no endométrio é a ruptura da zona pelúcida, chamada de “hatching” (Schoolcraft et al., 1995). Como na ICSI, ocorre uma perfuração da zona pelúcida para a introdução do espermatozóide, supõe-se que esta poderia agir favoravelmente no momento da implantação, criando uma zona fraca que facilitaria o fenômeno do “hatching”. Este fato poderia explicar os índices de gestação maiores em ICSI do que em FIV, reportado por alguns (Ng et al., 1990).
Este estudo tem por finalidade comparar as taxas de implantação embrionária nos casos de FIV e ICSI, avaliando ainda o impacto da idade das mulheres e da qualidade embrionária sobre estas taxas.
Material e Métodos
Foram analisados 112 casais submetidos às técnicas de FIV ou ICSI, entre janeiro e agosto de 1996, na Unidade de Reprodução Humana do Hospital Israelita Albert Einstein. As pacientes submetidas à técnica de FIV, tinham como idade mínima 25 anos e máxima 44 anos, tendo como média, 33,4 anos. Por outro lado, as pacientes submetidas à técnica de ICSI, tinham como idade mini ma 21 anos e máxima 44 anos, tendo como média, 33,6 anos.
Os casais submetidos à técnica de FIV (grupo I: 54 pacientes) apresentaram as seguintes indicações: fator tubário, esterilidade sem causa aparente, endometriose e falhas de outros tratamentos. Os casais submetidos à técnica de ICSI (grupo II: 59 pacientes) apresentaram as seguintes indicações: fator masculino severo, falhas de fertilização ou de implantação com FIV anterior. Além disso, cada grupo foi subdividido em três subgrupos, de acordo com a faixa etária das pacientes (grupo A: mulheres com menos de 30 anos; grupo B: mulheres entre 30 e 35 anos; grupo C: mulheres com mais de 35 anos). Em cada subgrupo, foram estudados dois outros subgrupos: Grupo Is (pacientes que receberam pelo menos um embrião classe I ou II) e Grupo 2s (pacientes que só receberam embrião classe III, IV ou V).
O protocolo de estimulação ovariana foi o mesmo para todas as pacientes. Iniciou-se com a administração de análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas (acetato de leuprolide), na dose de 0,2 ml subcutâneo por dia, no período entre o 18º e 24º dia do ciclo menstrual anterior. O bloqueio hipofisário foi confirmado com a dosagem de estradiol sérico ≤30 ng/ml, realizado após 10 ou 15 dias. Nesse momento, diminuiu-se a dose de acetato de leuprolide para 0,1 ml subcutâneo por dia. Nessa ocasião, iniciou-se a administração diária, por via intramuscular, de gonadotrofina menopausal humana (hMG), na dose de 300 UI. Quando o maior folículo observado por ultra-sonografia intravaginal atingiu de 18 a 20 mm no seu diâmetro máximo, administrou-se, por via intramuscular, gonadotrofina coriônica humana (hCG), em dose única de 10,000 UI. A aspiração folicular foi realizada entre 34 e 36 horas após esta injeção. Os oócitos eram identificados e avaliados sob aumento de 80x em lupa (SMZU- Nikon, Japão) e sua maturidade estabelecida segundo os critérios de Veek (1991). Para a incubação inicial dos oócitos e sua posterior inseminação, foi utilizado o meio de cultura GPM (Serono-Madri, Espanha), enriquecido com 10% de substituto de soro sintético (SSS Irvine Scientific 99193 - Califórnia) e incubados por no mínimo, 4 horas, em ambiente equilibrado, com 5% de CO2 a 37°C e 90% de umidade.
Concomitantemente, o sêmen foi colhido por masturbação, em recipiente estéril, após abstinência sexual de no mínimo 2 dias e no máximo 5 dias. A amostra seminal era capacitada através da técnica de centrifugação em duas colunas com gradiente descontínuo de Percoll (Pharmacia, Suíça) de 45% e 90%.
Após 3 a 5 horas da aspiração folicular, realizava-se a inseminação dos oócitos com uma concentração espermática de 100.000 espermatozóides móveis por mililitro de meio de cultura, por oócito. Entre 16 e 20 horas após a inseminação, fazia-se a desnudação dos oócitos e a verificação dos sinais de fertilização.
Após 48 horas da inseminação, era feita a observação da taxa de clivagem e a classificação morfológica, fazendo-se a transferência embrionária para o útero. Neste momento, os embriões excedentes foram criopreservados. A classificação embrionária foi realizada utilizando os critérios de Veek (1991), quanto à morfologia e simetria das células ou blastômeros, variando da classe I a V, sendo a classe I a melhor. O número de embriões transferidos variou de 3 a 4 por paciente. Os embriões eram transferidos em cateter de Frydman (CCD, França). As pacientes receberam progesterona oleosa por via intramuscular na dose de 50mg, diariamente, para a suplementação da fase lútea.
Entre 10 a 14 dias, após a transferência, realizava-se dosagem sérica de β-hCG para o diagnóstico da gravidez e, após 5 semanas, a ultra-sonografia intravaginal para confirmar a presença de saco gestacional.
A estimulação ovariana e a aspiração folicular no programa de ICSI foram idênticas àquelas descritas para a técnica de FIV. Após a identificação, os oócitos eram lavados em hialuronidase (Sigma, H-3757, USA) para retirada do “cumulus oophorus” e para verificação do grau de maturidade oocitária. A coleta e o preparo de sêmen foram os mesmos descritos para a técnica de FIV, tendo como diferença uma centrifugação final a 1800g por 5 minutos.
Após esta etapa, o espermatozóide foi injetado no citoplasma do oócito, com o auxílio de micropipetas (COOK K-MPIP-1035 e K-HPIP-1035, Austrália). Os passos seguintes foram idênticos ao descrito para o programa de FIV.
A taxa de implantação embrionária é expressa pela relação entre o número de sacos gestacionais identificados pela ultra-sonografia intravaginal e o número de pré-embriões transferidos.
O teste do qui-quadrado foi utilizado para comparar as taxas de implantação nos diversos grupos adotando-se o nível de significância de 5%.
Resultados
Nas 54 pacientes (grupo I) submetidas ao procedimento de FIV, foi identificado um total de 490 oócitos, sendo que 375 oócitos estavam maduros (76,5%), 101 oócitos estavam imaturos (20,6%) e 11 oócitos estavam degenerados (2,2%). Foram inseminados os oócitos maduros, resultando em 287 oócitos fertilizados (taxa de fertilização = 76,5%). Obtiveram-se 267 embriões, dos quais 173 foram transferidos, criopreservando-se os embriões restantes. Nove mulheres apresentaram dosagem de β-hCG positiva e identificaram-se 20 sacos gestacionais pela ultra-sonografia intravaginal. A taxa de implantação do programa de FIV foi de 11,6% (Tabela I).
Tabela I. Grupo I - Dados das pacientes submetidas ao programa de fertilização “in vitro”
Nas 59 pacientes (Grupo II) submetidas ao procedimento de ICSI, foi identificado o total de 652 oócitos, sendo que 442 oócitos estavam em metáfase II (67,8%), 86 oócitos estavam em metáfase I (13,1%), 76 oócitos em prófase (11,6%) e 12 degeneraram (1,8%). Injetaram-se somente oócitos classificados em metáfase II, resultando em 326 oócitos fertilizados e mais 29 oócitos, que degeneraram. Foram obtidos 312 pré-embriões (95,7%), dos quais 220 (78,5%) foram transferidos, criopreservandose o restante. Quinze mulheres apresentaram dosagem de li-hCG positivo e identificaram-se 20 sacos gestacionais pela ultra-sonografia intravaginal, com 4 abortos (Tabela II). A taxa de implantação do programa de ICSI foi de 9,0%.
Tabela II. Grupo II - Dados das pacientes submetidas ao programa de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
Finalmente, a taxa de implantação embrionária no programa de FIV (11,6%) não foi significativamente diferente (p>0,05) daquela do programa de ICSI (9,0%) (Tabela II).
Onze pacientes com menos de 30 anos receberam 47 embriões resultantes de FIV e foram observados 8 sacos gestacionais pela ultra-sonografia intravaginal. A taxa de implantação neste grupo foi de 17,02% (Tabela III). Vinte e três pacientes submetidas ao programa de FIV, entre 30 e 35 anos, receberam 76 embriões. Posteriormente, identificaram-sc 10 sacos gestacionais pela ultra-sonografia. A taxa de implantação neste grupo foi de 13,1% (Tabela III).
Tabela III. Taxas de implantação segundo as faixas etárias da mulher quando submetidas aos programas de FIV e ICSI
Por outro lado, quinze pacientes com mais de 35 anos receberam 50 embriões, posteriormente foram observados, à ultra-sonografia intravaginal, 2 sacos gestacionais. A taxa de implantação neste grupo foi de 4,16% (Tabela III). A análise estatística das taxas de implantação de acordo com as faixas etárias das pacientes submetidas à técnica de FIV não demonstraou significância (p >0,05).
Por outro lado, onze pacientes submetidas ao programa de ICSI com menos de 30 anos, receberam 45 embriões e produziram 5 sacos gestacionais na ultra-sonografia intravaginal. A taxa de implantação neste grupo foi de 11,1%. Um total de vinte e uma pacientes entre 30 e 35 anos recebeu 86 embriões resultantes de ICSI e, foram obtidos 8 sacos gestacionais pela ultra-sonografia. A taxa de implantação neste grupo foi de 9,7% (Tabela III). Vinte e quatro pacientes com mais de 35 anos receberam 89 embriões resultantes de ICSI e foram observados, à ultra-sonografia intravaginal, 7 sacos gestacionais. A taxa de implantação neste grupo foi de 7,8% (Tabela III).
A análise estatística das taxas de implantação de acordo com as faixas etárias das pacientes submetidas a técnica de ICSI, não demonstrou significância (p > 0,05).
Um total de trinta e nove pacientes recebeu 141 embriões resultantes de FIV, entre os quais havia pelo menos um embrião classificado como classe I ou II. Nestas pacientes, observaram-se 20 sacos gestacionais pela ultra-sonografia intravaginal resultando em taxa de implantação de 14,1%. Dez pacientes receberam 32 embriões exclusivamente classe III, IV ou V e não apresentaram gravidez.
Por outro lado, quarenta e oito pacientes receberam 190 embriões resultantes de ICSI, entre os quais havia pelo menos um embrião classificados como classe I ou II. Nesta população, observaram-se 20 sacos gestacionais pela ultra-sonografia intravaginal, resultando em taxa de implantação de 10,5%. Oito pacientes receberam 30 embriões exclusivamente da classe III, IV ou V resultantes do programa de ICSI e não apresentaram gravidez.
Discussão
A reprodução assistida sofreu grande evolução nas últimas décadas. Embora as taxas de fertilização dos diferentes procedimentos tenham alcançado níveis excelentes, as taxas de gravidez não ultrapassaram os 40%. Provavelmente, isso se deve à seletividade do processo de implantação embrionária.
O estudo da taxa de implantação nos diversos procedimentos, reflete o número de embriões que se implantam no útero. A implantação embrionária poderia ser afetada por vários fatores, entre eles a idade da paciente, a qualidade dos gametas, o tipo de procedimento para obtenção da fertilização e mesmo a qualidade embrionária.
Nesse trabalho, compararam-se as taxas de implantação entre as pacientes que foram submetidas à FIV, em que predominaram as causas femininas de infertilidade; e as submetidas à ICSI, principalmente devido a fatores masculinos. Nestes dois grupos, as diferenças entre as taxas de implantação não foram estatiscamente significativas.
Da mesma forma, as diferentes faixas etárias estudadas, nas mulheres com menos de 30 anos, de 30 a 35 anos e acima de 35 anos, não mostraram taxa de implantação estatisticamente diferentes entre elas. Mesmo a análise das faixas etárias, no mesmo procedimento (FIV ou ICSI), não mostrou diferença estatisticamente significativa, embora os números sejam bastante diferentes entre si. Isto talvez decorra do fato da amostra não ser muito grande, uma vez que vários trabalhos da literatura mostram nítida diminuição das taxas de implantação e de gestação em mulheres mais idosas, principalmente após os 35 anos (Janny et al., 1996).
A única influência notada foi a qualidade embrionária, pois as mulheres que receberam exclusivamente embriões de má qualidade (classe III, IV e V) não apresentaram gravidez. Por outro lado, fica claro que a obtenção de embriões morfologicamente adequados (classe I e II) é fundamental para o bom resultado de FIV e ICSI, uma vez que, quando as pacientes receberam pelo menos um embrião com estas características, não houve diferença da taxa de implantação nos dois procedimentos.
A hipótese inicial, de que a manipulação do oócito para introdução do espermatozóide poderia ter efeito benéfico sobre a implantação, não se confirmou neste estudo.
Menken J., Trusse J., Larsen U. - Age and infertility. Science, 233: 1389-1394, 1986.